Name: Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a predecir el pronóstico de escoliosis idiopática mediante espectroscopía dieléctrica celular con PBMCs. Este ensayo no invasivo clasifica pacientes en grupos funcionales para intervenciones tempranas.

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Este trabajo fue apoyado por becas de La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, París, Francia (a Dr. Moreau), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (Grant PP2-99466 con el Dr. Moreau) y de Cuarta Dimensión Spine LLC , Nueva York, EE.UU. (Beca de investigación del Dr. Moreau).

Todo el procedimiento se lleva a cabo bajo el capó biológica estéril y todas las soluciones y equipo que entren en contacto con las células deben ser estériles. 1. Preparación de las soluciones Esenciales <ol><li> Preparar soluciones de acuerdo con la Tabla 1. </li><li> Mantener la solución salina equilibrada (BSS) a temperatura ambiente y todas las demás soluciones a 4 º C hasta el momento del uso. </li><li> Medios frío caliente a 37 ° C en el baño de agua durante unos minutos antes de usar. </li></ol> 2. Preparación y almacenamiento de PBMC <ol><li> Recoger 10 ml de sangre completa en tubos de recogida tratados con EDTA para preparar dos alícuotas de PBMC utilizando 5 ml para cada alícuota. </li><li> Transferencia de 5 ml de sangre completa de el tubo de recogida tratada con EDTA a un tubo de 50 ml. </li><li> Añadir un volumen igual de BSS y mezclar la muestra con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Colocar 3 ml de Ficoll en dos 15 ml tubos Falcon. </li><li> Capa con cuidado 4,5 mlde mezcla de sangre diluida sobre el Ficoll en cada tubo. </li><li> Deje que los tubos se apoyan para un máximo de 5 minutos para favorecer una clara separación de la sangre y de Ficoll. </li><li> Centrifugar los tubos a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente sin freno. </li><li> Retire con cuidado los tubos de la centrífuga a fin de no perturbar la estratificación. Las PBMC son visibles en la interfaz BSS / Ficoll. </li><li> Cosecha de la capa de nubes de PBMCs en la interfase de los dos tubos con una pipeta y transferir a un nuevo tubo de 50 ml. </li><li> Añadir 20 ml de medio completo. </li><li> Centrifugar el tubo a 288 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 500 l de los medios de comunicación suplementarios. </li><li> Añadir un volumen igual de medio de congelación. </li><li> Transferir la suspensión celular a un criovial. </li><li> Coloque el vial en un recipiente cryofreezing con isopropanol. </li><li> Guarde el recipiente de congelación a -80 ° C durante la noche. </li><li> Transfer las PBMC congelados alícuotas en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 3. Ensayo funcional 1. Día 1 <ol><li> Coloque alícuota de nitrógeno líquido en baño de agua a 37 ° C durante un minuto o hasta que descongelar. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de 50 ml con una pipeta estéril. </li><li> Añadir 15 ml de medio completo y girar hacia abajo las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Suspender suavemente sedimento celular en 1 ml de medio de PHA. </li><li> Completar el volumen a 20 ml con el mismo medio. </li><li> Tape el tubo sin apretar para permitir la entrada de aire. </li><li> Deje el tubo de la noche a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para permitir que los linfocitos en reposo como para transformarse en linfoblastos rápidamente proliferantes. </li></ol> 2. Día 2 <ol><li> Tome el tubo de la incubadora, atornillar los tapones por completo y hacer que giren las celdas hacia abajo a 200 xg durante 5 mina temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Suspender suavemente sedimento celular en 1 ml de medio completo. </li><li> Completar el volumen a 20 ml con el mismo medio. </li><li> Tape el tubo sin apretar para permitir la entrada de aire. </li><li> Deje el tubo durante la noche a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para expandir el número de células. </li></ol> 3. Día 3 <ol><li> Obtener el tubo fuera de la incubadora, las tapas de tornillo completamente y girar hacia abajo las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Lavar las células dos veces con 10 ml de medio RPMI-1640 por centrifugación a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 600 l de RPMI-1640. </li><li> Medir la concentración de células y la viabilidad, usando un contador de células automatizado y analizador de viabilidad. </li><li> Añadir el volumen adecuado de RPMI-1640 para ajustarse a una concentración celular de 1,5 x 10 5 cells/20 l. </li&gt; <li> Tratar las células con OPN recombinante (rOPN) o vehículo (PBS) en 1,5 ml de tubos de Eppendorf. <ol><li> Transferir 100 l de suspensión celular a dos 1,5 ml tubos Eppendorf estériles. </li><li> Añadir rOPN en un tubo a una concentración final de 0,5 g / ml. </li><li> Añadir un volumen igual de PBS en el segundo tubo. </li><li> Mezclar con cuidado cada condición por la pipeta hacia arriba y hacia abajo dos veces utilizando un conjunto de pipeta estéril a 100 l. </li></ol></li><li> Preparar la muestra pequeña de 96 pocillos de microplacas. <ol><li> Añadir 5 l de medio RPMI-1640 para cada pocillo. </li><li> Centrifugar la placa a 200 xg durante 3 minutos para eliminar las burbujas de aire. </li></ol></li><li> Seed las células no tratadas así como las células tratadas con rOPN o PBS. <ol><li> Antes de la transferencia de células a partir de tubo para microplacas, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo una vez para asegurar una suspensión uniforme de las células. </li><li> Añadir 40 l de suspensión celular por pocillo por cuadruplicado para células no tratadas, por duplicado para rOPN o PBS las células tratadas. Refer a la Figura 1 para el diseño. Este diseño permite a 12 pacientes a ensayar en la misma microplaca. </li><li> Deje la placa de la célula bajo la campana estéril durante 5 min para permitir que las células descansan y se asientan de manera uniforme a la parte inferior del pozo antes de colocar en la incubadora. </li></ol></li><li> Incubar la placa durante 18 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2 para optimizar el efecto de OPN. </li></ol> 4. Día 4 <ol><li> Ejecute el plato con compuestos. <ol><li> Tome la placa de la incubadora y se deja a temperatura ambiente durante alrededor de 30 min. </li><li> Preparar 1 ml de 100 mM de somatostatina e isoproterenol en medio RPMI-1640 mediante la adición de 10 l de solución madre (10 mM) en 990 l de medio RPMI-1640. </li><li> Llene la placa de compuesto por dispensación 20 l en pocillos apropiados como se indica en la Figura 2. </li><li> Cubrir la placa compuesto con un sello perforable precortado para evitar un cambio en la concentración del compuesto debido a la evaporación anteso durante la incubación en el sistema basado en CDS-. </li><li> Plato de carga celular, puntas de pipeta, y la placa de compuesto en el sistema basado en la CDS-. </li><li> Nombre de la placa en el software del instrumento basado CDS-. </li><li> Seleccione el protocolo apropiado. El protocolo editado para la clasificación con PBMCs se denomina &quot;células Agonist no adherentes Small Plate Sample RT 15 min. Vaya al cuadro de protocolo y seleccione este protocolo en la lista de protocolos </li><li> Iniciar el protocolo haciendo clic en &quot;Inicio&quot;. </li><li> El sistema de fluidos integrado añade simultáneamente los compuestos a todos los pocillos mediante la inyección de 5 l por pocillo para lograr una concentración final de 10 mM en un volumen total de 50 l. </li><li> El sistema basado en CDS-recoge automáticamente los datos para 15 minutos después de la adición del compuesto. </li></ol></li><li> Análisis de los datos <ol><li> Seleccione las gamas bajas y altas de las frecuencias a utilizar en el cálculo de los valores extraídos de la nocélulas adherentes. </li><li> Seleccionar corrección de deriva para corregir el cambio lineal en las mediciones de impedancia de línea de base en el tiempo. </li><li> Seleccione el filtrado de datos para reducir las variaciones en la medición de la respuesta cinética debido al ruido electrónico y la adición del compuesto. </li><li> Seleccione el método de Max-Min para el tiempo de análisis completo. </li><li> Exportar datos a Excel en virtud de la opción de formato de placa. </li><li> Calcular el delta G (Delta G) restando el promedio de magnitud de la respuesta a la estimulación Gi (RMGI) a partir de la media de la magnitud de la respuesta a la estimulación Gs (RMGS) utilizando la siguiente fórmula: Delta G = RMGI - RMGS </li><li> Calcular el porcentaje del efecto de plegado (Fe) de OPN en respuesta mediada por Gi dividiendo la media de la magnitud de la respuesta a Gi estimulación en presencia de OPN (RmGiOPN) con la media de la magnitud de la respuesta a Gi estimulación en presencia de PBS ( RmGiPBS) utilizando la siguiente fórmula: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Consulte T2 capaz de clasificar a los pacientes. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Este trabajo condujo a varias patentes sostenga por el Hospital de la Universidad Sainte-Justine y muchos otros están pendientes en varios países. Cuarta Dimensión Spine LLC es el licenciatario exclusivo del Hospital Universitario de Sainte-Justine.

