Enriquecimiento Y Purga De Células Madre Embrionarias Humanas Por La Detección De Antígenos De Superficie Celular Utilizando Los Anticuerpos Monoclonales TG30 Y GCTM-2

El objetivo general de este procedimiento es clasificar los subconjuntos de células madre embrionarias humanas por su unión al antígeno de superficie celular de los dos anticuerpos monoclonales TG 30 y GC TM. Esto se logra disociando primero los cultivos de células madre embrionarias humanas o HESC en suspensiones de células individuales. En el segundo paso, los HESC se tiñen con los anticuerpos monoclonales, TG 30 y GCTM dos.

Finalmente, las células se separan mediante clasificación celular activada por fluorescencia y se devuelven al cultivo. En última instancia, la capacidad de formación de colonias de las células clasificadas se puede evaluar mediante citometría de flujo y microscopía de contraste de fase. La imagen principal de esta técnica sobre los métodos existentes, como la observación visual, es que proporciona una medida objetiva de la pluripotencia célula por célula para un gran número de células, y esto facilita la separación de las células madre embrionarias de las células diferenciadas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la pluripotencia, como la forma en que los cambios en las condiciones de cultivo afectan cuantitativamente a diferentes líneas de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas por humanos. Para hacer una suspensión de una sola célula de Hess, comience aspirando los medios de cultivo de Hess a partir de dos matraces T 75 que contienen una línea celular de Hess cultivada. Lave cada matraz con 10 mililitros de DPBS y luego incube cada cultivo con tres mililitros de solución de disociación expresada triple E a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Después de cinco minutos, golpee el costado del matraz para desalojar las células y luego confirme el desprendimiento bajo el microscopio. A continuación, añada 10 mililitros de medio de cultivo en frío a cada matraz con una pipeta estéril de 10 mililitros. Tritrate suavemente las células disociadas varias veces contra la pared del matraz para lograr una suspensión predominantemente de una sola célula.

Ahora agrupe las suspensiones de células individuales de Hes a través de un filtro de células de 70 micras en un tubo de polipropileno estéril de 50 mililitros para teñir los antígenos de superficie de las células de Hess. En primer lugar, Eloqua colocó alrededor de 100.000 células en 150 microlitros de medios en cada uno de los seis tubos de microcentrífuga de control de 1,5 mililitros. A continuación, incubar los tubos de control y el resto de la muestra con los anticuerpos primarios de interés en volúmenes de reacción finales de 200 microlitros y unos nueve mililitros respectivamente en medios de cultivo, incluidos los controles de isotipo.

Coloque los tubos horizontalmente sobre hielo y mézclelos suavemente durante 30 minutos en una plataforma mecedora. Después de centrifugar las células, desechar el sobrenadante y luego lavar la muestra de clasificación en 20 mililitros de medios de cultivo en frío y las muestras de control en 200 microlitros del mismo. Ahora incube la muestra de clasificación en un volumen final de 2,5 mililitros con los anticuerpos secundarios apropiados en medios de cultivo en frío y los controles en un volumen final de 200 microlitros del mismo agregue el anticuerpo PE anti-US CD 90.2 recién preparado al tubo de control apropiado en este momento también.

Una vez más, mezcle suavemente los tubos horizontalmente sobre hielo durante 30 minutos sobre una plataforma mecedora. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender la muestra de clasificación en 20 mililitros de medio de cultivo en frío y los controles en 200 microlitros y lave las células dos veces en el medio. Resuspender la muestra en dos o tres mililitros de medio de cultivo en frío suplementado con yoduro de propidio y cada uno de los controles, excepto las células no teñidas, en 300 microlitros del mismo.

A continuación, cuele cada suspensión celular individual a través de un filtro de celdas con tapa de 35 micras acoplado a tubos de ensayo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros y centrifugue los tubos para forzar cualquier suspensión celular residual en las tapas del filtro hacia los tubos. A continuación, golpee los lados de los tubos para volver a suspender cada suspensión de una sola célula y colocar las células en hielo. Configure el citómetro de flujo para la clasificación de células activadas por fluorescencia TG 30 GCTM dos de modo que las suspensiones de células de Hess disociadas se conecten como células individuales para eliminar posibles agrupaciones y dobletes.

A continuación, elimine los posibles residuos con las puertas de dispersión frontal y lateral para que solo se clasifiquen las celdas intactas. A continuación, excluya las células no viables en función de su expresión de yoduro de propidio. Excluir los fibroblastos embrionarios de ratón o las células alimentadoras de metanfetamina mediante una selección negativa basada en su expresión de CD 90.2 pe de ratón.

