Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

El objetivo general de este procedimiento es documentar el paso del material infeccioso PreOn a través del sistema digestivo de los cuervos americanos. Esto se logra midiendo primero a los cuervos con material infeccioso PreOn. El segundo paso es recolectar las heces de cuervo durante cuatro horas después de la sonda nasogástrica y prepararlas para inyectarlas en ratones.

A continuación, los ratones se inoculan intraperitoneal con un mililitro de homogeneizado fecal de cuervo. El paso final es monitorear a los ratones diariamente hasta que expresen signos clínicos de rasposidad en ratones. En última instancia, el análisis de Western blot se utiliza para confirmar la presencia de PreOn infeccioso en el modelo de ratón y verificar la transmisión de la enfermedad.

La idea de que los cuervos podían transportar. CWD llegó a nosotros un día de invierno cuando, después de conducir a una instalación de alces en cautiverio donde estábamos haciendo una investigación y vimos alces atropellados siendo alimentados por cuervos, y más tarde ese día, cuervos que salían del cielo de la nada, aterrizando en estos comederos, alimentándose justo al lado del alce, defecando en el grano que los alces estaban consumiendo, además de la observación de la literatura de que muchos de los cuervos ese verano en todo Colorado, Wyoming invernan en un área concentrada en Nuevo México, da la casualidad de que esa área en Nuevo México es donde ha aparecido algo de CABD y está a cien millas de distancia del epicentro de la enfermedad de desgaste del crack. Así que estas dos observaciones nos hicieron pensar que potencialmente los cuervos podrían desempeñar un papel en el transporte de la CWD por el paisaje.

Una demostración visual de estas técnicas es fundamental, ya que las técnicas intraperitoneales y de sonda nasogástrica oral incorrectas pueden provocar la muerte de los animales de estudio. Para empezar, añade cuatro gotas de tinte azul a un huevo revuelto y mézclalo bien. Luego, dibuja cinco mililitros de la mezcla de tinte y huevo en una aguja de sonda nasogástrica de dos pulgadas con una persona sujetando suavemente al cuervo.

Abre el pico del cuervo lo suficiente como para ver a través de su garganta e inserta con cuidado la aguja de sonda nasogástrica en su esófago. Si nota alguna alteración de la respiración, retire la jeringa y vuelva a intentarlo, ya que puede haber sido colocada en la tráquea. Una vez que esté seguro de que la aguja de sonda nasogástrica está en el esófago, extraiga lentamente el contenido de la jeringa.

Revisa al cuervo cada 30 minutos hasta que las heces teñidas de azul verdoso ya no se excreten. Los cuervos de prueba tardaron aproximadamente cuatro horas en dejar de excretar heces teñidas de azul. A continuación, agregue una parte de cerebro de ratón C 57 negro seis no infectado a cuatro partes de PBS estéril y algunas perlas de vidrio en una batidora de bala.

Homogeneizador: homogeneice la muestra durante uno a cinco minutos hasta que se logre la consistencia suave. Repita el proceso utilizando cerebros de ratón C 57 negros de seis cerebros de ratón infectados con R ML Chandler con una enfermedad terminal. A continuación, centrifugar el homogéneo a 3000 veces G durante un minuto.

Para eliminar las partículas más grandes. A continuación, retire el sobrenadante y dilúyalo con un volumen igual de XPBS estéril para generar un 10% de peso por volumen de materia cerebral. En PBS, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que las necesite 17 horas antes de la sonda nasogástrica.

Retire la comida, pero no el agua, de los corrales de los cuervos. Asigne aleatoriamente los cuervos en grupos de tratamiento y administre oralmente a cada cuervo con cinco mililitros de homogeneizado de cerebro de ratón recién descongelado, normal o infectado utilizando una aguja de sonda nasogástrica de dos pulgadas. A continuación, transfiera los cuervos a jaulas individuales.

Recoja y recoja todas las heces dentro de cada jaula a las cuatro horas después de la sonda nasogástrica. A continuación, homogeneice las heces agrupadas de cada cuervo en un homogeneizador de bala azul con perlas de vidrio hasta lograr una textura uniforme. Luego tome 500 microlitros de la mezcla y dilúyala de uno a 20 con 9,5 mililitros de centrífuga PBS estéril, el homogeneizado fecal diluido durante 15 minutos.

Agregue 1, 300 veces G y luego transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Para minimizar la amenaza de una infección microbiana secundaria, agregue una unidad de penicilina y un microgramo de estreptomicina por mililitro de homogeneizado. A continuación, sonique las muestras en un controlador de 3000 MP a una potencia de 70 durante 30 segundos para romper la membrana de los microbios restantes.

Primero, asigne aleatoriamente los ratones a uno de los cuatro grupos que se muestran aquí. El grupo uno recibirá heces de cuervo infectadas. El grupo dos recibirá heces de cuervo no infectadas.