Hemos descrito un procedimiento detallado de una prueba basada en células pronóstico de la escoliosis idiopática, que es aplicable a las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) recién aisladas o conservado congelado hasta por un año en el nitrógeno líquido. Dado que el uso PBMCs aisladas recientemente es engorroso al probar gran número de personas, el procedimiento se presentó con PBMC congelados que ofrecen una alternativa más práctica en el ámbito clínico. Sin embargo, se encontraron problemas con la aglutinación de células después de la descongelación cuando se utilizaron inicialmente CMSP congeladas, lo que lleva a veces a la variabilidad inter-ensayo. Para maximizar la reproducibilidad del ensayo, se recomienda evitar el ciclo de congelación-descongelación y el uso de la muestra congelada sólo una vez. El procedimiento es muy sencillo, lo que permite una detección precisa de la función de la proteína Gi defectuoso en un corto período de tiempo. Usando este procedimiento, los niños asintomáticos y escolióticas se pueden clasificar fácilmente para predecir mejor su evolución clínica sin ningún peligro para su salud. Hobargo, cuando se realiza la clasificación de acuerdo con el grado de máxima respuesta a Gi estimulación en relación con los sujetos control sanos 12, debe cumplirse una serie de requisitos para los sujetos de control. De hecho, con el fin de tener una cohorte de comparación adecuada, los sujetos de control debe ser la edad y acompañado de género, no puede estar en cualquier tipo de medicación, y proporcionar información privada, como la historia pasado individual / familiar médica. Estos requisitos pueden constituir un obstáculo importante para el reclutamiento de los sujetos de control. Por lo tanto, la realización de clasificación mediante el examen del grado de desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs proteína de estimulación en el mismo individuo es ideal para eliminar la necesidad de utilizar los sujetos de control. El uso del sistema basado en CDS-para llevar a cabo esta prueba de pronóstico es significativa en términos de proporcionar simultáneamente Gi-y las respuestas celulares mediadas por Gs en el mismo ensayo. Aunque muchos pacientes se pueden clasificar sin amambigüedad usando el rango dinámico fijo para este ensayo, un pequeño número de pacientes se exhibir valores en el límite de rangos, como se ilustra por los resultados del presente informe. Para discriminar estos individuos, hemos introducido la evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación Gi mediante la demostración de que la OPN induce un efecto diferencial sobre la respuesta celular mediada por Gi entre los tres grupos funcionales. De hecho, encontramos que en presencia de OPN, respuesta a Gi de estimulación aumenta en FG1, mientras que disminuye en FG2 y GD3, en un grado mayor en FG2. A pesar de los altos costos de OPN, el uso de esta quimiocina es esencial para distinguir los casos ambiguos, y por lo tanto mejorar la precisión de nuestro ensayo de clasificación. Sin embargo, este ensayo tiene la desventaja de que se requiere un mínimo de 1,5 x 10 5 células por pocillo para observar la respuesta celular con el sistema basado CDS-bajo nuestras condiciones experimentales. Ciertas muestras de los pacientes no tienen un número suficiente decélulas para ser probados. En este caso, es necesario recordar a los pacientes durante la extracción de sangre adicional, que puede ser preocupante para las familias y frustrante para el personal médico y de laboratorio. Se planean estudios futuros en nuestro laboratorio para abordar esta cuestión. Sin embargo, el protocolo actual se basa en métodos simples y probadas para preparar células mientras que la prueba se automatiza utilizando un sistema libre de etiquetas validado 13, 14 para monitorear las respuestas de las células. La plataforma de pruebas es relativamente barato en comparación con la plataforma genética disponible para el pronóstico de otras enfermedades. Además, el costo de todos los materiales desechables, incluyendo los tubos de recogida de sangre, consejos, el electrodo especial microplacas y cónica y tubos Eppendorf, no es muy caro y se estima en menos de 3.000 dólares para completar una prueba de aproximadamente mil pacientes. Aunque esta estimación no incluye los costos de mano de obra para la preparación de muestrasy la realización de la prueba, esta prueba sigue siendo considerablemente más asequible que las plataformas de secuenciación de próxima generación. Digno de mención, es no sólo la comparación de costos a las plataformas genéticas, pero más específicamente relacionados con el campo de la AIS, es decir los costos asociados a las imágenes radiológicas. Hoy en día, más de un millón de niños en los EE.UU. y alrededor de 100 mil niños en Canadá son diagnosticados con escoliosis idiopática, y el costo total de diagnóstico y seguimiento de los niños con escoliosis por exposición a los rayos X es de más de 2,5 mil millones de dólares anuales en América del Norte. Por lo tanto, se esperaría que nuestro procedimiento de ensayo basado en células para ser adecuado para la detección y seguimiento de los niños con escoliosis idiopática sin riesgo para la salud y a un menor coste de rutina.