Ajuste la TG 30 G CTM dos pasos negativos de acuerdo con la autofluorescencia de fondo para las células no teñidas y también los controles de isotipo. La fracción HESC viable aislada libre de alimentadores de metanfetamina puede finalmente fraccionarse en TG 30 GCT M, dos TG 30 negativos, GCT M bajo, dos TG 30 bajos, GC TM medios, dos GCTM medios y TG 30 altos, dos subpoblaciones GCTM altas. Después de configurar el citómetro de flujo, agregue un mililitro de medio acondicionado con metanfetamina a cada uno de los dos tubos de ensayo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros y colóquelos en hielo.

A continuación, recupere 400.000 células de cada una de las subfracciones diferenciadas TG 30 GC negativas, TM dos negativas y las pluripotentes TG 30 high GCTM, dos subfracciones de células altas. Después de girar los tubos de recolección, suspenda cada pellet de celda en un mililitro de medio acondicionado MEF preequilibrado. A continuación, siembre un matraz T 75 de densidad MEF preequilibrado con el HESC de cada fracción en medios acondicionados con metanfetamina, incube los cultivos celulares a 37 grados centígrados con un 5% de CO2, refrescando el medio diariamente durante aproximadamente dos semanas.

Los cultivos de TG 30 pluripotentes con GCTM de alto rango, dos celdas de alto rendimiento muestran colonias humanas en forma de tallo después de una semana y alcanzan alrededor del 80% de fluidez en el campo de los nueve a 11 días. Los cultivos de TG 30 negativo para GC TM, dos células negativas crecen principalmente como un césped de fibroblastos similares a células que alcanzan la cofluidez a los 11 a 13 días. La detección combinada de los antígenos de superficie celular TG 30 y GC TM dos permite la discriminación de una serie de subconjuntos celulares en la etapa pluripotente y en varias etapas de diferenciación temprana de HESC como lo indica su expresión de marcadores de células madre y factores de transcripción específicos del linaje de acuerdo con informes anteriores, el TG 30 GC TM dos negativos bajos, Las subfracciones medias y altas se pueden discriminar dentro de la célula madre embrionaria humana macho una línea utilizada para este estudio aquí, los porcentajes de las diferentes subpoblaciones cerradas típicas de un análisis de citometría de flujo TG 30 GCTM dos se muestran en el experimento que se muestra aquí.

Un número definido de células TG 30 GCT M negativas dos células negativas se cultivaron consecutivamente después de la clasificación durante aproximadamente dos semanas, y luego se recurrió a recolectar solo la fracción TG 30 GCT M negativa dos células negativas antes de la resiembra. En cada paso, los resultados indican que la subfracción inicial TG 30 gct M dos negativas enriquece para TG 30 GCT M negativo dos células diferenciadas negativas después de un empaquetamiento consecutivo. Se detecta una población menor de TG 30 de alto GCT M de dos células altas en el paso inicial, pero finalmente desaparece con un empaquetamiento adicional que deja solo muestras libres de células madre pluripotentes.

Aquí se muestra la morfología típica del césped de TG 30 GCT negativo diferenciado M dos células negativas después de 14 días. Nótese que las colonias esporádicas similares a HESC observadas después de 14 días se entremezclaron con el TG 30 negativo GC TM, dos células negativas que probablemente son generadas por el contaminante TG 30 alto GCT M, dos células altas. Tenga en cuenta que esto solo ocurre en raras ocasiones y en el pasaje inicial posterior a los hechos basado en observaciones previas con este ensayo, se espera que la recolección y el cultivo de TG 30 alto GCTM dos células altas se enriquezcan para la formación de colonias de HSC pluripotentes.

Por lo tanto, también se investigó el empaquetamiento consecutivo de dos celdas de alto GCTM TG 30 pluripotentes después de la clasificación por citometría de flujo en estos cultivos representativos, las celdas se clasificaron por fax utilizando TG 30 y G CT M dos, reemplazando solo las TG 30 de alto G CTM dos celdas altas en cada paso. De esta manera, se observó que la mayoría de las células se localizaban en las subfracciones asociadas a la pluripotencia, lo que indica una población enriquecida de células pluripotentes que además mantiene una capacidad para diferenciar y regenerar un pequeño porcentaje de TG 30 G CTM negativo y dos células negativas. Además, los cultivos consecutivos de TG 30 de alta G CTM con dos células de alta clasificación exhiben un gran número de colonias similares a HESC después del paso, lo que también indica el mantenimiento del estado de pluripotencia.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar calibrar la máquina de fax antes de usarla cada vez para garantizar la reproducibilidad de los resultados después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como los microarrays, la secuenciación del genoma completo o los teratomas para responder a preguntas como ¿son estas células realmente pluripotentes tras su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las células madre pluripotentes inducidas exploraran la seguridad y estabilidad de estas células en comparación con las células madre embrionarias humanas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y teñir cuidadosamente cultivos mixtos de células madre enbr humanas para enriquecer las células periet. No olvide que trabajar con células humanas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y trabajar con la clase dos en el gabinete de seguridad mientras se realiza este procedimiento.