Name: En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprende a reprogramar células somáticas hacia pluripotencia in vivo mediante inyección hidrodinámica de plásmidos con factores Yamanaka en hepatocitos de ratón. Este método valida la seguridad y eficiencia de la reprogramación celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC, Swindon, Reino Unido) y los programas FP-7 de la Comisión Europea NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) y ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY contó con el apoyo de una beca de doctorado a tiempo completo del Ministerio de Educación (Turquía) e IL reconoce el apoyo parcial del British Council y la Fundación CAIXA (España). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

1. Reprogramación in vivo de tejido hepático por HTV Administración de ADNp
<ol>
	<li>Permita que los ratones hembra Balb/C, de 6 semanas de edad, se aclimaten a la instalación de animales durante una semana antes de realizar cualquier procedimiento.</li>
	<li>Preparar solución salina al 0,9% en agua destilada y filtrar a través de un microfiltro de 0,22 μm.</li>
	<li>Prepare una solución con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de ADN plasmídico pCX-cMyc en 1,5 ml de solución salina al 0,9% por ratón. nota: El volumen total de inyección debe estar entre el 8 y el 10% del peso corporal total. 
	Nota: antes de la inyección, mantenga los ratones en una cámara de calentamiento a 37 °C hasta que las venas de la cola puedan visualizarse fácilmente y parezcan dilatadas.</li>
	<li>Inducir la anestesia con isoflurano antes (en la cámara de calentamiento) y durante la inyección (con una máscara anestésica).</li>
	<li>Administrar la solución de ADNp o el control salino con una jeringa de 27 G mediante inyección de HTV. Nota: para que la transfección sea exitosa, el volumen total debe inyectarse en no más de 5-7 segundos.</li>
	<li>Vigilar que los animales se recuperen adecuadamente de la inyección.</li>
</ol>
2. Perfusión hepática y aislamiento de hepactocitos primarios para estudios qRT-PCR
<ol>
	<li>En diferentes momentos, incluidos 2, 4, 8, 12 y 24 días después de la inyección de HTV, induzca anestesia profunda con isoflurano.</li>
	<li>Rocíe etanol al 70% en el abdomen del animal, haga una incisión a través de la piel en la línea media ventral con tijeras quirúrgicas y diseccione la capa muscular abdominal para exponer las vísceras.</li>
	<li>Corta el diafragma para exponer la cavidad torácica con unas tijeras y sujeta la vena cava con pinzas de bloqueo.</li>
	<li>Desplazar las vísceras hacia la derecha y los lóbulos hepáticos de forma que tanto la cava inferior como la vena porta sean fácilmente accesibles.</li>
	<li>Cánula de la vena cava inferior con un catéter de 22 G y cortar la vena porta para evitar el exceso de presión.</li>
	<li>Iniciar la perfusión con 10 ml de tampón HBSS (libre de Ca2+ y Mg2+, con bicarbonato), precalentado a 37 °C. Perfundir lentamente el tampón con una jeringa de 10 ml, hasta que el hígado se blanquee (3 min).</li>
	<li>Continuar la perfusión con Liver Digest Medium, precalentado a 37 °C, a un caudal de 0,6 ml/min (durante 15 min) hasta que el hígado se hinche y se afloje. nota: La digestión y perfusión excesivas pueden dañar los hepatocitos o las células reprogramadas.</li>
	<li>Continúe el experimento a 4 °C.</li>
	<li>Extraer el hígado con pinzas después de cortar los ligamentos falciformes y coronarios y lavarlo con Hepatocyte Wash Medium, mientras lo pasa por un colador de células de 100 μm para obtener una suspensión celular.</li>
	<li>Recoja la suspensión celular en tubos de 50 ml y ajuste el volumen a 15 ml con el medio de lavado de hepatocitos.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 50 g durante 4 min. Mantener la temperatura a 4 °C. Deseche el sobrenadante (que contiene Kupffer y células epiteliales) y vuelva a suspender el pellet celular (que contiene los hepatocitos) en 10 ml de medio de lavado de hepatocitos. nota: El pellet celular debe resuspenderse con mucho cuidado, los hepatocitos son células muy frágiles.</li>
	<li>Repita el procedimiento de centrifugación un total de tres veces y vuelva a suspender el pellet final en 10 ml de medio de lavado de hepatocitos.</li>
	<li>Calcule el número de células utilizando un microscopio óptico y un hemocitómetro.</li>
	<li>Preparar alícuotas de 2 x 106 células, centrifugar a 300 x g para recuperar todas las células y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>En este punto, el pellet celular puede congelarse y mantenerse a -20 °C hasta su posterior procesamiento o utilizarse inmediatamente para la extracción de ARN.</li>
</ol>
3. Estudio de la expresión génica de hepatocitos aislados para la regulación positiva de genes pluripotentes
<ol>
	<li>Extraiga el ARN de 2 x 106 células con un kit de columna de centrifugación siguiendo las instrucciones del proveedor.</li>
	<li>Utilice 1 μg del ARN extraído para realizar la qRT-PCR en dos pasos siguiendo las instrucciones del proveedor.</li>
	<li>Utilice los hepatocitos de los animales inyectados con solución salina como control para corregir la expresión génica relativa de los marcadores de reprogramación, pluripotencia y hepatocitos.</li>
</ol>
4. Análisis de citometría de flujo de pluripotencia mejorada a nivel de proteínas
<ol>
	<li>En los días 1 y 4 después de la inyección, realizar la perfusión hepática y aislar los hepatocitos primarios como se indicó anteriormente.</li>
	<li>Ajuste la densidad celular a 1 x 107 células/ml y prepare alícuotas de 100 μl.</li>