Escoliosis idiopática es una deformación en la columna de causa desconocida que generalmente se define como una curvatura lateral mayor de 10 grados acompañados por una rotación vertebral 1. La condición afecta a un 4% de la población pediátrica y se diagnostica con mayor frecuencia entre las edades de 9 a 13 años 2,3,4. El diagnóstico es fundamentalmente de la exclusión y se hace sólo después de descartar otras causas de la deformidad de la columna, como la malformación vertebral, neuromusculares o trastornos sindrómicos. Tradicionalmente, la asimetría trunkal es revelada por Adams prueba de flexión hacia delante y se mide con scoliometer durante el examen físico 5. El diagnóstico puede ser confirmado por la observación radiográfica de la curva y la medición del ángulo utilizando el método de Cobb 6. Una vez diagnosticada, la principal preocupación para los médicos en el manejo de los niños con escoliosis es si la curva va a progresar. De hecho, la progresión de la curva es a menudo impredecible yes observada entre las niñas con más frecuencia que en los niños 7. Si no se trata, la curva puede progresar de manera espectacular, creando una deformidad física significativa e incluso problemas cardiopulmonares. Estas manifestaciones se convierten en peligro la vida cuando la curva es superior a 70 ° 8,9. Las opciones actuales de tratamiento para prevenir o detener la progresión de la curva se incluyen refuerzos y cirugía. En general, se recomienda refuerzo de curvas entre 25-40 °, mientras que la cirugía se reserva para las curvas de más de 45 ° o que no responden al uso de órtesis. Aproximadamente, el 10% de los niños diagnosticados con escoliosis idiopática tienen progresión de la curva que requiere cirugía correctiva 10. En la actualidad, no existe un método probado o prueba disponible para identificar este tipo de pacientes. En consecuencia, todos los niños diagnosticados son sometidos a múltiples radiografías durante varios años, por lo general hasta que alcanzan la madurez esquelética. Se estima que los pacientes típicos con escoliosis tendránaproximadamente 22 exámenes radiológicos más de un período de 3 años 11. Debido al riesgo potencial de múltiples exámenes radiográficos, los enfoques alternativos que podrían permitir realizar el pronóstico de la escoliosis idiopática, sin exponer a los niños a la radiación ionizante son muy deseables. Con la intención de satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado previamente un ensayo de cribado basados ​​en la célula como una prueba de pronóstico para identificar cuanto antes los niños asintomáticos con riesgo de desarrollar escoliosis idiopática. La prueba permite predecir el resultado clínico, tanto en niños asintomáticos y afectadas por el análisis del estado funcional de las proteínas Gi y clasificar a los niños en tres grupos funcionales (FG1, FG2 y FG3) de acuerdo con el grado de la respuesta máxima a la estimulación de proteínas Gi 12 tal como se mide por CDS sistema basado en. Este sistema se utiliza en gran medida para evaluar la transducción de señales a través de proteínas G en diversos tipos de células 13,14,15,16. Se da información sobre larespuesta total integrada de las células a los estímulos externos mediante la medición de cambios en la impedancia después de la activación de los receptores de la superficie celular. Las células se sembraron en microplacas que contienen electrodos en la parte inferior de los pocillos y el sistema aplica un pequeño voltaje que inducen corrientes extracelulares y transcelular. Después de la inyección del compuesto en el pozo, receptores de la superficie celular son estimulados y se producen los eventos de transducción de señal, dando lugar a cambios celulares que afectan el flujo de las corrientes extracelulares y transcelular, y por lo tanto afectan a la magnitud medida. Con este enfoque, los pacientes y los niños con escoliosis más en riesgo de desarrollar escoliosis son menos sensibles a la proteína Gi estimulación en comparación con los controles sanos, y la clasificación se basa en el porcentaje de grado de reducción en relación con el grupo control. Los rangos de clasificación se fijan entre 10 y 40% para FG3, 40 y 60% para FG2, y 60 y 90% para FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Más recientemente, se ha