Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica

El objetivo general del siguiente experimento es predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática de acuerdo con el grupo funcional de los pacientes mediante el cribado de su respuesta de PBM C a la activación de GPCR R mediante espectroscopia dieléctrica celular. Esto se logra mediante el cultivo de pbmc en presencia de fitohemaglutinina o PHA para expandir el número de células. La expansión de la célula se completa en un tubo, mantenido en posición inclinada.

Como segundo paso, las células se tratan con OSTEOPONTINA u OPN, que aumenta o reduce la actividad de las proteínas gastrointestinales. Dependiendo de los pacientes después del tratamiento, la suspensión celular se transfiere a la microplaca. A continuación, las células se estimulan con agonistas GI o GS GPCR para determinar los cambios de impedancia resultantes.

Los resultados proporcionan respuestas cinéticas para todos los pozos y las respuestas integradas se cuantifican en función de los cambios de impedancia. La implicación de esta técnica va mucho más allá del simple diagnóstico. Así, por primera vez, podemos detectar en una etapa temprana como pacientes sintomáticos con riesgo de desarrollar escoliosis, y ahora sabiendo quiénes desarrollarán escoliosis o en qué etapa se encuentran, podemos proporcionar nuevas terapias para tratarlos.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la exposición a rayos X, es que esta técnica permite predecir el pronóstico de la escoliosis osteópata sin necesidad de medir el covid y sin riesgo para la salud. Lo más reciente, la técnica ahora será nuestra asistente de investigación Nita Franco, Descongelación de alícuotas congeladas de células mononucleares de sangre periférica en un baño de agua a 37 grados centígrados. Con una pipeta estéril, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de medio completo y centrífuga.

Las células aspiran el sobrenadante. A continuación, suspenda suavemente el pellet de la célula en un mililitro de medio PHA, complete el volumen a 20 mililitros con el mismo medio, cubra el tubo sin apretar para permitir la entrada de aire. Incubar el tubo durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono para permitir que los linfocitos inactivos se transformen en linfoblastos que proliferan rápidamente.

Apriete completamente las tapas y granule las células por centrifugación. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Suspenda suavemente el pellet de celda en un mililitro de medio completo.

Complete el volumen a 20 mililitros con el mismo medio y tape el tubo cultivando sin apretar durante la noche para expandir el número de células. Después de dos lavados con 10 mililitros de RPMI 1640, vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 600 microlitros de RPMI 1640. Mida la concentración celular y la viabilidad utilizando un contador celular automatizado y un analizador de viabilidad.

A continuación, añada un volumen adecuado de RPMI 1640 para ajustar a una concentración de células de 1,5 veces 10 a la quinta célula por cada 20 microlitros. Transfiera 100 microlitros de la suspensión a dos tubos estériles de 1,5 mililitros de diámetro exterior. Agregue osteopontina recombinante en un tubo hasta una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.

Agregue un volumen igual de PBS al segundo tubo. Mezcle suavemente cada condición pipeteando dos veces con una pipeta estéril configurada a 100 microlitros. A continuación, agregue cinco microlitros de RPMI 1640 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, centrifugue la placa a 200 GS durante tres minutos para eliminar las burbujas de aire y transferir las células del tubo a la microplaca.

Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo una vez para asegurar una suspensión uniforme de las células. Siembra 40 microlitros de suspensión celular por pocillo en cuádruple duplicado para células no tratadas y en duplicado para células tratadas con ROPN o PBS. Deje la placa de celdas debajo de la campana estéril durante cinco minutos para permitir que las celdas descansen y se asienten uniformemente en el fondo del pocillo.

Para optimizar el efecto del cultivo de OPN, las células durante 18 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono equilibran los cultivos a temperatura ambiente durante unos 30 minutos. Mientras tanto, prepare un mililitro de somatostatina e isoproterenol de 100 micromolares en RPMI 1640. Llene la placa compuesta dispensando 20 microlitros en los pocillos adecuados.

Cubra la placa compuesta con un sello curable. Cargue las puntas de pipeta de placa y la placa compuesta en el sistema basado en CDS. Asigne un nombre a la placa en el software de instrumento basado en CDS.

Vaya a la lista de protocolos y seleccione el protocolo adecuado para iniciar el protocolo. Haga clic en Inicio. El sistema fluídico integrado añade simultáneamente los compuestos a todos los pozos.

El sistema basado en CDS recopila automáticamente los datos durante 15 minutos después de que la viabilidad celular de la edición compuesta fue comparable entre todas las muestras con valores consistentes en el rango de 86 y 96%En contraste, se observaron altas variaciones en el número de celdas. De las 32 muestras utilizadas, dos tenían un número insuficiente de células y no han sido clasificadas. Este ejemplo muestra la clasificación funcional según el grado de desequilibrio entre el IG y la señalización GI.

La evaluación del efecto de la OPN en respuesta a la estimulación gastrointestinal reveló que la OPN aumentó la respuesta en los pacientes 353 y 371. Por el contrario, la respuesta se redujo en más del 50% en los pacientes 345 y 382 y en menos del 50% en el paciente 370 tras el tratamiento con ROPN. Así, según nuestros criterios de clasificación, pudimos categorizar a los pacientes 353 y 371 en FG uno, a los pacientes 300 de 45 y 382 a FG dos y al paciente 370 en FG tres.

Paralelamente, se examinó a todos los pacientes para determinar su respuesta a la estimulación de proteínas gastrointestinales y se compararon con los sujetos de control. Como era de esperar, todos los pacientes respondieron peor que los sujetos de control. Los pacientes clasificados en el mismo grupo funcional mostraron niveles similares de respuesta máxima.

La clasificación de una gran cohorte de pacientes con SC seguidos regularmente en nuestra clínica especial en el Hospital San Justine ha revelado que los tres grupos funcionales estaban distribuidos de manera similar. Entre los casos moderados, el FG dos fue predominante entre los casos graves. Después de esperar este video, debería tener una buena comprensión de cómo clasificar al paciente en dos o tres grupos funcionales utilizando espectroscopia dieléctrica celular.