	<li>Fije las células con el tampón de fijación BD Cytofix y permeabilice con 1x tampón BD Perm/Wash.</li>
	<li>Incubar las células con OCT4-PerCP-Cy5.5 anti-ratón o Nanog-PE anti-ratón durante 30 minutos.</li>
	<li>Incluye controles negativos e isotipos.</li>
	<li>Analice las células teñidas con el citómetro de flujo de investigación de alto rendimiento CyAn ADP.</li>
</ol>
5. Inmunotinción de secciones hepáticas para marcadores de pluripotencia
<ol>
	<li>Cuatro días después de la inyección, perfundir el hígado como se indicó anteriormente, pero solo con tampón HBSS para eliminar la sangre del tejido hepático.</li>
	<li>Cortar un trozo de tejido hepático y sumergirlo en 2-metilbutano (preenfriado en nitrógeno líquido) para continuar con la criosección.</li>
	<li>Los tejidos congelados pueden mantenerse a -80 °C o cortarse directamente en secciones de 14 μm de espesor con un criostato.</li>
	<li>Secar al aire las secciones de papel durante 1 hora a temperatura ambiente y colocarlas posteriormente con metanol, preenfriadas a -20 °C durante 10 min. Secar al aire durante 15 min y luego lavar las secciones dos veces con PBS (5 min cada una).</li>
	<li>Incubar las secciones en tampón de bloqueo (5% de suero de cabra-0,1% Triton en PBS pH 7,3) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de dos pasos de lavado con tampón de lavado (1% BSA-0,1% Triton en PBS, pH 7,3).</li>
	<li>Incubar las secciones de tejido durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios anti-OCT4, anti-SOX2 y anti-Nanog.</li>
	<li>Al día siguiente, lavar las secciones 3 veces (5 min cada una) con tampón de lavado e incubarlas durante 1,5 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario.</li>
	<li>Lave las secciones de hígado con PBS (3 veces de 5 minutos cada una) y móntelas en un medio que contenga DAPI y antidecoloración.</li>
	<li>Visualice los portaobjetos bajo un microscopio de epifluorescencia.</li>
</ol>
6. Tinción de fosfatasa alcalina (ALP) de secciones de tejido hepático
<ol>
	<li>Obtener secciones de tejido hepático como se describió anteriormente.</li>
	<li>Calentar las secciones de tejido a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de realizar la tinción.</li>
	<li>Fijar con paraformaldehído al 4% durante 2 min. Nota: un tiempo de fijación excesivo puede disminuir la actividad de la fosfatasa alcalina.</li>
	<li>Secar las secciones al aire durante 30 min y luego incubar con sustrato líquido BCIP/NBT a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Lave las correderas con agua destilada y móntelas con medios de montaje acuosos.</li>
	<li>Captura de imágenes aleatorias mediante microscopía óptica.</li>
</ol>
7. Cuantificación de los niveles de albúmina y enzimas hepáticas en suero para evaluar la toxicidad hepática
<ol>
	<li>En los días 4, 8, 12 y 120 después de la transfección, recoja 300 μl de sangre directamente del ventrículo cardíaco.</li>
	<li>Mantenga la sangre en hielo mientras se recogen las diferentes muestras para evitar la coagulación.</li>
	<li>Una vez que todas las muestras estén listas, incubar durante 30 minutos a 37 °C hasta que la sangre se coagule.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Pipetear cuidadosamente el suero (en el sobrenadante) en un nuevo tubo Eppendorf y congelar a -80 °C hasta el procesamiento de las muestras.</li>
	<li>Analice los niveles séricos de albúmina, ALT, AST, ALP y GLDH.</li>
</ol>
8. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y ácido peryódico-Schiff (PAS) de secciones hepáticas para evaluar la toxicidad hepática
<ol>
	<li>En diferentes momentos, incluidos 2, 4, 8, 12, 24, 50 y 120 días después de la inyección de HTV, realice la perfusión hepática con tampón HBSS solo como se describió anteriormente.</li>
	<li>Cortar un trozo de tejido hepático y fijarlo en paraformaldehído al 4%.</li>
	<li>Incrustar el tejido hepático en bloques de parafina, seccionar y teñir con tinción H&E o PAS.</li>
	<li>Captura de imágenes aleatorias mediante microscopía óptica.</li>
</ol>

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblasts+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Mouse+Embryonic+And+Adult+Fibroblast+Cultures+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+From+Human+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Gonzalez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Transient+Expression+Of+A+Single+Nonviral+Polycistronic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Without+Viral+Vectors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. </a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piggybac+Transposition+Reprograms+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Transgene-Free+Induced+Pluripotent+Mouse+Stem+Cells+By+The+Piggybac+Transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon.</a> Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+To+Pluripotency+And+Directed+Differentiation+Of+Human+Cells+With+Synthetic+Modified+Mrna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Direct+Delivery+Of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Mirna-Mediated+Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Somatic+Cells+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).</li>
<li>Lin, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Of+Somatic+Cell+Reprogramming+Through+Inducible+Mir-302+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression.</a> Nucleic Acids Res. , (2011).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Cells+To+Pluripotency+Using+Mature+Micrornas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas.</a> Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Targets+Of+Mir-302+And+Mir-372+Promote+Reprogramming+Of+Human+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).</li>
