Name: Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a generar xenoinjertos ortotópicos primarios de glioma en ratones inmunocomprometidos para estudiar el crecimiento infiltrativo y las mutaciones de IDH. Este modelo preclínico conserva las características moleculares del tumor humano.

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Estamos particularmente en deuda con los pacientes del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt que proporcionaron material de investigación invaluable para el Banco de Tejido Neuroquirúrgico Molecular. Agradecemos a aquellos que establecieron y mantienen el Banco de Tejidos, Reid C. Thompson MD (investigador principal), Cherryl Kinnard RN (enfermera de investigación) y Larry A. Pierce MS (gerente). Los servicios histológicos fueron realizados, en parte, por el Recurso Compartido de Patología Traslacional del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (VUMC) (apoyado por el premio 5P30 CA068485 al Centro Oncológico Vanderbilt-Ingram). Este trabajo fue apoyado por subvenciones a MKC del NINDS (1R21NS070139), el Fondo Burroughs Wellcome y los fondos de desarrollo VMC. MKC cuenta con el apoyo del Departamento de Asuntos de Veteranos, Administración de Salud de Veteranos, Oficina de Investigación y Desarrollo, Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos a través de la subvención 1 I01 BX000744-01. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos o del Gobierno de los Estados Unidos.

1. Preparación de la suspensión de células tumorales
Nota: Las aprobaciones institucionales apropiadas para el uso del material paciente y de los animales se requieren para establecer y para mantener xenoinjertos ortotopic primarios de la glioma. En el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, el material tumoral resecado que excede el requerido para fines de diagnóstico se recopila con el consentimiento del paciente para un repositorio de tejidos de investigación. Las muestras se etiquetan con un número de base de datos REDcap aleatorio de 5 dígitos y se eliminan todos los identificadores específicos del paciente. La base de datos REDcap contiene datos clínicos desidentificados para cada muestra en el repositorio de tejidos que incluyen el sexo, la edad (en años), la raza, el estado de supervivencia, la patología, los tratamientos contra el cáncer, el año de resección y el tiempo hasta la progresión. Para mantener esterilidad y optimizar el éxito del método primario del xenoinjerto, todos los reactivos, los instrumentos quirúrgicos vapor-autoclavados, y el sitio quirúrgico se deben ensamblar o preparar de antemano.
Nota: Los especímenes de glioma a menudo contienen grandes cantidades de mielina y escombros. Dependiendo del tamaño de la muestra, puede ser necesario utilizar más de 4 tubos de gradiente discontinuos para la eliminación adecuada de mielina y escombros.
Nota: El proceso se completa cuando no queda ningún tejido no disociado claramente visible, o poco. Evite la introducción de burbujas durante el proceso de trituración.
Nota: La viabilidad celular después de la disociación es típicamente >90%. Las viabilidades más bajas pueden reflejar muchas variables incluyendo la manipulación subóptima del tejido o el tiempo de transporte desde el quirófano, el método de criopreservación o la técnica de disociación de papaína. Sin embargo, las viabilidades celulares más bajas pueden seguir siendo adecuadas, siempre y cuando se pueda trasplantar un número suficiente de viables en el volumen apropiado. Por cada ratón, se implantan entre 50.000 y 200.000 células viables en volumen de 2 μl. Debido a la punta biselinada de la aguja de la jeringuilla, un adicional 5 μl de la suspensión de la célula se debería incluir en el volumen final para asegurarse de que el material adecuado se pueda dibujar en la jeringuilla para cada inyección. Por ejemplo, para inyectar 2 μl/ratón para 5 ratones el volumen final debe ser de 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
<ol><li>Coloque el material paciente recién resecado y desidentificado en un recipiente estéril y tapado sobre hielo para su transporte al laboratorio. Procesar la muestra directamente para su trasplante o criopreserva la muestra en nitrógeno líquido (ver más abajo) para su almacenamiento en nitrógeno líquido y su posterior uso.</li>
	<li>Prepare las soluciones de disociación de papaína (solución de papaína, solución inhibidora de lavado/proteasa y solución de gradiente discontinuo) en una campana estéril con los componentes del kit y las instrucciones suministradas por el fabricante. Etiquete los tubos cónicos estériles de poliestireno de 15 ml y distribuya las soluciones de la siguiente manera:<ul>
<li>Tubo 1: 5 ml de solución de papaína</li>
			<li>Tubo 2: 3 ml de solución inhibidora de lavado/proteasa</li>
			<li>Tubos 3-6: 5 ml cada uno de solución de gradiente discontinuo</li>
		</ul>
</li>
	<li>Coloque la muestra de glioma en el tubo 1 con 5 ml de solución de papaína y triturar con una pipeta de 5 ml durante un período de tiempo de 10-20 min.</li>
	<li>Pipetear el material hacia arriba y hacia abajo 10 veces y luego incubar el material durante 2-3 minutos a temperatura ambiente antes de iniciar el siguiente ciclo de trituración.</li>
