Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

El objetivo general del siguiente experimento es identificar las interacciones entre diferentes microbios que están mediadas por compuestos secretados y conducen a cambios en la expresión génica bacteriana. Esto se logra mediante el cultivo de una cepa bacteriana que contiene un reportero transcripcional fluorescente con microbios ambientales como colonias en placas de Petri de agar. Los círculos naranjas representan colonias de microbios ambientales.

Mientras que los círculos azules son colonias del reportero, el crecimiento en medios sólidos permite que los metabolitos que producen estas colonias se difundan a través del agar y activen la expresión génica en las colonias reporteras cercanas. Los impactos potenciales indicados aquí con las estrellas son aquellas colonias que pueden estar secretando compuestos que alteran la expresión génica en el reportero. Estos organismos se aíslan de las placas cribas de cocultivo.

Estos posibles inductores se vuelven a probar en un cribado secundario para confirmar que eran los organismos que secretaban moléculas que alteran la expresión génica bacteriana en el reportero. Aunque este método proporciona información sobre las interacciones formadoras de biopelículas de los bacilos sutiles con los organismos del suelo, también se puede aplicar a otros sistemas, como las interacciones microbianas que afectan la expresión de virulencia en especies de estafilococos o pseudomonas. De hecho, teóricamente se puede aplicar para identificar interacciones microbianas que alteran la expresión génica de cualquier reportero en cualquier microbio genéticamente tratable Después de generar construcciones de reporteros fluorescentes para su organismo de elección, de acuerdo con el protocolo de texto, recoja la tierra eliminando los 0,5 centímetros superiores de la superficie expuesta del suelo antes de usar una espátula para recolectar la tierra y los tubos cónicos, Agregue 0.85% de solución salina estéril en una proporción de 10 mililitros por gramo de tierra para hacer una lechada de suelo y vórtice durante un minuto para desalojar las bacterias de las partículas del suelo.

Después de dejar que la lechada del suelo se asiente durante un minuto, transfiera la capa acuosa superior a un tubo nuevo, diluya el reportero y las muestras de suelo de acuerdo con el protocolo de texto y coloque 50 microlitros de cada uno en el centro de las placas de cribado de cocultivo en condiciones que no activen la construcción del reportero por sí sola. También coloque una muestra de suelo sola y un reportero solo como controles. Agregue aproximadamente 23 milímetros de cuentas de vidrio estéril en cada placa y extienda las células manteniendo las placas en la mesa de trabajo y agitándolas de un lado a otro.

Mientras gira hasta que se absorba el líquido, voltee las placas y deseche las perlas en un vaso de precipitados de desecho que contenga etanol. Después de incubar las placas de cocultivo usando fluorescencia y comenzando desde la parte superior de la placa, mueva lentamente la placa hacia adelante y hacia atrás a través del campo de visión hasta los puntos brillantes. Después de un barrido completo, gire el plato 90 grados y repita el proceso.

Cuando se detecte una mancha fluorescente, encienda lentamente la iluminación de campo claro y determine si la fluorescencia está asociada con una colonia bacteriana. Aislar organismos inductores putativos, que serán las colonias no fluorescentes proximales a las colonias fluorescentes. Colócalos en el centro del campo de visión y accesibles con tu mano dominante, dejando la lámpara fluorescente encendida.

Encienda lentamente Brightfield para identificar por la forma y la posición de la colonia fluorescente y los organismos inductores circundantes Con una varilla de vidrio, tome una punta de carga de gel redonda estéril de 200 microlitros y sujétela como un lápiz. Apoye la palma exterior de la mano contra el escenario para estabilizarlo en la superficie de trabajo. A continuación, coloque la otra mano en el lado interior del pulgar de la mano para estabilizar la herramienta de recogida, manteniendo la punta de la pipeta por encima de la superficie de la placa.

Muévelo al campo de visión y céntralo por encima de la colonia que te gustaría elegir. La punta estará fuera de foco. Con el borde exterior de la mano, gire lentamente la punta de la pipeta hacia la colonia que se va a recoger.

Tóquelo muy ligeramente tratando de minimizar cuántas otras colonias entra en contacto con la punta sin girar la herramienta de recogida. Coloca la punta en una sección de un plato nuevo. Después de elegir las colonias, incube las placas de acuerdo con las pautas del ensayo.

Cuando las colonias son visibles, use un estereoscopio para determinar si uno o varios tipos de organismos están creciendo en la placa y recoja cada tipo de morfo en una placa fresca e incube hasta que crezca. Para probar si los supuestos inductores son verdaderos inductores, prepare el césped de las cepas parentales reporteras y no fluorescentes. Después de que las placas se sequen, use palillos de dientes estériles para recoger células de las colonias de prueba.

Parche en una placa en blanco y luego en las dos placas de césped. Alternativamente, resus, suspender los organismos inductores putativos en un mililitro de medio líquido en un veterinario de plástico estéril y medir el OD 600 de las suspensiones después de normalizar el OD de cada suspensión para llegar a un OD 600 de 0,5 puntos, un microlitro de cada suspensión en cada una de las tres placas. Finalmente, después de permitir que los organismos crezcan, use fluorescencia bajo un microscopio de disección para identificar los organismos inductores putativos que activan la cepa reportera fluorescente, pero no la cepa de control parental.

En este caso, el cribado se utilizó para identificar organismos del suelo que secretan compuestos que alteran la expresión génica de un componente estructural de la matriz de la biopelícula en sutiles b utilizando un reportero transcripcional fluorescente. Idealmente, cada placa de cocultivo debe contener una proporción de uno a uno de colonias reporteras a suelo que sean colonias individuales muy espaciadas. Aquí ilustramos cómo tener una alta proporción de colonias reporteras mostradas como círculos azules en relación con las colonias de suelo mostradas como círculos marrones aumenta la confianza en la identificación del organismo inductor real a partir de placas de cocultivo.

Los organismos inductores del suelo secretan compuestos que activan el reportero. Se inducirán múltiples colonias reporteras en la placa, con la mayor proporción de reporteros a suelo, lo que facilitará la identificación de los verdaderos inductores que se muestran en rojo a partir de otros supuestos inductores indicados por las estrellas. El contenido de nutrientes controla el grado de formación de colonias de crecimiento, mientras que la dilución del inóculo determina si las colonias resultantes se dispersan adecuadamente.

Como se ve en este cocultivo, la imagen B sutiliza produce una matriz de biopelícula fluorescente en respuesta a numerosos microbios del suelo. Para los suelos que examinamos, tuvimos una alta tasa de aciertos para el reportero de la matriz Ptap A YFP. Esto contrasta con nuestros resultados no publicados de pantallas análogas.

Usando la esporulación y la competencia, los reporteros fueron pocos o ningún impacto, se identificaron. Por lo tanto, las tasas de IH para los diferentes tipos de células son muy variables y pueden ser difíciles de predecir con anticipación. A continuación se muestran dos ejemplos de placas de cribado de cocultivo antes y después de que se hayan seleccionado las colonias potencialmente inductoras para su aislamiento.

Aquí se muestran los resultados negativos y positivos tanto del método de parche como del método puntual, y aproximadamente el 50% de las colonias examinadas en nuestro cribado secundario son verdaderos positivos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder a preguntas adicionales, por ejemplo, la secuenciación de ADN SR de 16 s para determinar la identidad filogenética del organismo inductor, o el uso de espectrometría de masas por HPLC en RMN para determinar la identidad química del compuesto activo.