<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flaw+In+Induced-Stem-Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flaw In Induced-Stem-Cell Model.</a> Nature. 470, 13 (2011).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+In+The+Safety+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines.</a> Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).</li>
<li>Pera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+Of+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dark Side Of Pluripotency.</a> Nature. 471, 46-47 (2011).</li>
<li>Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Challenges+In+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+To+Model+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease.</a> Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Germline-Competent+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Varas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Show+No+Common+Retroviral+Vector+Insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions.</a> Stem Cells. 27, 300-306 (2009).</li>
<li>Jia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonviral+Minicircle+Vector+For+Deriving+Human+Ips+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells.</a> Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+For+Making+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Reprogramming+A+La%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotency%3A+History%2C+Mechanisms%2C+And+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).</li>
<li>Gore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Coding+Mutations+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+Number+Variation+And+Selection+During+Reprogramming+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency.</a> Nature. 471, 58-62 (2011).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hotspots+Of+Aberrant+Epigenomic+Reprogramming+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 68-73 (2011).</li>
<li>Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Cell+Reprogramming+Towards+Pluripotency+By+Virus-Free+Overexpression+Of+Defined+Factors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. </a> Plos One. 8, (2013).</li>
<li>Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-Based+Transfection+In+Animals+By+Systemic+Administration+Of+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+Of+Foreign+Gene+Expression+In+Hepatocytes+After+Tail+Vein+Injections+Of+Naked+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Past%2C+Present%2C+And+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).</li>
<li>Colella, P., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav-Mediated+Gene+Supply+For+Treatment+Of+Degenerative+And+Neovascular+Retinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases.</a> Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).</li>
<li>Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Advent+Of+Aav9+Expands+Applications+For+Brain+And+Spinal+Cord+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).</li>
<li>Mccown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+%28Aav%29+Vectors+In+The+Cns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns.</a> Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este estudio proporciona evidencia de prueba de principio de reprogramación celular in vivo hacia la pluripotencia después de la transferencia eficiente y la sobreexpresión de los factores OKSM al hígado de ratón adulto. Con la ayuda de diferentes técnicas como qRT-PCR, citometría de flujo, IHQ o análisis de suero, se investigó el tejido diana para observar la reprogramación celular in vivo . Muy rápidamente desde la inducción de la sobreexpresión del factor OKSM en el tejido, los marcadores de pluripotencia se regularon al alza a nivel de ARNm y proteína (dentro de las 48 horas). A lo largo de estos experimentos, se demostró que entre el 5 y el 15% de las células extraídas del tejido eran positivas para Nanog y Oct3/4. Además, no se observaron anomalías estructurales o funcionales en el hígado a lo largo de 120 días. La expresión de transgenes por inyección HTV de ADN plasmídico en tejidos distintos del hígado (pulmón, bazo, riñón y corazón) se ha descrito previamente, sin embargo, los niveles de expresión génica fueron al menos 3 órdenes de magnitud más bajos que los de los hepatocitos30. Los datos de este estudio indican que la reprogramación de células somáticas hacia un estado pluripotente in vivo es segura, rápida y eficiente. En vista de la mayoría de las metodologías de reprogramación celular in vitro existentes que generalmente logran la generación de células pluripotentes (iPS) en 3 semanas con menos del 1% de eficiencia32, la reprogramación in vivo a pluripotencia puede ofrecer alternativas muy interesantes. Nuestra hipótesis es que el concepto de reprogramación in vivo a pluripotencia podría aplicarse a varios tipos de células somáticas con alta eficiencia (dependiendo del vector utilizado), sin embargo, será necesario determinar el nivel de pluripotencia funcional alcanzado en las células reprogramadas in vivo . Además, con el desarrollo de protocolos y tecnologías mejorados, las células reprogramadas in vivo podrían extraerse y utilizarse con fines de medicina regenerativa.
