Name: Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a inmovilizar BMP-2 covalentemente en superficies mediante monocapas autoensambladas sin perder su bioactividad. Este método permite estudiar la señalización de BMP-2 en membranas celulares con aplicaciones en biología del desarrollo óseo.

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Agradecemos al Prof. JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, Universidad de Heidelberg y el Departamento de Nuevos Materiales y Biosystems, Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por su amable apoyo. El apoyo financiero de la Max-Planck-Gesellschaft y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) También se reconoce en gran medida.

1. Síntesis de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxisuccinimida éster (MU-NHS) <ol><li> Añadir gota a gota una solución de 500 mg de N-hidroxisuccinimida y 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina en 10 ml de acetona (PA) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanoico en 40 ml de diclorometano (PA) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Enfriar la reacción a 0 ° C y añadir gota a gota 1,1 g de N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida en 10 ml de diclorometano (bajo atmósfera de nitrógeno). Mantener la reacción a baja temperatura durante 1 hora y después se agita a TA durante la noche. </li><li> Se filtra el precipitado y se seca a presión reducida. El producto se purifica mediante cromatografía flash con benceno petróleo y acetato de etilo (pa) en una proporción de 1:1. </li></ol> 2. Preparación de capas de oro homogéneos <ol><li> Cubreobjetos de vidrio limpias con toallitas de precisión y sonicar ellos durante 5 minutos en una solución que contiene una mezcla 1:1 de acetato de etilo (pa) y metanol (pa). Rinse sustratos con metanol y se secan bajo flujo de nitrógeno. </li><li> Coloca los sustratos limpios en el dispositivo de revestimiento por bombardeo iónico. Evacuar la cámara. Retire la capa de óxido de cromo superior de la meta de cromo mediante pulverización durante 60 segundos. Colocar las muestras por debajo de la viga de metal y recubrirlos con una capa de cromo de 10 nm, seguido por recubrimiento con una capa de oro de 40 nm. </li></ol> 3. Inmovilización de la superficie de la BMP-2 <ol><li> Disolver MU-NHS en N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentración final de aproximadamente 1 mM y se incuba sustratos de oro en la solución MU-NHS a TA durante 4 h bajo atmósfera de nitrógeno. </li><li> Superficies Someter a ultrasonidos en DMF durante 2 min, enjuague con DMF y MeOH y se secan bajo flujo de nitrógeno. </li><li> Preparar una solución madre de rhBMP-2 en HCl 4 mM estéril con una concentración de 100 g / ml (almacenar alícuotas a -80 ° C). Para diluciones de trabajo (3,5 mg / ml), se diluye la solución madre en PBS / NaCl (PBS que contenía 1 M de NaCl) y unJUSTE a pH 8,5 inmediatamente antes del uso. </li><li> Incubar superficies funcionalizadas MU-NHS en la solución de trabajo de rhBMP-2 a 4 ° C durante la noche. Aspirar el sobrenadante de la incubación. Superficies Sonicar en PBS / NaCl durante 2 minutos y se lavan 3 veces con PBS estéril / NaCl. </li></ol> 4. Caracterización de superficies <ol><li> Para bloquear la adsorción no específica del anticuerpo, se incuban las superficies con un 5% de BSA (w / v) en solución de PBS durante 1 hora a TA, seguido de incubación con un anticuerpo anti-BMP-2 (1:100 en 1% (w / v ) solución de BSA / PBS) durante 1 hora a TA. Lave las superficies dos veces con PBS y déjelos en remojo durante 30 seg. </li><li> Incubar sustratos con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:1000 en 1% (w / v) de solución de BSA / PBS) durante 30 min a TA, a continuación, lavar dos veces con PBS. </li><li> Utilice ensayo de rojo Ampliflu para medir la actividad enzimática de HRP a 570 nm con un lector de placas. </li></ol> 5. Análisis de la Actividad Biológica <ol><li> Seed 1 x 10 5 ratón mioblastos C2C12 por pocillo en 6 pocillos plAtes en medio de crecimiento, que consisten en un DMEM de alta glucosa que contenía piruvato suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina y se incuba durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Morir de hambre las células en DMEM libre de suero durante 3-5 horas antes de la siembra en las superficies decoradas con inmovilizada BMP-2. </li><li> Para la investigación de la inducción de la señalización de corto plazo, sustituir el medio por 200 l DMEM libre de suero y colocar los inmovilizados BMP-2 superficies superiores a las células. La superficie debe ser manejado con pinzas de punta fina para evitar que se raye. </li><li> Retire suavemente las superficies y aspirar el medio con una pipeta, se lavan las células dos veces con PBS. Continúe con el análisis de las respuestas de células. </li><li> Para el análisis de la actividad biológica a largo plazo, células de la placa en las superficies y la cultura ellos a 37 ° C / 5% de CO 2 en condiciones de suero bajas (2% de FBS) durante seis días. </li></ol>