	<li>Coloque la punta de la pipeta de 5 ml más cerca de la parte inferior del tubo cónico con cada ciclo de trituración de tal manera que la punta esté tocando la parte inferior del tubo durante los últimos 2 ciclos.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y pipetee el pellet hacia arriba y hacia abajo 10 veces en 3 ml de la solución inhibidora de lavado/proteasa.</li>
	<li>Cuidadosamente capa un volumen igual de la suspensión sobre cada una de las soluciones de gradiente discontinuo de 5 ml (tubos 3-6), con un pipeteador establecido a la velocidad de dispensación "gravedad".</li>
	<li>Coloque los tubos en una centrífuga equipada con un rotor de cubo oscilante, con la velocidad de aceleración reducida al ajuste más bajo y el freno apagado. Centrífuga a 76 x g durante 12 min a temperatura ambiente. Con el freno apagado, la centrifugación generalmente se completa después de 20 minutos.</li>
	<li>Retiramos el sobrenadante, resuspend y combinamos cada pellet en 5 ml de solución salina balanceada estéril y colocamos las células sobre hielo.</li>
	<li>Retire una porción (10-100 μl) de la suspensión celular y determine la densidad de células viables por exclusión de tripano azul con un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrífuga a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend el pellet celular a una densidad de 25,000-125,000 células viables por μl.</li>
	<li>Transferir un volumen adecuado de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 200 μl (tubo PCR) y colocarlo sobre hielo.</li>
</ol>2. Preparación del sitio quirúrgico y los instrumentos
Nota: Guantes quirúrgicos estériles se usan durante el procedimiento. Dependiendo de los requisitos de cada institución, se pueden requerir batas quirúrgicas, gorras y protectores faciales.
<ol><li>Prepare un banco desinfectado para la cirugía de roedores con áreas contiguas separadas para la preparación de animales, el campo operativo y la recuperación de animales.</li>
	<li>Esterilizar instrumentos quirúrgicos en un autoclave de vapor. Posteriormente, utilice un esterilizador de perlas calientes para flash-esterilizar instrumentos al hacer la transición de un animal sujeto a otro.</li>
</ol>3. Inducción, anestesia y analgesia
Nota: Las cirugías que exceden los 15 minutos desde el momento en que los ratones son anestesiados requieren una fuente de calor de contacto. Para prevenir la hipotermia, los ratones reciben una fuente de calor (manta de agua caliente circulante) durante los períodos pre y postoperatorio. 
<ol><li>Prepare un cóctel de ketamina/xilazina para la anestesia por inducción de manera que cada ratón reciba ketamina 100 mg/kg y xilazina 10 mg/kg inyectando 10 μl del cóctel por gramo de peso corporal.</li>
	<li>
Tabla 1. Cóctel de anestesia.
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">Concentración de existencias</td>
					<td colspan="3">Volumen para prepararse </td>
				</tr>
<tr>
<td>un ratón</td>
					<td>cinco ratones</td>
					<td>diez ratones</td>
				</tr>
<tr>
<td>ketamina</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>μl 125</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Xilazina</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2,5 μl</td>
					<td>μl 12.5</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Solución salina isotónica</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>μl 1.113</td>
					<td>2.225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">total</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1.250 μl</td>
					<td>2.500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Prepare la solución de ketoprofeno para la analgesia diluyendo la solución común (10 mg/ml) 1:20 en agua estéril y libre de piógenos de tal manera que cada ratón reciba una dosis de 5 mg/kg inyectando 10 μl de la solución por gramo de peso corporal.</li>
	<li>Pesar y registrar el peso prequirúrgico. Los pesos individuales de los ratones varían, pero generalmente oscilan entre 18 y 22 g.</li>
	<li>Inyecte 10 μl del cóctel de ketamina/xilazina por gramo de peso corporal del ratón en el espacio intraperitoneal con una jeringa de insulina. Por ejemplo, inyecte 200 μl para un ratón de 20 g.</li>
	<li>Determine si el ratón está completamente anestesiado por la pizca del dedo del pie de la pata trasera. Por lo general, toma 3-5 minutos para que el ratón ya no se retire del pellizco.</li>
	<li>Inyecte 10 μl de la solución de ketoprofeno por gramo de peso corporal del ratón por vía subcutánea en la piel suelta del flanco con una jeringa de insulina. Por ejemplo, inyecte 200 μl para un ratón de 20 g.</li>
	<li>Afeite el cabello sobre el cráneo con cortadoras, frote el cuero cabelludo expuesto con povidona-yodo usando un aplicador de punta de algodón y luego limpie una almohadilla de alcohol. Repita estos pasos, exfoliante de povidona y yodo y toallita con alcohol, dos veces más.</li>
	<li>Aplique ungüento oftálmico a los ojos del ratón.</li>
	<li>Haga una incisión de línea media de 1 cm que se extienda desde detrás de las orejas hasta justo delante de los ojos con una hoja de bisturí estéril.</li>
	<li>Coloque el ratón bajo un ámbito de disección y exponga el cráneo para identificar las líneas de sutura. Usando movimientos circulares con un taladro, centre un agujero de rebabas 2,5 mm lateral a la bregma y 1 mm posterior a la sutura coronal.</li>
</ol>4. Trasplante intracraneal
Nota: Los volúmenes de inyección superiores a 2,5 μl pueden ser letales para los ratones.