Hay algunos pasos críticos a seguir para reprogramar células somáticas adultas in vivo con alta eficiencia. Lograr altos niveles de expresión génica en el tejido diana es un requisito previo. En este estudio, esto se ilustró utilizando la transferencia y expresión eficientes de ADN plasmídico a los hepatocitos mediante inyección de HTV. Los factores más importantes para la inyección de HTV son el volumen, que debe estar entre el 8 y el 10% del peso corporal total del animal, y la velocidad de inyección, que debe realizarse en 5-7 segundos. No se deben usar ratones menores de 6 semanas, ya que la inyección de HTV puede causar más daño tisular en el hígado, lo que puede afectar la eficiencia de la reprogramación celular. El fondo genético de los animales no tuvo ningún impacto en la determinación de la eficiencia de la reprogramación in vivo , ya que hemos informado previamente niveles similares de reprogramación en ratones Balb/C y TNG-A, siendo este último una cepa transgénica que lleva el reportero eGFP insertado en el locus Nanog y se cría en el fondo Sv12929.
Especulamos que la reprogramación celular in vivo a un estado pluripotente (que deberá determinarse) se puede aplicar a otros tipos de tejidos siempre que los factores OKSM se entreguen de manera eficiente a las células diana, lo que permite altos niveles de expresión génica. Se han estudiado una variedad de vectores de administración de genes virales y no virales en ensayos preclínicos y clínicos para dirigirse a diferentes tipos de células y tejidos33. Por ejemplo, para los tejidos neurales u oculares, los virus adenoasociados han sido la opción de vector preferida para una transferencia eficiente de genes in vivo 34-37, mientras que en el tejido muscular se ha demostrado que las inyecciones de ADN plasmídico desnudo dan como resultado niveles relativamente altos de expresión génica38,39. Por lo tanto, el método del vector de transferencia de genes debe seleccionarse cuidadosamente según el tipo de tejido para lograr una reprogramación celular in vivo eficiente y rápida hacia un estado pluripotente.

Las preocupaciones éticas sobre el uso de células madre embrionarias han sido una de las limitaciones en el desarrollo de la investigación con células madre. Sin embargo, el descubrimiento por parte de Yamanaka y sus colegas de que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (a saber: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) podría conducir a la reprogramación in vitro de células somáticas en células pluripotentes, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS), ha abierto nuevas oportunidades. La transferencia de genes virales1-5 y no virales6-10, la translocación citoplasmática de proteínas11,12 y la transfección de miRNA13-16 se encuentran entre los diversos métodos utilizados hoy en día para generar células iPS. Sin embargo, estas metodologías de reprogramación adolecen de diversos problemas que están restringiendo su traslación a la clínica, tales como: a) severas limitaciones en la eficiencia de la reprogramación celular; b) el uso predominante de vectores virales; c) protocolos largos y de varias etapas de las condiciones de cultivo; y d) el riesgo de tumorigénesis por implantación de las células iPS generadas in vitro 17-20.
La transferencia génica de factores de transcripción definidos3-5 por retrovirus es el método más utilizado para reprogramar células somáticas. Sin embargo, contiene los riesgos derivados de la posibilidad de mutagénesis insercional, transducción estable y expresión de protooncogenes a largo plazo21,22. También se han explorado vectores de transferencia de genes no virales, como el ADN plasmídico6,7,23 o la administración de ARN10 mediante liposomas o electroporación. Si bien son más seguros en comparación con los virus, estos vectores ofrecen una eficiencia de transducción y reprogramación significativamente limitada24,25 .
Uno de los dogmas centrales de este campo emergente es que la implantación in vivo de células iPS conducirá a su diferenciación incontrolada y a la formación de una masa similar a un tumor (teratoma), compuesta por varios tejidos de las tres capas germinales diferentes. Por lo tanto, el concepto de reprogramación a pluripotencia se ha centrado principalmente en las manipulaciones in vitro de las células somáticas primarias extraídas (más comúnmente fibroblastos). Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, este principio adolece de largos y complejos protocolos de cultivo celular, que incluyen múltiples rondas de tratamiento (transferencia de genes, factores de crecimiento, antibióticos, antioxidantes) que pueden aumentar los riesgos de formación de teratomas u otras formas de tumorigénesis tras la implantación de las células24-28.