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</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

En este protocolo se describe la preparación de superficies funcionalizadas con rhBMP-2 bioactivo. Este enfoque comprende dos etapas: 1) la formación inicial de una monocapa auto-montaje (SAM) de un conector bifuncional en la superficie de oro, 2) la inmovilización covalente de la proteína rhBMP-2. En trabajos anteriores, hemos validado la unión efectiva del enlazador bifuncional y el factor de crecimiento, y demostramos que superficie inmovilizada rhBMP-2 mantiene su actividad biológica 19. La bioactividad d...

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un miembro del factor de crecimiento transformante (TGF-β) de la familia y actúa como inductor de la formación de novo de hueso, así como regulador de varios tejidos durante el desarrollo embrionario y adulto homeostasis 1-3. Cada monómero de la proteína biológicamente activa homodimérica BMP-2 contiene un motivo de &quot;nudo de cisteína&quot;, que está altamente conservada en todas las BMP 4. Seis de los siete residuos de cisteína forman enlaces disulfuro intramoleculares que estabilizan cada monómero, mientras que la séptima cisteína está involucrado en la dimerización, formando un enlace intermolecular entre los dos monómeros 5,6. Este nudo de cisteína altamente conservados define la estructura tridimensional de la proteína BMP-2 y determina sus propiedades únicas, tales como resistencia al calor, desnaturalizantes y ácida de pH 7-9. BMP-2 se une a receptores transmembrana quinasa serina / treonina, induciendo de este modo la transducción de señales <sup&gt; 10-12. Dependiendo del modo de oligomerización del receptor, diferentes vías de señalización se activan: una cascada de señalización Smad-independiente conduce a la inducción de la fosfatasa alcalina a través de señalización de p38, mientras que una vía de Smad-dependiente activado por resultados de fosforilación del receptor de Smad en la translocación nuclear complejo y la activación de la transcripción de genes diana específicos, tales como el inhibidor de la diferenciación (Id) 12-14. En el hueso, BMP-2 induce la diferenciación de células madre mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la curación y la formación de novo de hueso. Actualmente, expresada de forma recombinante BMP-2 se aplica clínicamente para mejorar la curación de los sitios fracturados. Una estrategia común en ingeniería de tejido óseo es el uso de factores de crecimiento inyectables, que es menos invasiva en comparación con los sistemas de suministro locales. Sin embargo, estudios in vivo y aplicaciones clínicas han demostrado que la vida media biológica corta, loc inespecíficazación y rápida de domiciliación de BMP-2 puede dar lugar a varios problemas locales, ectópicos y sistémicos 15. Por lo tanto, para obtener una presentación eficaz, el atrapamiento o la inmovilización de la BMP-2 dentro o sobre materiales es necesario para su entrega local y sostenida en el sitio diana. La liberación sostenida se puede lograr con los enfoques de retención no covalentes, tales como atrapamiento físico, adsorción o de iones complejación 16. Sin embargo, se sabe que la adsorción no específica de proteínas a superficies puede resultados en la desnaturalización de las moléculas 17. Para la unión de factores de crecimiento covalente, diferentes tipos de soportes se han desarrollado en la última década. El uso de moléculas de unión bifuncional que se dirigen a grupos amino o carboxilo de la proteína, por ejemplo, es un tipo de enfoque que no requiere necesariamente la modificación de proteínas para lograr su inmovilización. De hecho, mientras que la modificación de proteínas ofrece la ventaja de controlar la orientación de proteína,la introducción de dominios artificiales, etiquetas de péptidos y cadenas específicas de sitio puede alterar la actividad biológica de factores de crecimiento 17. Por lo tanto, para eludir la desnaturalización debida a la interacción con el material de apoyo, las superficies se pueden funcionalizar de antemano, por ejemplo, con una capa monomolecular auto-ensamblada (SAM) de una molécula de unión, seguido por acoplamiento del factor deseado 18. Hemos utilizado un enfoque basado en el SAM para inmovilizar covalentemente BMP-2 en una superficie por la orientación de sus residuos amino libres y hemos demostrado que la proteína inmovilizada conserva tanto su actividad biológica a corto y largo plazo 19. Este protocolo proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 a las células para estudios in vitro de los mecanismos que se producen en la membrana celular y regulan la señalización intracelular responsable de la señalización de osteogénico.