<ol><li>Coloque el ratón en un marco estereotáctico enganchando los incisivos superiores sobre la barra incisivo y aplicando la abrazadera de la nariz para que el cráneo se sostengan firmemente en una posición neutra.</li>
	<li>Extraiga 5-10 μl de las células en un tubo de microcentrífuga hacia arriba y hacia abajo varias veces en una jeringa Hamilton de 10 μl sujetada en el soporte de la sonda del manipulador estereotáctico para mezclar la suspensión y eliminar burbujas. Deprima el émbolo para que la jeringa se cargue con 2 μl (el volumen adecuado para inyectar un animal).</li>
	<li>Tire del borde lateral de la incisión de la piel para exponer el orificio de las rebabas y, con el micromanipulador, introduzca la aguja en el orificio de las rebabas para que la parte biselinada esté justo debajo de la superficie del cráneo.<ol>
<li>Avance la aguja 3 mm y luego retire la aguja 0.5 mm para crear un espacio para la inyección.</li>
			<li>Avance el émbolo lentamente durante 30 segundos y luego deje que la aguja permanezca en el cerebro durante 2 minutos adicionales. Retire la aguja gradualmente ascendiendo 0,5 mm y esperando 30 segundos adicionales antes de retirar la aguja del cerebro.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la herida con un autoclip.</li>
	<li>Coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal y controlar continuamente el patrón de respiración y el color de las membranas mucosas y los tejidos expuestos (plantas de los pies).</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula microisoladora estéril una vez que se recupere completamente de la anestesia (esternal y ambulatoria), y devuélvalo a la instalación de alojamiento de animales.</li>
</ol>5. Cuidado y observación de animales después de la implantación
Nota: La indicación más confiable del engraftment del tumor y del crecimiento infiltrativo es pérdida de peso gradual, continua acompañada por el desarrollo de la postura encorvada y de la capa áspera del pelo. En raras ocasiones, se observan déficits neurológicos que incluyen ataxia, paresia y convulsiones. Los xenoinjertos primarios ortotópicos son altamente invasivos y se desarrollan durante un largo período de tiempo. Los ratones suelen manifestar síntomas de crecimiento tumoral 3-6 meses después del trasplante.
<ol><li>Observe a ratones con xenoinjertos ortotópicos diariamente para la ingesta de alimentos y agua, el comportamiento, el acicalamiento y los signos de infección en el sitio de la incisión.</li>
	<li>Administrar ketoprofeno (5 mg/kg por vía subcutánea, 1-2 veces al día) si se observa dolor o angustia postoperatoriamente.</li>
	<li>Retire los autoclips 8-10 días después de la cirugía.</li>
	<li>Pesar ratones semanalmente.</li>
	<li>Vigile si hay muestras y síntomas del engraftment del tumor.</li>
</ol>6. Cosecha de tumores
Nota: Por este método, la primera rebanada coronal (#1) contiene el aspecto posterior de los bulbos olfativos y el aspecto anterior de los lóbulos frontales. El tumor injertado es el más abundante en el hemisferio correcto de las 3 rebanadas coronales subsecuentes (#2 de la rebanada, #3, y #4) y la vista de la inyección se contiene rutinario en la rebanada coronal #3. Dependiendo de las necesidades experimentales, el material se puede utilizar para el paso del tumor, secciones de tejido congelado, secciones de tejido incrustado de parafina fija de formol, citometría de flujo de tejido disociado, cultivo celular o lisatos para análisis de ADN, ARN o proteínas. Las porciones del tumor se pueden cryopreserved para las necesidades futuras con la viabilidad de la célula que se extiende de de 80-95%.