Proponemos que la reprogramación de células somáticas adultas in vivo por la sobreexpresión transitoria de los factores de transcripción OKSM no conduce a la formación posterior de teratomas29. El método para lograrlo dependerá de lograr altos niveles de expresión del factor de transcripción dentro del tejido diana de la manera más segura posible. En este estudio, seleccionamos una tecnología de transferencia de genes libre de virus establecida que ha demostrado dirigirse de manera eficiente al hígado para reprogramar las células a la pluripotencia in vivo. Esta tecnología implica la inyección hidrodinámica rápida y de gran volumen de ADN plasmídico de ADN plásmido30,31. Se pueden lograr altos niveles de expresión de genes transfectados en hepatocitos adultos siguiendo este método de transferencia de genes no virales. Además, esta tecnología minimiza los riesgos potenciales del uso de vectores virales (por ejemplo, inserción genómica permanente, mutagénesis insercional).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A ADNp</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Obtenido de Addgene como puñalada bacteriana, producción de plásmidos realizada en Plasmid Factory (Alemania)</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Obtenido de Addgene como puñalada bacteriana, producción de plásmidos realizada en Plasmid Factory (Alemania)</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtro</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ y Mg2+ libre, con bicarbonato</td></tr><tr><td>Medio de digestión hepática</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Medio de lavado de hepatocitos</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; m filtro de células</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ARN de nucleospina II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit para el aislamiento de ARN de células y tejidos</td></tr><tr><td>iScript kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 cebador directo</td><td>Secuencia Sigma</td><td>dada en comentarios</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 cebador inverso</td><td>Secuencia Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>CTCAATGCTAGTTCCTCTCTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2 cebador delantero Secuencia</td><td>Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 cebador inverso</td><td>Secuencia Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc cebador directo</td> Secuencia <td>Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en comentarios</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog cebador directo</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en comentarios</td><td>CAGAAAAACCAGTGGGGGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en comentarios</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 cebador directo</td> Secuencia <td>Sigma</td><td> dado en los comentarios</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 cebador inverso</td><td>Secuencia Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 cebador directo</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb cebador delantero</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat cebador directo</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>ATGGACAGTCTGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf cebador delantero</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf cebador inverso</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGTGTG</td></tr><tr><td>B cebador directo</td><td>Sigma</td><td>secuencia dada en los comentarios</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B cebador inverso de actina</td> Secuencia <td>Sigma</td><td>dada en los comentarios</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Tampón de fijación Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x BD Tampón Perm/Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>conejo pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Uso en una concentración de 3 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>conejo pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Usar a una concentración de 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>pAb de conejo anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Uso a una concentración de 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>mAb de ratón anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Utilizar a una concentración de 20 &mu; g/ml</td></tr> de <tr><td>IgG anti-conejo con pAb de cabra marcado con Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR:</td><td>Úselo a una concentración de 1/250</td></tr> de <tr><td>IgG anti-ratón pAb de cabra marcado con Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Úselo a una concentración de 1/250</td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT sistema de sustrato líquido</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje acuoso</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% La solución madre de paraformaldehído Fisher</td><td></td><td>AA433689M</td><td>es del 16%, úsela al 4%</td></tr><tr><td>Hematoxilina y eosina</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>Tinción PAS</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

en reprogramación vivo de células somáticas de adultos a pluripotencia por la sobreexpresión de factores de yamanaka

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) que resultan de la reprogramación de células somáticas a un estado pluripotente mediante la expresión forzada de factores definidos están ofreciendo nuevas oportunidades para la medicina regenerativa. Tales aplicaciones clínicas de las células iPS han sido limitadas hasta ahora, principalmente debido a la escasa eficiencia de las metodologías de reprogramación existentes y al riesgo de que las células iPS generadas formen tumores tras la implantación.
Planteamos la hipótesis de que la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia podría lograrse in vivo mediante la transferencia génica de factores de reprogramación. Con el fin de reprogramar eficientemente las células in vivo, es necesario expresar altos niveles de los factores de transcripción Yamanaka (OKSM) en el tejido diana. Esto se puede lograr mediante el uso de diferentes vectores genéticos virales o no virales dependiendo del tejido objetivo. En este estudio en particular, se utilizó la inyección hidrodinámica de ADN plasmídico en la vena de cola (HTV) para administrar los factores OKSM a los hepatocitos de ratón. Esto proporcionó una prueba de evidencia de la reprogramación in vivo de células somáticas adultas hacia un estado pluripotente con alta eficiencia y cinética rápida. Además, no se observó formación de tumores ni teratomas in situ.
Se puede concluir que la reprogramación de células somáticas in vivo puede ofrecer un enfoque potencial para inducir una mayor pluripotencia de forma rápida, eficiente y segura en comparación con los protocolos realizados in vitro y puede aplicarse a diferentes tipos de tejidos en el futuro.

Figura 1 muestra una visión general del procedimiento que implica la transferencia génica de plásmidos que codifican OKSM al hígado de ratones y las diferentes técnicas realizadas para observar la reprogramación celular in vivo. Tras la inyección HTV de los plásmidos, se observó un aumento significativo en la expresión génica de los factores de reprogramación transfectados (Oct3/4, Sox2, Klf4 y cMyc) a nivel de ARNm el día 2 después de la inyección. La expresión de estos factores disminuye con el tiempo tras la inyección, como se muestra en la Figura 2a. En cuanto a la expresión de marcadores endógenos de pluripotencia (Nanog, Ecat1 y Rex1), sus niveles se incrementaron significativamente en comparación con los de hepatocitos de animales inyectados con solución salina los días 2 y 4 tras la inyección, y regresaron a los niveles basales a partir del día 8 (Figura 2b). Al mismo tiempo, se confirmó la desdiferenciación de la población de hepatocitos mediante la disminución de la expresión de genes específicos de hepatocitos (Alb, Aat y Trf), lo cual fue estadísticamente significativo el día 4 y alcanzó niveles basales a partir del día 8 (Figura 2d).
