Name: Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprende a identificar priones infecciosos en heces de Corvus brachyrhynchos tras paso digestivo usando bioensayo en ratones y análisis de Western blot. Este método evalúa la transmisión de encefalopatías espongiformes.

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Nos gustaría dar las gracias a S. Werner para la prestación de los cuervos utilizados en este estudio y el USDA, APHIS, WS, NWRC personal de cuidado de los animales para el cuidado de los animales y la vigilancia. Mención o uso de un producto no implica aprobación USDA. Los fondos para este estudio fue proporcionado por la USDA, APHIS, Servicios Veterinarios.

Nuestro protocolo es una adaptación de una publicamos previamente 7. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA), Servicio de Inspección de Sanidad Agropecuaria (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Investigación de la Vida Silvestre (CNRH) Cuidado de Animales institucional y el uso. 1. Crow gavaging <ol><li> Estimar el tiempo de paso de la &quot;materia cerebral seudo &#39;a través del tracto digestivo de los cuervos americanos. <ol><li> Mezclar 5 ml de cocido y revueltos huevo entero con el tinte azul y sonda nasogástrica 1 cuervo usando un 2 en aguja de sonda (Figura 1). </li><li> Compruebe cuervo cada 30 minutos hasta que las heces de color azul / verde manchado ya no se excreta. </li></ol></li><li> Obtener infectados por RML (cepa Chandler) C57BL / 6 cerebros infectados y enfermos terminales de ratón. </li><li> Generar un 20% en peso / volumen normal y infectada homogeneizado de cerebro de ratón en un homogeneizador mezclador bala con 1xtampón fosfato salino (PBS) y cuentas de vidrio, luego se centrifuga a 3000 × g durante 1 min para eliminar las partículas más grandes. Eliminar el sobrenadante y diluir con un volumen igual de PBS 1x para generar un 10% en peso / vol, en PBS estéril. Congelación a -80 ° C hasta que se necesite. </li><li> 17 horas antes de la alimentación forzada a eliminar la comida, pero no el agua, a partir de plumas de gallo. </li><li> Aleatoriamente asignar cuervos a los grupos de tratamiento y alimentación forzada por vía oral cada cuervo con 5 ml de homogeneizado normal o infectado el cerebro de ratón usando un 2 en aguja de sonda. </li><li> Transferencia cante a jaulas individuales y recopilar y poner en común todas las heces dentro de cada jaula de 4 h después de la alimentación por sonda (Figura 2). </li><li> Homogeneizar heces agrupados para cada cuervo en un homogeneizador mezclador bala con perlas de vidrio hasta que se consigue una textura uniforme. * Heces Crow son en su mayoría líquidos y se pueden mezclar fácilmente. </li><li> Para cada cuervo, diluir 500 l de homogenado fecal en 9,5 ml de 1x PBS para un volumen total de 10 ml. </li><li> Centrifugar la homogena fecalTE durante 15 minutos a 1400 xg y extraer el sobrenadante. </li><li> Para reducir al mínimo la amenaza de una infección microbiana secundaria, el tratamiento de sobrenadante con 1 l de 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, NY) por cada 100 l de homogeneizado a continuación, colocar bajo luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reducir riesgo de contaminación viral y bacteriana. Después de la exposición UV, las muestras se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos 3000 Mp en el ajuste 70 durante 30 segundos para romper la membrana de los microbios restantes. </li></ol> 2. Inoculación de ratones <ol><li> Aleatoriamente asignar los ratones a los siguientes grupos de tratamiento (Tabla 1): <ol><li> Grupo 1 - ratones de tratamiento positivos inoculados por vía intraperitoneal (IP) con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml infectados cerebros de ratón. </li><li> Grupo 2 - Negativo ratones en tratamiento inoculados IP con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml cerebros normales de ratón. </li><li> Diluir infecteD y normal homogeneizado de cerebro de ratón para los Grupos 3 y 4 a 1:100 w / v en PBS 1x. </li><li> Grupo 3 - ratones de control positivos inoculados IP con 1 ml de infectada homogeneizado de cerebro de ratón. </li><li> Grupo 4 - ratones de control negativo inocularon ip con 1 ml de homogenado normal de cerebro de ratón. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Grupo de Tratamiento </td><td> Número de animales </td></tr><tr><td> Grupo 1 </td><td> Tembladera + Crow heces </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Grupo 2 </td><td> Tembladera - Crow heces </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Grupo 3 </td><td> Scrapie + ratón Cerebro </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Grupo 4 </td><td> Scrapie - Ratón Cerebro </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> . Cuadro 1 Estado de la tembladera de inóculo (+ positivo, negativo -) y el número de animales utilizados 7. <ol start="2"><li> Intraperitoneal inocular ratón: <ol><li> Ratón Scruff por dorsal piel del cuello con el pulgar y el dedo índice y suavemente gire para exponer la parte ventral. </li><li> Eleve extremo posterior del ratón para que la cabeza es ligeramente inferior. </li><li> Inserte la aguja 25 G 1 cm a través de la piel, 1 cm lateral de la línea media, y 1-2 cm por delante de la articulación sacroilíaca utilizando una jeringa con aguja de bloqueo. </li><li> Inyectar 1 ml inocular lentamente en la cavidad del cuerpo del ratón. </li></ol></li></ol> 3. Monitoreo Ratón <ol><li> Monitorear los ratones diariamente hasta que expresan los signos clínicos de la tembladera ratón. Los signos clínicos pueden incluir: cifosis, ataxia, cola rígida, falta de aseo, emaciación y letargo. </li><li> Puntuación ratones para cada uno de los 6 signos clínicos cuando los signos visibles son evidentes, donde 0 = ninguno visible, 1 = moderado, 2 = y severa. </li><li> La eutanasia a los ratones cuando las puntuaciones diarias totales para cada signo alcanzan ≥ 8 por 1 día, ≥ 6 continua durante 3 días, o 365 días después de la inoculación (dpi). </li><li> Cerebros cosecha inmediatamente después euthanasia y almacenar a -70 ° C. </li><li> Para confirmar un diagnóstico de la tembladera, digerir muestras de cerebro con 3 l de un 50 g / ml de solución de proteinasa K (PK) diluidas de la siguiente manera: 3.1. l de PK, 12,5 l de EDTA 500 mM, pH 8, 109.39 l de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, a continuación, inactivar la PK mediante la adición de 8 l de tampón de carga e incubando las muestras a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en un gel de SDS-PAGE al 12%, electroforesis y transferencia a membrana Immobilon PVDF y bloque con 5% de leche sin grasa en 0,2% de Tween 20 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la sonda con Bar224 anticuerpo monoclonal anti-PrP conjugado con peroxidasa de rábano picante, diluida en superbloque, durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague la membrana durante 1 hora con PBS-Tween 20 al 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min con sustrato quimioluminiscente y la imagen de un sistema de documentación de gel G-box. </li></ol>