modificado este enfoque mediante la demostración de que los tres grupos funcionales se distinguen claramente de acuerdo al perfil de un desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs estimulación. De hecho, encontramos que la respuesta a la estimulación Gi predominó en FG3, mientras que no se observó desequilibrio aparente en FG2. Por el contrario, FG1 exhibió predominio de la respuesta a la estimulación Gs. Además, hemos proporcionado la evidencia de que los pacientes pertenecientes a FG2 están en mayor riesgo de progresar hasta el punto de necesitar la cirugía 17. La precisión de esta prueba de clasificación Además, se ha mejorado mediante la demostración de un efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos funcionales. Aquí documentamos los pasos detallados de los procedimientos experimentales y analíticas de la prueba de funcionamiento en la actualidad se realiza en nuestro laboratorio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent, Inc</td><td>350-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Therno Scientific Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Osteopontina humana recombinante</td><td>R& D Systems, Inc</td><td>1433-OP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatina</td><td>Tocris</td><td>1157</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Tocris</td><td>1743</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent, Inc</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-06-451</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles Eppendorf</td><td>Ultident</td><td>24-MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml cónicos tubos</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey pequeña muestra microplaca de 96 W</td><td>Molecular Devices</td><td>1026496</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey tips</td><td>Cybio</td><td>OL3800-25-559N</td><td></td></tr><tr><td>Juntas perforables precortadas</td><td>Excel Scientific, Inc</td><td>XP-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vicell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td>Clase II</td></tr><tr><td>Almacenamiento de nitrógeno líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY5093570</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR International</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico estándar</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMIL</td> LED <td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>Thermo Scientific</td><td>51019557</td><td>5% de CO2 a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrífuga de baja velocidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004364</td><td></td></tr><tr><td>sistema Cellkey</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>1019185</td><td>Instrumento basado en CDS</td></tr></tbody></table>

protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del uso de celular espectroscopía dieléctrica

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Este protocolo se detalla el procedimiento experimental y de análisis para un ensayo basado en células desarrollado en nuestro laboratorio como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática en niños asintomáticos y afectadas. El ensayo consiste en la evaluación del estado funcional de las proteínas Gi y GS en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) por espectroscopía dieléctrica celular (CDS), utilizando un instrumento automatizado basado CDS-, y la clasificación de los niños en tres grupos funcionales (FG1 , GD2, GD3) con respecto al perfil de desequilibrio entre el grado de respuesta a Gi y Gs proteínas estimulación. La clasificación se ve confirmado por el efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos y la severa progresión de la enfermedad es referenciado por FG2. Aproximadamente, se requiere un volumen de 10 ml de sangre para extraer las PBMC por gradiente de Ficoll-y las células entonces se almacenan en nitrógeno líquido. El número adecuado de PBMC para realizar el ensayo se obtiene después de dos días de cultivo celular. Esencialmente, las células se incubaron primero con phytohemmaglutinin (PHA). Después de 24 h de incubación, el medio se sustituye por un medio de cultivo con PHA libre para un 24 h adicionales antes de la siembra de células y el tratamiento de OPN. Después las células se espectroscópicamente examinados para sus respuestas a la somatostatina y el isoproterenol, que activan respectivamente las proteínas Gi y GS a través de sus receptores afines. Tanto la somatostatina y el isoproterenol se inyectan simultáneamente con un sistema integrado de fluidos y las respuestas de las células son monitoreados durante 15 min. El ensayo se puede realizar con PBMC frescas o congeladas y el procedimiento se completa dentro de 4 días.