La expresión de Oct3/4 y Nanog a nivel proteico se investigó mediante citometría de flujo. Como se muestra en Figura 2c, solo Oct3/4 se expresa en el día 1 después de la inyección de HTV, mientras que para la expresión del marcador endógeno de pluripotencia Nanog fue necesario esperar hasta el día 4.
La ocurrencia de la reprogramación celular in vivo se confirmó además mediante análisis inmunohistoquímico de tejidos hepáticos con anticuerpos anti-OCT4, anti-SOX2 y anti-Nanog y mediante tinción específica para la actividad de fosfatasa alcalina (ALP). Células positivas para todos los marcadores y para la actividad enzimática se encuentran de manera reproducible en los tejidos hepáticos de animales inyectados con OKSM, pero no en los controles inyectados con solución salina (Figura 3).
Los posibles efectos secundarios de toxicidad y la formación de teratomas derivados de la reprogramación celular in vivo mediante la inyección de pDNA con HTV se investigaron mediante la cuantificación de los niveles de enzimas hepáticas en suero, así como con tinciones de H&amp;E y PAS de secciones de tejido hepático durante un período de 120 días. Se observaron signos transitorios y no graves de daño tisular hasta el día 2, pero no más allá. No se observó formación de teratomas ni ningún signo de displasia o alteraciones morfológicas durante el período de estudio (Figura 4). No hubo anomalías estructurales ni funcionales hepáticas a lo largo del estudio en ninguno de los animales, lo cual fue confirmado por los niveles de albúmina y enzimas hepáticas, así como por la tinción de glucógeno en secciones de tejido (Figuras 4b y c).
<img alt="Inyección de factores de reprogramación in vivo, diagrama de ratón, plásmido, análisis de tejido, PCR, citometría." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Resumen esquemático del procedimiento de reprogramación in vivo y su análisis. El protocolo comprende dos etapas principales: (i) administración de factores de reprogramación in vivo y (ii) extracción del tejido y análisis de muestras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura ampliada</a>.
<img alt="Análisis de expresión génica; gráficos de barras con datos de expresión relativa a lo largo de días; figuras a-d; resultados científicos." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Sobreexpresión in vivo de los factores de transcripción de Yamanaka en hígado de ratón adulto. Se inyectaron ratones Balb/C mediante HTV con solo 0,9 % de solución salina, o con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 %, y en los días 2, 4, 8, 12 y 24 se realizó un análisis mediante RT-qPCR de hepatocitos para determinar la expresión génica relativa de: (a) factores de transcripción transfectados (OKSM) y (b) marcadores endógenos de pluripotencia; (c) análisis mediante citometría de flujo de células positivas para OCT3/4 y positivas para Nanog; (d) expresión génica relativa de marcadores de hepatocitos determinada mediante RT-qPCR. Todos los niveles de expresión génica se normalizaron respecto al grupo inyectado con solución salina mediante HTV. (* p&lt;0,05 indica diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos inyectados con solución salina mediante HTV, obtenida mediante análisis de varianza y comparación por pares de Tukey). Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura ampliada</a>.
<img alt="Comparación mediante microscopía de inmunofluorescencia de OCT4, SOX2, NANOG en células tratadas con solución salina frente a células tratadas con OKSM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Reprogramación celular in vivo en tejido hepático de ratón adulto mediante inmunohistoquímica. Ratones Balb/C inyectados mediante HTV únicamente con solución salina al 0,9 %, o con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 %. En el día 4, se recolectaron los hígados y se cortaron secciones de tejido congelado que se tiñeron con anticuerpos anti-OCT4, anti-SOX2 o anti-Nanog para evaluar la inmunorreactividad, o con BCIP/NBT para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) en el tejido (40X). Las barras de escala representan 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura ampliada</a>.
<img alt="Histología hepática, niveles de enzimas y albúmina en el tratamiento con solución salina frente a OKSM, resultados del experimento." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. El efecto de la reprogramación celular in vivo sobre la funcionalidad hepática y la histopatología. Ratones Balb/C inyectados mediante HTV con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 % o solo solución salina al 0,9 %. En los días 2, 4, 8, 12, 50 y 120 se aislaron y procesaron tejidos hepáticos y sueros para: (a) tinción con H&amp;E; (b) niveles de enzimas hepáticas; (c) niveles de albúmina; (d) tinción con PAS. Se obtuvieron imágenes representativas mediante microscopía óptica (10X). Las barras de escala representan 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la figura ampliada</a>.