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
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<li>Aldous, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Winter+habits+of+crows+in+Oklahoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Winter habits of crows in Oklahoma.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se demuestra un procedimiento para documentar el paso de material de PrP Res. través del sistema digestivo de cuervos. Se utilizaron los métodos convencionales para determinar si los cuervos tienen la capacidad de trasladar material de PrP Res a las áreas geográficas libres de la enfermedad. Otros han evaluado la resistencia de PrP Res a rumiantes y roedores 19-21 22,23 líquidos digestivos, los cuales no pudieron eliminarlo. Futura aplicación de estas técnicas debe ser aplicad...

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades infecciosas mortales neurodegenerativas que afectan a la vida silvestre, los animales domésticos y los seres humanos. El agente infeccioso de las EET parece ser isoformas mal plegadas o patógenos (PrP Res) de proteínas priónicas 1. Las EET animales incluyen la caquexia crónica (CWD) en el venado bura (Odocoileus hemionus), el venado cola blanca (Odocoileus virginianus), el alce (Cervus elaphus), y el alce (Alces alces), la tembladera en ovinos y caprinos; encefalopatía espongiforme bovina ( EEB) en bovinos domésticos; encefalopatía transmisible del visón en el visón de criadero; encefalopatía espongiforme felina en gatos; exótica encefalopatía espongiforme de ungulados exóticos en zoológico rumia de la familia de los bóvidos, y la encefalopatía espongiforme en los primates no humanos 8. La enfermedad TSE humano único, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante, es raro y pensado para ser adquirida por el consumo de PrP Res-contamialimentos ATED 9. Del mismo modo, la EEB puede infectar a los seres humanos si carne contaminada se consume 10. De todas las enfermedades EET, la tembladera y la caquexia crónica son los dos únicos con las epidemias y las fuentes de infección autosostenibles se supone que son de un animal a 2,3,11, así como de fuentes ambientales 4-6. La investigación sugiere que la mayoría de las EET requieren períodos de incubación prolongados notables de eventos de exposición naturales de materiales PrP Res a la manifestación de signos clínicos 2-4,6,8 y barreras de las especies aparentes minimizar, pero no eliminan la posibilidad de que, la transmisión entre 12-14 . Identificar mecanismos para la difusión de la (PrP Res) Material prión infeccioso es extremadamente importante para responder a las preguntas acerca de cómo las EET se mueven a través del paisaje. Las investigaciones experimentales han sugerido que los insectos 15,16, aves de corral y cerdos 17, y cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos) 7,18 son portadores pasivos o dispersores de material PrP Res. La aprobación de material de PrP Res a través del sistema digestivo de los cuervos se ha documentado recientemente, lo que demuestra el papel que pueden desempeñar en la dispersión de las EET 7. Estos resultados hacen que sea posible que los cuervos, un carroñero, podrían encontrar, consumen, y transportan material infeccioso a través de las heces de depósito, a las zonas libres de la enfermedad. Los procedimientos demostramos aquí se utilizan para documentar el paso de material PrP Res a través del sistema de digestión de los cuervos y facilitará en gran medida la aplicación de estos métodos para otro carroñero y modelos específicos de especies de carnívoros en futuras investigaciones relacionadas. En este estudio se utilizaron métodos convencionales para investigar un medio no convencional de la trata de material PrP Res, que podría contribuir a la difusión y la carga total de material de PrP Res.

