Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

El objetivo general de este procedimiento es unir covalentemente dos moléculas de BMP a superficies sin perder su bioactividad. Esto se logra formando primero una capa de oro en un sustrato por deposición física de vapor. El segundo paso es crear una monocapa autoensamblada de mu NHSA enlazador NHS Thiol bifuncional.

A continuación, RH BMP dos se une covalentemente al enlazador. El último paso es eliminar el BMP dos no unido mediante sonicación. En última instancia, se utiliza un ensayo de unión de anticuerpos para mostrar la unión exitosa de BMP dos a las superficies y la actividad biológica de BMP dos unida a la superficie se determina en las células mediante el análisis de la fosforilación de SMA 1 5 8.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los factores de crecimiento, como si la unión inicial de los factores de crecimiento a sus receptores en la superficie celular es suficiente para desencadenar respuestas de señalización. Para demostrar el procedimiento estarán dos miembros de mi laboratorio, Teresa Paul y Elizabeth Schwab. Para comenzar este procedimiento, limpie los cubreobjetos de vidrio con toallitas de precisión y sonicélos durante cinco minutos en una mezcla uno a uno de acetato de etilo y metanol.

Después de la sonicación, enjuague los sustratos con metanol y séquelos bajo flujo de nitrógeno. Coloque los sustratos limpios en un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica y evacúe la cámara. Retire la capa superior de óxido de cromo del objetivo de cromo pulverizando pulverizando durante 60 segundos.

A continuación, cubra el sustrato con una capa de cromo de 10 nanómetros, seguida de un recubrimiento con una capa de oro de 40 nanómetros. Cuando termines, retira los sustratos de oro de la cámara y déjalos a un lado. Transfiera los sustratos de oro a un matraz de fondo redondo de dos cuellos e incube en un milimolar M-U-N-H-S en DMF a temperatura ambiente durante cuatro horas bajo atmósfera de nitrógeno.

Después de la incubación, sonicar los sustratos en DMF durante dos minutos. Enjuáguelos con DMF y metanol y séquelos bajo flujo de nitrógeno. Diluya la solución madre RHB MP dos con cloruro de sodio molar en PBS para obtener una concentración final de 3,5 microgramos por mililitro.

Ajuste esta solución de trabajo a pH 8.5 con hidróxido de potasio estéril de 10 milimolares inmediatamente antes de usar. Coloque el anillo A-P-D-M-S encima de la muestra. Transfiera el sustrato a una placa de seis pocillos para asegurarse de que solo las superficies del sustrato estén expuestas a la solución de incubación.

A continuación, incubar los sustratos M-U-N-H-S funcionalizados con la solución de trabajo RHB MP two a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de eliminar el sobrenadante de incubación, agregue un molar de cloruro de sodio en PBS y sonique los sustratos durante dos minutos. Al terminar, lavar los sustratos tres veces con cloruro de sodio estéril en PBS para bloquear la absorción inespecífica del anticuerpo.

Incubar los sustratos en 5%BSA en PBS durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, incubar los sustratos con una solución de anticuerpos anti BMP dos durante una hora a temperatura ambiente cuando termine, lavar los sustratos dos veces con PBS y sonicalarlos durante 30 segundos. A continuación, incube los sustratos en una solución de anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lávelos dos veces con PBS.

Utilice el ensayo de rojo de gripe para medir la actividad enzimática de HRP a 570 nanómetros con un lector de placas, semilla una vez 10 a la quinta boca C, dos C 12 mioblastos por pocillo en placas de seis pocillos en medio de crecimiento e incubarlos durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Una vez que se hayan retirado las placas de la incubadora, aspire los medios de los pocillos y prive a las células en DMEM libre de suero durante tres a cinco horas antes de sembrar en las dos superficies de sustrato BMP funcionalizadas para la investigación de la inducción de señalización a corto plazo. Sustituya el medio por 200 microlitros de DMEM fresco sin suero y coloque los dos sustratos BMP inmovilizados por encima de las células utilizando pinzas de punta fina después de la incubación a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Retire los sustratos suavemente y aspire el medio con una pipeta. A continuación, lavar las células dos veces con PBS y proceder al análisis de las respuestas celulares mediante electroforesis en gel y Western blot para el análisis de la actividad biológica a largo plazo. Coloque las células en las superficies como se describió anteriormente y cultívelas a 37 grados Celsius y 5% de CO2 en 2% FBS durante seis días.

Después de la incubación. Imagen de las células por microscopía de fluorescencia para verificar RH BMP: dos superficies de unión que presentan RH BMP inmovilizadas, dos fueron incubadas con un anticuerpo específico BMP, dos y un anticuerpo secundario conjugado con HRP. La superficie inmovilizada RH BMP dos o I BMP dos se detectó antes y después de la estimulación celular.

Aquí se muestra la unión exitosa de RH BMP dos a la superficie en una confirmación reconocida por el anti BMP dos IgG. La BMP RH 2 inmovilizada en superficie se cuantificó utilizando el ensayo métrico amli flu red chole y los datos muestran que después de la estimulación celular, la proteína aún se detectó en la superficie Las respuestas celulares a las superficies que presentaban RHB MP 2 inmovilizadas se evaluaron y compararon con el efecto de los sustratos de oro no tratados. Aquí, dos células C dos C 12 fueron estimuladas durante 30 minutos por RHB MP dos superficies funcionalizadas que se acercaban desde la parte superior.

En este modelo, BMP dos inhibe la diferenciación de las células en miotubos multinucleados e induce fenotipos osteoblásticos. La activación de SMAD 1 5 8, que son reporteros aguas abajo de la vía de señalización BMP dos, se analiza mediante Western blot, como se muestra aquí. La fosforilación de SM se observa después de 30 minutos de estimulación por I BMP dos, mientras que no se produce fosforilación de SMAD 1 58 en las células expuestas a muestras de oro no tratadas.

Este resultado indica que el proceso de inmovilización no altera la actividad a corto plazo de BMP two y desencadena pasos tempranos en la señalización de smad para determinar si I BM P dos afecta la diferenciación osteogénica a largo plazo. El nivel de expresión de la fosfatasa alcalina se investigó mediante un ensayo métrico de chole. Se midió la actividad de la fosfatasa alcalina de las células C dos C 12 después de incubar las células durante seis días en oro simple y en dos superficies IBP.

La actividad de la fosfatasa alcalina en lisados de células cultivadas en I BM P dos superficies mostraron una absorción significativamente mayor en comparación con el control. Este resultado revela que IBMP dos induce la expresión de fosfatasa alcalina en células C dos C 12 para investigar el efecto de IBP dos. En la miogénesis C, dos células C 12 se sembraron directamente sobre oro o sobre superficies funcionalizadas y se cultivaron en condiciones de suero bajo.

Después de seis días, se realizó la tinción de la cadena pesada de miosina como se muestra aquí. C, dos células C, C12 no lograron formar miosina de cadena pesada en tubos positivos en presencia de I, BM, P dos, en contraste con las células sobre sustratos de oro. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmovilización de BMP dos en nanopartículas de oro, para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, la cantidad de BMP dos inmovilizado que se necesita localmente para desencadenar respuestas de señalización de manera eficiente.