Este estudio demuestra la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia in vivo sin la generación de teratomas. Utilizamos la inyección hidrodinámica de ADN plásmido en la vena de cola que codifica los factores Yamanka para inducir la reprogramación in vivo de hepatocitos adultos en células de mayor pluripotencia.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

El objetivo general del siguiente experimento es inducir y evaluar la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia en su microambiente in vivo. Esto se logra cargando una jeringa con ADN plasmídico que codifica los factores de Yamanaka e inyectándolos hidrodinámicamente en la vena de la cola de un ratón BC como segundo paso. Los hepatocitos primarios se aíslan de los tejidos hepáticos y se estudian los niveles de expresión de genes y proteínas relevantes mediante Q-R-T-P-C-R en tiempo real y citometría de flujo.A continuación, se seccionan y tiñen tejidos hepáticos enteros mediante diferentes técnicas para confirmar la reprogramación del tejido y evaluar la toxicidad del procedimiento. Se obtienen resultados que muestran diferencias en la expresión génica y proteica de reprogramación, pluripotencia y marcadores específicos de hepatocitos. Además, la seguridad del enfoque también se valida con pruebas bioquímicas e histológicas.La principal ventaja de la reprogramación de células somáticas in vivo es que ocurre de forma rápida, eficiente y transitoria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reprogramación. Por ejemplo, los resultados de inducir pluripotencia en adultos in vivo.Para comenzar la anestesia, una hembra de ratón bulboso de seis semanas de edad. A continuación, prepare una solución de ADN plásmido que codifique los factores de Yamanaka y un control salino como se describe en el protocolo de texto adjunto Para que la transfección tenga éxito, inyecte la dosis completa en no más de cinco a siete segundos en puntos de tiempo predeterminados después de la inyección. Aísle los hepatocitos primarios exponiendo la cavidad torácica y perfundiendo el hígado con tampón HBSS precalentado y luego perfunda el medio de digestión hepático a un caudal de 0,6 litros por minuto durante 15 minutos hasta que el hígado se hinche y se afloje.A continuación, extirpe el hígado con fórceps después de cortar el falor y los ligamentos coronarios. Para obtener más detalles sobre el aislamiento de células hepáticas primarias, consulte los pasos en este video adicional de JoVE. A continuación, lave el hígado con medio de lavado de hepatocitos mientras lo pasa a través de un colador de células de 100 micras.Para obtener una suspensión celular, recoja la suspensión celular en tubos de 50 mililitros y ajuste el volumen a 15 mililitros con medio de lavado de hepatocitos. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 50 G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet de celda.En 10 mililitros de medio de lavado de hepatocitos, la pastilla celular debe suspenderse con cuidado ya que los hepatocitos son células muy frágiles. Repita el procedimiento de centrifugación un total de tres veces y suspenda el pellet final en 10 mililitros de medio de lavado de hepatocitos. A continuación, estime el número de células utilizando un hemocitómetro y un microscopio óptico para estudiar la expresión génica de los hepatocitos aislados.Comience centrifugando dos veces 10 a la sexta celda a 300 veces G y deseche el snat. A continuación, extraiga el ARN de las células con un kit de columna de centrifugación siguiendo las instrucciones del proveedor. A continuación, se utiliza un microgramo del ARN extraído de los grupos de tratamiento y control para realizar Q-R-T-P-C-R en dos pasos con el fin de buscar cambios en los niveles de pluripotencia de reprogramación y marcadores de hepatocitos.Para analizar la pluripotencia aumentada de las células a nivel de proteína, se toman los hepatocitos aislados y se ajusta la densidad de las células a una por 10 a la séptima célula por mililitro. Para la citometría de flujo, prepare 100 alícuotas de microlitros de la suspensión celular y luego fíjelas en 100 microlitros de citometría BD. Fije el tampón de fijación durante 20 minutos a temperatura ambiente después de la fijación, pelice las células y resus, suspenda en 100 microlitros de un tampón de lavado de permeación X BD incube durante 10 minutos, agregue la temperatura ambiente.A continuación, incubar las células con anticuerpos primarios contra los factores de transcripción expresados en células pluripotentes durante 30 minutos. Esto incluye anti ratón T four por CP SCI 5.5 o anti-US nag pe. Asegúrese de incluir también controles negativos e isotipos.A continuación, analice las células teñidas en el citómetro de flujo con canales per CP sci 5.5 y PE cuatro días después de la inyección de la sección criogénica de ADN plasmídico, el hígado como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, incubar las secciones fijas de metanol en el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora, seguidas de dos pasos de lavado durante cinco minutos cada uno con tampón de lavado. A continuación, agregue anticuerpos primarios anti T cuatro anti calcetines dos y anti nag en portaobjetos separados, asegurándose de cubrir completamente el tejido hepático.Cubra las muestras para evitar la aberración e incube las secciones durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con tampón de lavado. A