<table><tbody><tr><td>RML Cepa Chandler tembladera adaptada al ratón</td><td>Laboratorios de las Montañas Rocosas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC57BL/6 ratones</td><td>Hilltop Lab Animales Cuervos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>americanos</td><td>capturados</td><td></td><td></td>salvajes</tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado Salina</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa-K solución Roche</td><td></td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carga</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007 y 0009</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris SDS PAGE 12% gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>1SEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Bullet mezclador homogeneizador</td><td>Braintree Scientific</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>2.3 mm Perlas de circonio/sílice</td><td>Productos BioSpec</td><td>11079125Z</td><td></td></tr><tr><td>Bar224 anticuerpo monoclonal anti-PrP</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009035</td><td></td></tr><tr><td>Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37517</td><td></td></tr><tr><td>sustrato quimioluminiscente</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>G-box sistema de documentación de gel</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

procedimientos para la identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Priónica infecciosa (PrP Res) material es probablemente la causa de la fatal neurodegenerativa encefalopatía espongiforme transmisible (EET) enfermedades 1. La transmisión de las EET, como la caquexia crónica (CWD), se presume que es de un animal a 2,3, así como de fuentes ambientales 4-6. Los carroñeros y carnívoros tienen potencial para trasladar material de PrP Res a través del consumo y la excreción de carroña CWD-contaminada. Trabajos recientes han documentado el paso de material PrP Res a través del sistema digestivo de los cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un carroñero norteamericano común 7. Se describen los procedimientos utilizados para documentar el paso de material PrP Res través de cuervos americanos. Cuervos fueron alimentadas por sonda con RML-tembladera cepa adaptada a ratón y sus heces se recogieron 4 h después de alimentación forzada. Crow heces fueron reunidas después y se inyectaron por vía intraperitoneal enC57BL / 6 ratones. Los ratones fueron controlados diariamente hasta que expresaron los signos clínicos de la tembladera de ratón y se sacrificaron a partir de entonces. Ratones asintomáticos fueron monitoreados hasta 365 días después de la inoculación. Se realizó un análisis de Western blot para confirmar el estado de la enfermedad. Los resultados revelaron que los priones infecciosos permanecen después de viajar a través del sistema digestivo de cuervos y están presentes en las heces, causante de la enfermedad en los ratones de prueba.

Los procedimientos utilizados demuestran que el sistema digestivo de cuervos no elimina la PrP Res. infectividad 4 horas después de la alimentación forzada oral de homogeneizado de cerebro tembladera 7. Los veinte cuervos que fueron alimentadas por sonda con material de PrP Res transmiten posteriormente el material PrP Res vía heces a los ratones. Ratones enfermos se identificaron por la manifestación de signos-ratón de tembladera clínicos y la confirmación de la enfermedad se...