<table><tbody><tr><td>N-hidroxisuccinimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(dimetilamino)piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplicación de acetona</td><td></td><td>A2282</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 11-mercaptoundecanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diclormetano</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-diciclohexisilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Benceno de petróleo</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplicación de acetato de etiloChem</td><td></td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>Libre de portadoras; expresado en E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli(dimetilsiloxano) (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Ampliflu Red ensayo</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), líquido</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td> con alta glucosa <td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Estéril filtrado, probado en cultivo celular</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina 0.05% (1x) con EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina (0.1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Tampón de lisis (ensayo ALP)19</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de zinc (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenilfosfato (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Sustrato de fosfatasa</td></tr><tr><td>Cadena pesada anti-misina (MHC)</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas, Universidad de Iowa</td><td>MF20</td><td>Anticuerpo monoclonal</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipo</fuerte></td></tr><tr><td>Baño Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Frecuencia 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 Sistema de recubrimiento por pulverización catódica</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Condiciones de recubrimiento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 seg Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 seg</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 Lector de placas</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

unión covalente de bmp-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un factor de crecimiento embebido en la matriz extracelular del tejido óseo. BMP-2 actúa como desencadenante de la diferenciación de células mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la cicatrización y la formación de hueso novo. El uso clínico de la humana recombinante BMP-2 (rhBMP-2), en relación con los andamios ha suscitado controversias recientes, en base a la forma de presentación y la cantidad que se va a entregar. El protocolo presentado aquí proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 para los estudios in vitro sobre las células. Describimos cómo formar una monocapa auto-ensamblado que consiste en un engarce heterobifuncional, y mostramos el paso de unión posterior para obtener la inmovilización covalente de rhBMP-2. Con este enfoque es posible lograr una presentación sostenida de BMP-2, mientras que el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína. De hecho, la inmovilización de superficie de BMP-2 permite que las investigaciones dirigidas por la prevención de anuncios inespecíficosdesorción, mientras que la reducción de la cantidad de factor de crecimiento y, más notablemente, lo que dificulta la liberación no controlada de la superficie. Ambos eventos de señalización de corto y largo plazo provocados por BMP-2 se llevan a cabo cuando las células están expuestas a las superficies que presentan inmovilizado covalentemente rhBMP-2, por lo que este enfoque adecuado para los estudios in vitro sobre las respuestas celulares a BMP-2 estimulación.

En nuestra configuración, el oro fue elegido como excipiente, ya que proporciona un sistema biológico no específico pero químicamente sintonizable. Además, la aplicación de las monocapas de autoensamblaje implica muchos beneficios: SAM adsorber de forma espontánea a través de sus "cabeza-grupos" en metales y forman monocapas con pocos defectos, mientras que sus grupos terminales funcionales se pueden modificar adicionalmente. Por tanto, proporcionan una plataforma para adaptar las propiedades de la interfaz de una maner...

Se describe un método para llevar a cabo la inmovilización eficaz de BMP-2 en las superficies. Nuestro enfoque se basa en la formación de una capa monomolecular auto-ensamblada para lograr la unión de BMP-2 a través de sus residuos de amina libres covalente. Este método es una herramienta útil para el estudio de señalización en la membrana celular.

Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

El objetivo general de este procedimiento es unir covalentemente dos moléculas de BMP a superficies sin perder su bioactividad. Esto se logra formando primero una capa de oro en un sustrato por deposición física de vapor. El segundo paso es crear una monocapa autoensamblada de mu NHSA enlazador NHS Thiol bifuncional.A continuación, RH BMP dos se une covalentemente al enlazador. El último paso es eliminar el BMP dos no unido mediante sonicación. En última instancia, se utiliza un ensayo de unión de anticuerpos para mostrar la unión exitosa de BMP dos a las superficies y la actividad biológica de BMP dos unida a la superficie se determina en las células mediante el análisis de la fosforilación de SMA 1 5 8.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los factores de crecimiento, como si la unión inicial de los factores de crecimiento a sus receptores en la superficie celular es suficiente para desencadenar respuestas de señalización. Para demostrar el procedimiento estarán dos miembros de mi laboratorio, Teresa Paul y Elizabeth Schwab. Para comenzar este procedimiento, limpie los cubreobjetos de vidrio con toallitas de precisión y sonicélos duran

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Describimos la fabricación y caracterización de sistemas nanobiológicos que interactúan sustratos nanoestructurados con proteínas inmovilizadas y aptámeros. Se describen los pasos experimentales relevantes que involucran la fabricación litográfica de sustratos nanoestructurados, la biofuncionalización y la caracterización de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS). Se demuestra la detección de SERS de proteínas inmovilizadas en superficie y el sondaje de la unión proteína-ligando y...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Biomateriales dopados con hueso Morphogenetic Protein 2 (BMP2) se han utilizado como una nueva estrategia terapéutica para sanar fracturas sin unión. Para superar los efectos secundarios resultantes de una liberación incontrolable del factor, proponemos una nueva estrategia para sitio-directamente inmovilizar el factor, creando materiales con mayor capacidad osteogénica.

Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

La unión covalente de moléculas de sonda a puntas voladizas de la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica esencial para la investigación de sus propiedades físicas. Esto nos permite determinar la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de los polímeros a través de la espectroscopia de fuerza de molécula única basada en AFM con alta reproducibilidad.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) es una técnica de espectroscopia de fuerza dinámica in situ (DFS). BFP se puede utilizar para medir la constante de resorte de las interacciones moleculares en las células vivas. Este protocolo presenta análisis constantes de resorte para enlaces moleculares detectados por BFP.

Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

Cuando las proteínas precursoras de la familia ß del factor de crecimiento transformador se expresan ectópicamente en embriones de Xenopus laevis, se dimerizan, se escindin y se secretan en el blastocele, que comienza en la etapa de blástula tardía a la gastrula temprana. Describimos un método para aspirar productos de escisión de la cavidad del blastocoele para el análisis de inmunoblot.

Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis

Se establece un modelo in vitro del nicho vascular de la médula ósea mediante la siembra de células mesenquimales y endoteliales en hidrogeles PEG 3D prefabricados. Las redes endoteliales, los componentes de ECM y la actividad ALP de los nichos varían según el factor de crecimiento utilizado. La plataforma se puede utilizar para modelos avanzados de cáncer.

Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

Se proporciona un protocolo para la síntesis y caracterización de monocapas de estructura metal-orgánica autoensambladas utilizando cristales de estructura metal-orgánica (MOF) injertados en polímeros. El procedimiento muestra que las partículas de MOF injertadas en polímeros pueden autoensamblarse en una interfaz aire-agua, lo que da como resultado estructuras monocapa independientes y bien formadas, como lo demuestran las imágenes de microscopía electrónica de barrido.

Síntesis y caracterización de monocapas metal-orgánicas autoensambladas utilizando partículas recubiertas de polímeros

Aprende a inmovilizar BMP-2 covalentemente en superficies mediante monocapas autoensambladas sin perder su bioactividad. Este método permite estudiar la señalización de BMP-2 en membranas celulares con aplicaciones en biología del desarrollo óseo.

Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

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