continuación, incubarlos durante 1,5 horas a temperatura ambiente con sus respectivos anticuerpos secundarios tras la incubación.Lave las secciones de hígado tres veces durante cinco minutos cada una con PBS. Móntelos en un medio antidecoloración elegante y protéjalos con cubreobjetos. A continuación, visualice los portaobjetos con un microscopio de epifluorescencia.Calentar las secciones criogénicas a temperatura ambiente durante 15 minutos y fijarlas con aldehído paraformado al 4% durante dos minutos. A continuación, seca los portaobjetos al aire durante 30 minutos. Una vez secas, incubar las secciones con sustrato líquido B-C-I-P-N-B-T a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Durante este tiempo, la solución reaccionará con la fosfatasa alcalina en el tejido para formar un precipitado insoluble visible por microscopía. Después de 30 minutos, lave los portaobjetos con agua destilada y móntelos con medios de montaje acuosos. A continuación, capture imágenes con microscopía óptica los días 4, 8, 12 y 120.Después de la transfección, recoja 300 microlitros de sangre directamente del ventrículo cardíaco. Mantenga la sangre en hielo mientras se recolectan las diferentes muestras para evitar que se coagule demasiado pronto. Una vez recogidas todas las muestras, incubarlas durante 30 minutos a 37 grados centígrados o hasta que la sangre se coagule.A continuación, centrifugar las muestras a 2000 g durante cinco minutos y pipetear cuidadosamente el suero en un nuevo tubo de einor. A continuación, analice los niveles séricos de albúmina y enzimas hepáticas, A-L-T-A-S-T-A-L-P y GLDH utilizando un espectrofotómetro. Además de analizar la sangre para evaluar la toxicidad hepática, prepare también secciones de tejido incluidas en parafina, como se describe en el protocolo de texto adjunto.A continuación, tiñe el tejido con tinción H y D o PIS y analiza las imágenes capturadas. Microscopía óptica después de la inyección hidrodinámica de la vena de cola de los plásmidos, un aumento significativo en la expresión génica de los factores de reprogramación transfectados. T tres, cuatro calcetines, dos y cmic a nivel de ARNm se observaron el segundo día después de la inyección.La expresión de estos factores disminuye con el tiempo después de la inyección. Los marcadores de pluripotencia endógena, nano g ECAT one y REX one, también aumentaron significativamente en comparación con los de los hepatocitos de animales inyectados con solución salina en el segundo y cuarto día después de la inyección y volvieron a los niveles basales a partir del octavo día. Al mismo tiempo, la desdiferenciación de la población de hepatocitos se confirmó mediante la regulación a la baja de los genes específicos de los hepatocitos, A-L-B-A-A-T y TRF, que fueron estadísticamente significativos en el cuarto día y alcanzaron niveles basales a partir del octavo día.Además, se investigó la expresión de T, tres, cuatro y nag a nivel de proteínas mediante citometría de flujo, como se muestra aquí. Solo OC tres cuatro se expresa en el primer día. Después de la inyección de HTV, mientras que para la expresión del marcador de pluripotencia endógeno nano G, fue necesario esperar hasta el cuarto día.La ocurrencia de reprogramación celular in vivo se confirmó aún más mediante el análisis inmunohistoquímico de los tejidos hepáticos. Las células positivas para todos los marcadores y la actividad enzimática se encuentran de forma reproducible en los tejidos hepáticos de los animales inyectados con KSM, pero no en los controles inyectados con solución salina. Las tinciones de H y e y PAS muestran signos transitorios pero no graves de daño tisular que se disipan después del segundo día.No se observó formación de teratomas ni ningún signo de displasia o alteraciones morfológicas durante el período de estudio. Tampoco hubo anormalidades funcionales hepáticas a lo largo del estudio en ninguno de los animales, como lo confirman los niveles de albúmina y enzimas hepáticas que se muestran aquí. Este estudio proporciona una prueba de principio de la reprogramación celular in vivo hacia la pluripotencia.Esto sucedió de manera rápida, transitiva y eficiente después de la administración de los factores Yamanaka. Planteamos la hipótesis de que la reprogramación in vivo se puede lograr en otros tejidos además del hígado, siempre que el gen sea el adecuado. Los vectores hepáticos están diseñados para transfectar el tejido diana.Además, con protocolos y tecnologías mejorados, podría ser posible extraer las células del programa in vivo para utilizarlas en estudios posteriores.

in-vivo-reprogramming-adult-somatic-cells-to-pluripotency

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Disponibilidad de SCs somáticas es crucial para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y para profundizar en las propiedades de la SC. Aquí presentamos estrategias experimentales para reprogramar, in vitro, adultos células diferenciadas en sus correspondientes celdas extensibles progenitoras específicas de tejido por la expresión transitoria de la sola coactivador transcripcional YAP.

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

Aprende a reprogramar células somáticas hacia pluripotencia in vivo mediante inyección hidrodinámica de plásmidos con factores Yamanaka en hepatocitos de ratón. Este método valida la seguridad y eficiencia de la reprogramación celular.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Explorar más videos