Pruebas de susceptibilidad a antibióticos inducidas por el estrés en un chip

El objetivo general del siguiente experimento es determinar rápidamente la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos de interés. Esto se logra inmovilizando primero las bacterias en fase logarítmica al fondo de un canal microfluídico. En el segundo paso, los medios que contienen el antibiótico y una tinción fluorescente muerta viva se empujan a través del canal a un flujo alto, estresando a las bacterias y activando sus vías bioquímicas dirigidas a los antibióticos.

Las imágenes de contraste y fluorescencia de la siguiente fase se recogen automáticamente cada dos minutos durante una hora para controlar la viabilidad bacteriana, los porcentajes de muerte bacteriana normalizados se calculan a partir de las imágenes adquiridas en cada punto temporal del experimento. En última instancia, el fenotipo de susceptibilidad a los antibióticos de las bacterias se determina a partir de un aumento en el porcentaje de muerte celular normalizado a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de prueba de susceptibilidad fenotípica existentes, como el caldo, la dilución o el microcultivo, es que nuestro método no requiere el seguimiento de la división bacteriana.

Más bien, podemos acceder a su perfil de susceptibilidad directamente desde la pequeña población existente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de infecciones bacterianas resistentes, ya que el método es rápido, se puede multiplexar y automatizar fácilmente. Para crear la capa de PDMS, comience desgasificando una mezcla viscosa de PDMS recién preparada en una cámara de vacío a temperatura ambiente después de una hora, use una escala para llenar el molde de aluminio con una masa predefinida de mezcla de DGA PDMS. Vierta el PDMS lentamente sobre el centro del molde, teniendo cuidado de mantener el molde nivelado y los pasadores descubiertos.

Cura el PDMS durante la noche en un horno a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, suelte la placa superior del molde y retire con cuidado el PDMS curado del molde para ensamblar la celda de flujo. Primero, coloque la ventana de vidrio en el bolsillo de la celda de flujo.

A continuación, coloque una corredera de vidrio recubierta sobre la ventana de vidrio dentro del bolsillo de la celda de flujo con el lado activo hacia arriba. La capa PDMS recién creada con los canales hacia abajo en la parte superior, de modo que las entradas de canal se alinean con los orificios pasantes de la placa metálica. Empuje suavemente el aire hacia afuera entre las capas y luego voltee el conjunto de corredera de vidrio PDMS para que el PDMS quede frente a la ventana de vidrio.

Superponga las entradas del canal PDMS con los orificios pasantes de la placa metálica y, a continuación, coloque la placa de presión en la parte superior y apriete los tornillos. Ahora coloque la celda de flujo ensamblada bajo el microscopio, ajuste el aumento del microscopio a 60x y prealinee las posiciones de los canales para preparar las bacterias de la fase logarítmica para cargarlas en la celda de flujo mezcladas 50 microlitros de la colonia bacteriana cultivada durante la noche de interés en 50 mililitros de caldo MH dos frescos. Incubar durante tres horas con agitación a 250 RPM y 37 grados Celsius después de la centrífuga del subcultivo 10 mililitros del cultivo durante dos minutos a 1, 650 veces G y temperatura ambiente.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio MH dos frescos. A continuación, conecte un trozo corto de tubo a una jeringa de un mililitro y enjuague el tubo con un mililitro de medio, dejando una pequeña cantidad de medio en el tubo para evitar burbujas de aire al extraer la suspensión bacteriana. A continuación, cargue 0,7 mililitros de las bacterias en la jeringa y llene dos canales de la celda de flujo con el cultivo de células bacterianas.

La transparencia del canal cambia a medida que se llena de bacterias. A continuación, incube la celda de flujo durante 45 minutos a 37 grados centígrados para permitir que las bacterias se adhieran a la superficie del portaobjetos. Preparar las soluciones para el experimento.

Primero, llene dos jeringas de 60 mililitros con solución de control recién preparada y dos jeringas de 60 mililitros con solución antibiótica recién preparada. Agite las jeringas para eliminar las burbujas de aire y luego conecte el tubo de entrada empujando las soluciones respectivas a través del extremo del tubo. Mantenga las soluciones envueltas en papel de aluminio para evitar la degradación de los reactivos inducida por la luz.

Ahora monte las jeringas con solución experimental en la bomba, una a la vez. Apriete sus émbolos según sea necesario para encajarlos en la bomba. Bloquee las jeringas en su lugar con la barra transversal de sujeción de la jeringa.

Ajuste la velocidad de la bomba a un mililitro por minuto y el volumen de la bomba a 60 mililitros y enjuague la bomba hasta que se vea un flujo de líquido constante en todas las jeringas. Ahora comience el experimento retirando la celda de flujo de la incubadora y montándola en la platina del microscopio prealineado. A continuación, conecte un tubo de entrada que proviene de una jeringa y un tubo de salida que va a una botella de desecho a cada uno de los canales de la celda de flujo.