El grupo tres recibirá cerebro de ratón infectado y el grupo cuatro recibirá cerebro de ratón normal. Luego, para los grupos MN uno y dos, extraiga un mililitro de las heces de cuervo positivas o negativas rasposas. Homogeneizar con una aguja de calibre 25 según el número de grupo del ratón.

A continuación, agarra el pelaje dorsal del cuello con el pulgar y el índice y gíralo suavemente para exponer el lado ventral. Eleva el extremo posterior del ratón para que su cabeza quede ligeramente más baja.

Inserte la aguja un centímetro a través de la piel, un centímetro lateral de la línea media y uno o dos centímetros antes de la articulación sacroilíaca. A continuación, tire ligeramente hacia atrás e inyecte el homogéneo lentamente en la cavidad del cuerpo del ratón. A continuación, prepare el homogeneizado de cerebro de ratón congelado con y sin scrappy para inyectarlo en los animales de los grupos tres y cuatro.

Diluyendo primero las mezclas de caldo de haws de uno a 10 con PBS estéril. A continuación, inyecte un mililitro del homogeneizado cerebral positivo rasposo diluido en los ratones del grupo tres y un mililitro del homogeneizado cerebral negativo rasposo diluido en los ratones. En el grupo cuatro.

Monitoree a los ratones diariamente hasta que expresen signos clínicos de raspadura en ratones. Los signos clínicos pueden incluir cifosis, ataxia, cola rígida, falta de acicalamiento, emaciación y letargo. Puntúe mi diario para cada uno de los seis signos clínicos.

Cuando los signos visibles son evidentes. Cero significa que no hay signos visibles. Uno es igual a moderado y dos es igual a un nivel severo de un signo.

Sacrificar ratones cuando las puntuaciones diarias totales para cada signo, alcancen mayor o igual a ocho durante un día mayor o igual a seis de forma continua durante tres días o a los 365 días. Después de la inoculación, extraiga cerebros inmediatamente después de la eutanasia y guárdelos a menos 80 grados centígrados. A continuación, deseche adecuadamente los cadáveres para confirmar un diagnóstico rudimentario.

Descongele los cerebros de ratón congelados y homogénelos individualmente en un homogeneizador de bala azul con perlas de vidrio hasta lograr una textura uniforme. A continuación, prepare 125 microlitros de una solución de digestión de proteinasa K combinando 109,39 microlitros de PBS con 12,5 microlitros de EDTA de 500 milimolares a pH ocho y 3,1 microlitros de una solución de proteinasa K de 50 microgramos por mililitro. Luego agregue tres microlitros de la solución de digestión a 17 microlitros de cerebro. Homogeneizado.

Incubar las muestras a 45 grados centígrados en un bloque de calor agitado durante 30 minutos. Una vez finalizada la incubación, inactive la solución de digestión añadiendo ocho microlitros de tampón de carga de páginas SDS, e incube las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, cargue los ejemplos en una página 12%SDS.

El gel electroforesa las proteínas y transfiere el gel a una membrana de PVDF IMON Una vez transferido, bloquee la membrana de PVDF con leche desnatada al 5% en PBS con 0,2% entre 20 y roca durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, pruebe la membrana con borrow 224 y anticuerpo monoclonal IPRP conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida de uno a 20.000 en superbloque y roca durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación. Enjuagar la membrana durante una hora en PBS con 0,2%entre 20.

Visualice las proteínas incubando la membrana con sustrato quimioluminiscente durante cinco minutos. A continuación, se obtienen imágenes de la membrana en un sistema de documentación de gel G box. Los ratones enfermos se identificaron por la manifestación de signos clínicos de rasposidad en ratones y la confirmación de la enfermedad se completó con análisis de sangre occidentales.

Aquí se muestra el cerebro de ratón normal, homogéneo y sin raspaduras, a la izquierda se ven dos carriles con y sin la ayuda de la proteasa K: Se ven tres curvas. Sin embargo, dado que la proteína normal es susceptible a las proteinasas, las curvas no se ven en el segundo carril. El carril tres muestra una muestra de control positivo rasposa digerida con proteasa.

Las proteasas provocan un desplazamiento en las tres bandas originales debido a la pérdida de los extremos n y c de las proteínas. Pero las proteínas infectadas no pueden ser digeridas completamente como lo eran en la muestra de cerebro normal. A la derecha se muestra el cerebro digerido con proteinasa K de un ratón inoculado con heces de un cuervo inoculado y confirma la presencia de priones en la muestra, ya que las bandas no se digieren.

Después de ver este video, tendrá una mayor comprensión de cómo documentar el paso de material priónico infeccioso a través del sistema digestivo de los cuervos. A continuación, verifique la infectividad con un bioensayo interperitoneal en ratones.