La viabilidad celular fue comparable entre todas las muestras con valores consistentes en el rango de 86 y 96%. En contraste, se observaron grandes variaciones en el número de células entre las muestras (Tabla 3). De las 32 muestras utilizadas, dos tenían insuficiencia del número de células y no se han clasificado. Un ejemplo de los resultados de la clasificación funcional de acuerdo con el grado de desequilibrio entre Gi y de señalización Gs se mostró en la Figura 3. El eje vertical de esta cifra se divide en tres secciones que delimitan los grupos funcionales con rangos dinámicos establecidos como&gt; 10 para FG3, entre 10 y -10 para FG2, y finalmente &lt;-10 para FG1. Entre 30 pacientes analizados aquí, 14, 6, y 5 pacientes fueron claramente clasifican en GD3, GD2, y FG1, respectivamente, mientras que cinco pacientes, en particular 345, 353, 370, 371, y 382, ​​estaban en el límite de rangos. La evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación Gi había puesto de manifiesto que la OPN aumentó la respuesta en PAtes 353 y 371. En contraste, la respuesta se redujo en más de 50% en los pacientes 345 y 382 y por menos de 50% en paciente 370 después del tratamiento rOPN. Así, de acuerdo con nuestros criterios de clasificación (Tabla 2), hemos sido capaces de categorizar a los pacientes 353 y 371 en FG1, los pacientes 345 y 382 en FG2, y el paciente 370 en FG3. Paralelamente, todos los pacientes fueron seleccionados por su respuesta a la proteína Gi estimulación y comparados con los sujetos control. Como era de esperar, todos los pacientes fueron menos sensibles que los sujetos de control, y los pacientes clasificados en el mismo grupo funcional por nuestro nuevo procedimiento mostraron niveles similares de la respuesta máxima (Figura 5). Por otra parte, la disparidad entre los pacientes de cada grupo funcional fue consistente con nuestra gama clásica de clasificación 12, validando nuestro nuevo procedimiento. La clasificación de una gran cohorte de pacientes con escoliosis seguidos regularmente en nuestra clínica especial en Sainte-Justine Hospital ha puesto de manifiesto que los tresgrupos funcionales se distribuyeron de manera similar entre los casos moderados, mientras que el FG2 era predominante entre los casos severos (Figura 6), la identificación de pacientes clasificados en este grupo funcional como un mayor riesgo de progresión grave de la enfermedad y lo que indica que esta prueba de clasificación puede ser útil en el el pronóstico de la escoliosis idiopática. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solución A </td><td> Anhidro D-glucosa </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl2 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solución B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solución salina equilibrada (BSS) </td><td> Solución A </td><td> 1 volumen </td></tr><tr><td> Solución B </td><td> 9 volumen </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; multimedia completo </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Medios complementarios </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Medios de congelación </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Medios PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Fitohemaglutinina </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Esencialsoluciones. <table border="1"><tbody><tr><td> Rangos dinámicos con Delta G </td><td> Grupos Funcionales </td><td> Rangos dinámicos con Fe </td></tr><tr><td> Delta G &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;Delta G &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> Delta G&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Categorización de los grupos funcionales de acuerdo con rangos dinámicos establecidos con Delta G y Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pacientes </td><td> Viabilidad (%) </td><td> La concentración celular (× 10 6 / ml) </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. El porcentaje de viabilidad y la concentración de células como se determina usando un contador de células automatizado y analizador de viabilidad. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño para la siembra de células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figura 2.Diseño para dispensar compuestos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figura 3. Rango dinámico de la clasificación funcional utilizando el sistema CDS-. Gráfico ilustra los valores del grado de desequilibrio entre las respuestas a Gi y Gs estimulación obtenida en PBMCs de pacientes con escoliosis idiopática. Los valores se midieron por el sistema basado en CDS-en respuesta a 10 mM de somatostatina e isoproterenol. Cada punto representa el Delta G de ambas respuestas en duplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figura 4. Efecto de rOPN en respuesta a la estimulación Gi en PBMCs. Las células se privaron de suero durante 18 horas en presencia o ausencia de 0,5 g / ml rOPN y después se estimularon con 10<html> 56; M de la somatostatina para iniciar la respuesta celular mediada por Gi. Los datos en el gráfico se generaron a partir de impedancia mínima y máxima corresponden a la media de la respuesta por duplicado. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figura 5. El estado funcional de las proteínas Gi en PBMCs de control y los sujetos scoliostic. PBMCs de sujetos de control y pacientes con escoliosis fueron expuestas a concentraciones crecientes de somatostatina para estimular las proteínas Gi a través de receptores de somatostatina endógena. La respuesta celular se midió por el sistema basado en CDS-como se describe en la sección de procedimiento. Se generaron curvas de impedancia máxima-mínima. Cada curva representa la regresión no lineal. Los datos se normalizaron a la respuesta máxima en células procedentes de sujetos de control y cada punto corresponde a la media de la respuesta por duplicado./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figura 6. Distribución de los grupos funcionales entre las diferentes fases de la escoliosis. Un gran cohorte de pacientes con escoliosis con 794 curvaturas moderadas (entre 10-44 °) y 162 casos graves (curvatura mayor de 45 º), seguido regularmente en Hospital Sainte-Justine, fueron clasificados de acuerdo a su grado de desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs estimulación. Las respuestas se midieron por el sistema basado en CDS-en respuesta a 10 mM de somatostatina e isoproterenol.

Un protocolo estructurado se presenta para un ensayo basado en células como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática usando espectroscopía dieléctrica celular (CDS). El ensayo puede realizarse con células mononucleares de sangre periférica frescas o congeladas (PBMCs) y el procedimiento se completa dentro de 4 días.

Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática según la agrupación funcional de los pacientes mediante el análisis de la respuesta de los PBMC a la activación de R GPCR utilizando espectroscopía dieléctrica celular. Esto se logra cultivando los PBMC en presencia de fitohemaglutinina o PHA para aumentar el número de células. La expansión celular se realiza en un tubo, mantenido en posición inclinada.Como segundo paso, las células se tratan con OSTEOPONTINA o OPN, lo que aumenta o reduce la actividad de la proteína GI. Dependiendo de los pacientes tras el tratamiento, la suspensión celular se transfiere a la microplaca. A continuación, las células se estimulan con agonistas del GI o GS del receptor acoplado a proteína G (GPCR) para determinar los cambios de impedancia resultantes.Los resultados proporcionan respuestas cinéticas para todos los pocillos y las respuestas integradas se cuantifican luego en función de los cambios de impedancia. La implicación de esta técnica va mucho más allá del simple diagnóstico. Así, por primera vez, podemos detectar en una etapa temprana a pacientes sintomáticos con riesgo de desarrollar escoliosis, y al saber ahora quiénes desarrollarán escoliosis o en qué etapa se encuentran, podemos ofrecer nuevas terapias para tratarlos.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la exposición a rayos X es que permite predecir la progno osteopatía escoliosis sin necesidad de medir covid ni conlleva riesgo para la salud. Lo más reciente, la técnica ahora será nuestra asistente de investigación Nita Franco, descongelación de una alícuota congelada de células mononucleares de sangre periférica en un baño de agua a 37 grados Celsius. Mediante una pipeta estéril, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de medio completo y centrifugue.Las células aspiran el sobrenadante. Luego, suspenda suavemente el botón celular en un mililitro de medio con PHA y complete el volumen hasta 20 mililitros con el mismo medio, tapando el tubo de forma floja para permitir la entrada de aire. Incube el tubo durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono para permitir que los linfocitos en reposo se transformen en linfoblastos de rápida proliferación.Aprete completamente las tapas y haga un pellet de las células por centrifugación. Retire el sobrenadante por aspiración. Suspender