En este punto, el experimento está completamente configurado y listo para comenzar. Establezca el tiempo de adquisición de contraste de fase en 10 milisegundos y el tiempo de adquisición de fluorescencia en 1600 milisegundos y, a continuación, obtenga imágenes de contraste de fase y fluorescencia para cada posición antes de iniciar el flujo. Tenga en cuenta que antes del inicio de la imagen de flujo, es posible que no se pueda lograr enfocar el fondo del canal debido a la alta densidad de bacterias cargadas dentro del canal.

Ahora inicie el flujo de líquido. Compruebe inmediatamente que el microscopio está enfocado en la parte inferior de los canales. A continuación, tome imágenes de contraste de fase y fluorescencia de las áreas objetivo en el primer minuto de flujo.

Adquiera imágenes cada dos minutos después del primer conjunto de imágenes hasta que se hayan producido 60 minutos de flujo. Reenfocando según sea necesario para garantizar que el experimento se desarrolla correctamente, se pueden examinar los datos adquiridos de contraste de fase y fluorescencia. En esta muestra de datos, una cepa susceptible se cargó en los canales uno y dos, mientras que una deformación de resistencia se cargó en los canales tres y cuatro.

Al final del experimento, ejecute un ciclo de limpieza con aplicación secuencial de lejía y agua. Llene cuatro jeringas de 20 mililitros con 10 mililitros de una solución de lejía al 10% y cuatro jeringas de 60 mililitros con agua desionizada. Después de burbujear, conecte las jeringas llenas de lejía a la celda de flujo y ajuste la velocidad de la bomba a un mililitro por minuto y el volumen de la bomba a tres mililitros.

Haga funcionar la bomba durante tres minutos, controle la limpieza del canal en la pantalla. Después de tres minutos, reemplace las jeringas de lejía con jeringas de agua y deje funcionar durante 30 minutos a un mililitro por minuto. Por último, cuente el número de bacterias en cada imagen utilizando un software de procesamiento de imágenes.

Calcule el porcentaje normalizado de muerte de células bacterianas en función del tiempo utilizando esta fórmula, donde NF es igual al número de bacterias muertas contadas en el recuento de imágenes de fluorescencia. Y NP es igual al número total de bacterias determinado a partir de la imagen de contraste de fase. Las imágenes que se muestran aquí ilustran la respuesta dependiente del tiempo de una cepa susceptible de Staphylococcus aria a la oxacilina dentro de una celda de flujo microfluídica.

Estos cuadrantes muestran imágenes de contraste de fase adquiridas un minuto después de comenzar el experimento y a una hora con las imágenes de fluorescencia correspondientes que se muestran aquí. Al final del experimento se observa un aumento significativo en el número de bacterias fluorescentes, lo que indica la muerte celular dentro del canal y la susceptibilidad de la cepa al antibiótico debido a la falta de uniformidad estocástica de los portaobjetos individuales recubiertos con epoxi. Puede haber pérdida de células bacterianas a lo largo del experimento bajo un estrés puro sostenido para explicar esta variación, cada imagen de fluorescencia de una población de células muertas se normaliza con la imagen de contraste de fase coadquirida que da la población total de células dentro de un segundo del mismo punto de tiempo.

Estas ampliaciones demuestran que el algoritmo de recuento tiene más éxito a la hora de contar con precisión las bacterias individuales en las imágenes de fluorescencia que en las imágenes de contraste de fase densamente pobladas. La tinción de células muertas proporciona un alto contraste de fluorescencia para las bacterias muertas individuales. Dado que el número de bacterias fluorescentes rara vez supera el 5% del número total, cada bacteria es muy brillante en comparación con el fondo.

Por lo tanto, las bacterias fluorescentes se pueden contar fácilmente con un alto grado de precisión. Por ejemplo, en este experimento, de las 5.828 bacterias totales detectadas, resaltadas en rojo, se determinó que 174 estaban muertas aquí. Los datos normalizados de MSSA y Mr.RSA para tres experimentos diferentes se ilustran como se esperaba para las cepas resistentes, la muerte celular normalizada es de baja magnitud, inferior al 0,5% y no cambia en el transcurso del experimento.

Sin embargo, las cepas susceptibles muestran un aumento constante en la muerte celular y un valor más alto superior al 1% al final del experimento. El inicio de la muerte celular para las cepas susceptibles varía ligeramente entre experimentos, pero generalmente ocurre entre 10 y 30 minutos. No olvide que trabajar con patógenos resistentes a los antibióticos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como una técnica séptica al realizar este procedimiento.

Esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren cómo responden las bacterias al estrés e impactará en el desarrollo de nuevos diagnósticos rápidos y el descubrimiento de nuevos fármacos.