Los carroñeros tienen potencial para trasladar infecciosas priones de encefalopatía espongiforme transmisible en sus heces a las zonas libres de la enfermedad. Nos detalle los métodos utilizados para determinar si priones de scrapie adaptados-ratón permanecen infecciosa después del paso a través del tracto digestivo de cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un consumidor común de animales muertos.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

El objetivo general de este procedimiento es documentar el paso del material infeccioso PreOn a través del sistema digestivo de los cuervos americanos. Esto se logra midiendo primero a los cuervos con material infeccioso PreOn. El segundo paso es recolectar las heces de cuervo durante cuatro horas después de la sonda nasogástrica y prepararlas para inyectarlas en ratones.A continuación, los ratones se inoculan intraperitoneal con un mililitro de homogeneizado fecal de cuervo. El paso final es monitorear a los ratones diariamente hasta que expresen signos clínicos de rasposidad en ratones. En última instancia, el análisis de Western blot se utiliza para confirmar la presencia de PreOn infeccioso en el modelo de ratón y verificar la transmisión de la enfermedad.La idea de que los cuervos podían transportar. CWD llegó a nosotros un día de invierno cuando, después de conducir a una instalación de alces en cautiverio donde estábamos haciendo una investigación y vimos alces atropellados siendo alimentados por cuervos, y más tarde ese día, cuervos que salían del cielo de la nada, aterrizando en estos comederos, alimentándose justo al lado del alce, defecando en el grano que los alces esta

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

A continuación se describe un ensayo de novela de Vigilancia de la aceptación de priones y el tráfico por las células inmunes inmediatamente después de la inoculación intraperitoneal de purificación y el etiquetado fluorescente barras de agregados de priones a partir de material cerebral infectado entonces el seguimiento de su consumo y el movimiento del punto de inyección y la caracterización de las células mediadoras de estos eventos.

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Este estudio describe el diagnóstico de la gripe aviar en aves silvestres con un portátil de RT-PCR sistema. El método tiene la ventaja de liofilizado reactivos para detectar las aves silvestres en un entorno ajeno al laboratorio, propio de un escenario de brote. Uso de herramientas moleculares ofrece alternativas precisas y sensibles para el diagnóstico rápido.

El diagnóstico rápido del virus de la influenza aviar en aves silvestres: El uso de un portátil de RT-PCR y reactivos liofilizados en el campo

Un método para preservar, detectar y secuencia de ARN del virus de la gripe aviar fue confirmada y ampliada usando colorantes naturales como muestras de heces de las aves. Esta técnica elimina la necesidad de mantener una cadena de frío y la manipulación de virus infecciosos y puede ser aplicado en un 96-así de alto rendimiento de la instalación.

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Este video muestra una técnica para detectar proteínas priónicas mal plegadas en secciones del cerebro utilizando inmunohistoquímica. Al tratar la sección del cerebro con ácido fórmico para desnaturalizar los priones y minimizar el riesgo de infección, así como al desenmascarar los agregados de priones mediante la recuperación de epítopos inducida por el calor, las secciones se inmunomarcan para los agregados de proteínas priónicas mal plegadas y se observan bajo un microscopio.

Detección de proteínas priónicas anormales en el tejido cerebral mediante inmunohistoquímica

Un protocolo clínico corto de la examinación se presenta para ayudar en la detección de tembladera clásica y anormal en ovejas y cabras.

Protocolo de examen clínico para detectar la tembladera atípica y clásica en ovejas

Medir la barrera a la transmisión entre especies de enfermedades priónicas es un desafío y generalmente implica desafíos con animales o ensayos bioquímicos. Aquí, presentamos un ensayo de conversión de proteínas priónicas in vitro con la capacidad de predecir barreras de especies.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Aquí presentamos un protocolo quirúrgico crear «loops ligados intestinales» en intestino de pollo. Este procedimiento permite la comparación de virulencia en situ en un único host de varias cepas de Clostridium perfringens . Este método disminuye marcadamente el número de pollos generalmente necesarios para experimentos similares en vivo .

Un modelo de asa Intestinal ligados en pollos libre anestesiados patógenos específicos para el estudio de virulencia de Clostridium Perfringens

El inmunomarcaje de proteínas priónicas anormales mediante protocolos inmunohistoquímicos requiere metodologías específicas de preparación de muestras y anticuerpos anti-PrP. El presente protocolo describe los pasos clave en el desenmascaramiento de epítopos para garantizar un inmunoetiquetado adecuado de PrP y minimizar la tinción de fondo no específica. Además, este enfoque considera medidas de bioseguridad al realizar estudios inmunohistoquímicos con los tejidos infectados por priones.

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Falta un método para evaluar las áreas de uso común en entornos de laboratorio para detectar la contaminación priónica y una descontaminación efectiva. El protocolo descrito aquí proporciona los fundamentos clave para implementar una prueba de deslizamiento de seguridad priónica de laboratorio que se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades individuales de laboratorios específicos.

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Aprende a identificar priones infecciosos en heces de Corvus brachyrhynchos tras paso digestivo usando bioensayo en ratones y análisis de Western blot. Este método evalúa la transmisión de encefalopatías espongiformes.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

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