suavemente el pellet celular en un mililitro de medio completo.Complete el volumen hasta 20 mililitros con el mismo medio y tape el tubo ligeramente para cultivar durante la noche con el fin de ampliar el número de células. Después de dos lavados con 10 mililitros de RPMI 1640, resuspenda suavemente el pellet celular en 600 microlitros de RPMI 1640. Mida la concentración y viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado y un analizador de viabilidad.Luego, agregue un volumen adecuado de RPMI 1640 para ajustar la concentración celular a 1,5 veces 10 a la quinta células por 20 microlitros. Transfiera 100 microlitros de la suspensión a dos tubos estériles de 1,5 mililitro con tapa de rosca. Añada osteopontina recombinante en uno de los tubos hasta una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.Agregue un volumen igual de PBS al segundo tubo. Mezcle suavemente cada condición pipeteando dos veces con una pipeta estéril ajustada a 100 microlitros. A continuación, agregue cinco microlitros de RPMI 1640 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y centrifugue la placa a 200 ×g durante tres minutos para eliminar cualquier burbuja de aire y transferir las células del tubo a la microplaca.Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo una vez para asegurar una suspensión uniforme de células. Siembre 40 microlitros de suspensión celular por pocillo en cuádruple duplicado para células no tratadas y en duplicado para células tratadas con ROPN o PBS. Deje la placa celular bajo la campana estéril durante cinco minutos para permitir que las células reposen y se asienten uniformemente en el fondo del pocillo.Para optimizar el efecto del cultivo de OPN, incube las células durante 18 horas a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono y equilibre los cultivos a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Mientras tanto, prepare un mililitro de somatostatina e isoproterenol de 100 micromolar en RPMI 1640. Llene la placa de compuestos dispensando 20 microlitros en los pozos adecuados.Cubra la placa de compuestos con un sello curable. Coloque las puntas de pipeta y la placa de compuestos en el sistema basado en CDS. Asigne un nombre a la placa en el software del instrumento basado en CDS.Vaya a la lista de protocolos y seleccione el protocolo adecuado para iniciarlo. Haga clic en iniciar. El sistema fluidico integrado añade simultáneamente los compuestos a todas las pocillos.El sistema basado en CDS recopila automáticamente los datos durante 15 minutos tras la adición del compuesto; la viabilidad celular fue comparable entre todas las muestras, con valores consistentes en el rango de 86 a 96 %. En contraste, se observaron grandes variaciones en el número de células. Entre las muestras de las 32 utilizadas, dos presentaban un número insuficiente de células y no fueron clasificadas. Este ejemplo muestra la clasificación funcional según el grado de desequilibrio entre la señalización GI y GI.La evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación GI reveló que OPN aumentó la respuesta en los pacientes 353 y 371. En contraste, la respuesta se redujo en más del 50 % en los pacientes 345 y 382 y en menos del 50 % en el paciente 370 tras el tratamiento con ROPN. Por tanto, según nuestros criterios de clasificación, pudimos categorizar a los pacientes 353 y 371 en FG uno, a los pacientes 345 y 382 en FG dos y al paciente 370 en FG tres.Paralelamente, se analizó a todos los pacientes para evaluar su respuesta a la estimulación con proteínas del tracto gastrointestinal y se comparó con sujetos control. Como era de esperar, todos los pacientes fueron menos responsivos que los sujetos control. Los pacientes clasificados en el mismo grupo funcional mostraron niveles similares de respuesta máxima.La clasificación de una gran cohorte de pacientes con EC seguidos regularmente en nuestra clínica especial del Hospital San Justine ha revelado que los tres grupos funcionales presentaban una distribución similar. Entre los casos moderados, el GF dos fue predominante en los casos graves. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo clasificar a los pacientes en dos o tres grupos funcionales utilizando espectroscopía dieléctrica celular.

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Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica (Video) | JoVE Journal

Protocolo de ensayo basado en células para la predicción pronóstica de la escoliosis idiopática del Uso de Celular Espectroscopía Dieléctrica

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