<ol><li>Euthanize ratones por la exposición prolongada al dióxido de carbono seguido por la dislocación cervical.</li>
	<li>Decapitar ratones eutanásicos en la base del cerebro (nivel de foramen magnum) con un par más grande de tijeras quirúrgicas, y tire de la piel de la incisión hacia adelante para exponer completamente el cráneo.</li>
	<li>Extirpar el cerebro.<ol>
<li>Inserte una punta de par de tijeras quirúrgicas finas en el aspecto lateral del foramen magno al nivel del meato auditivo externo izquierdo para cortar el hueso occipital a lo largo del lado izquierdo del cráneo. Realice el mismo corte en el lado derecho.</li>
			<li>Corte el hueso occipital a lo largo de un plano coronal de un meato auditivo externo al otro y retire el hueso para exponer el cerebelo.</li>
			<li>Corte las placas óseas nasales entre los ojos.</li>
			<li>Corte la sutura sagital cortando posteriormente a lo largo de la sutura sagital de las placas óseas nasales al bregma. Complete la incisión de la línea media a lo largo de la sutura sagital cortando anterior de la lambda a la bregma.</li>
			<li>Inserte cuidadosamente la punta de un par fino de fiórceps a lo largo de la abertura sagital a cada lado para romper cualquier adhesión dural del cráneo al cerebro y luego pelar las dos mitades del cráneo lateralmente para exponer el cerebro y los bulbos olfativos dorsalmente.</li>
			<li>Deslice las esrcepillas entre el aspecto ventral de los bulbos olfativos y el cráneo para liberar cualquier adherencia.</li>
			<li>Incline el cráneo hacia atrás para permitir que el cerebro se retraiga para que los nervios ópticos y otros nervios craneales estén expuestos. Cortar los nervios craneales para liberar el cerebro en un plato que contiene PBS estéril.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Transfiera el cerebro con una espátula de pesaje a una rebanadora de matriz y genere rebanadas coronales de 2 mm con cuchillas de afeitar.</li>
	<li>Coloque las rebanadas coronales en un plato que contenga PBS estéril para una inspección visual adicional y un mayor procesamiento de tejidos.</li>
</ol>7. Criopreservación tumoral
<ol><li>Preparar una solución común de medio de criopreservación.<ol>
<li>Añadir 50 ml de suplemento de proliferación, 5 ml de solución de penicilina y estreptomicina 100x, y 450 μl de heparina al 0,2% a 450 ml de medio basal.</li>
			<li>Guarde la solución común a 4 °C protegida de la luz.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de medio de criopreservación.<ol>
<li>Combinar 47,5 ml de medio de criopreservación y 2,5 ml de DMSO estéril en un tubo cónico de polipropileno de 50 ml y mezclar bien.</li>
			<li>Alícuota 1,0 ml de solución de trabajo a cada criovial y conservar a 4 °C protegido de la luz.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Coloque una rebanada coronal de 2 mm de cerebro xenoinjertado en un medio de criopreservación que contenga criopreservación sobre hielo.</li>
	<li>Tapar firmemente el vial y colocarlo en un recipiente de congelación a -80 °C. Transfiera el criovial al día siguiente a un tanque de nitrógeno líquido para un almacenamiento más largo.</li>
</ol>

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<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las líneas celulares cultivadas, los xenoinjertos y los ratones genéticamente modificados son los métodos más comunes para modelar gliomas, y existen distintos beneficios y limitaciones para cada sistema modelo3,13,14. Las ventajas relevantes de xenoinjertos ortotópicos primarios del glioma incluyen el crecimiento infiltrativo que tipifica gliomas difusos y la retención de alteraciones genéticas y de los mecanismos importantes de la señalización que pueden ser excesivamente difíciles de mantener en células cul...

Los gliomas malignos son tumores gliales primarios del sistema nervioso central que ocurren en el cerebro y ocasionalmente en la médula espinal. Los gliomas son clasificados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) según el parecido histológico con los astrocitos, oligodendrocitos o células ependimarias y luego se clasifican numéricamente (I a IV) por las características patológicas de la malignidad. Los subtipos histológicos más comunes son astrocitomas, oligodendrogliomas y oligoastrocitomas mixtos. Los gliomas malignos que abarcan los grados II a IV de la OMS se caracterizan por un crecimiento invasivo y una recalcitrante a las terapias actuales. Cada año en los Estados Unidos, aproximadamente 15,750 individuos son diagnosticados con un glioma maligno y se estima que 12,740 pacientes sucumben a esta enfermedad. Estas estadísticas destacan la naturaleza particularmente mortal de gliomas malas y la necesidad importante de la eficacia terapéutica aumentada.
Los modelos de cáncer son esenciales para investigar la biología y las terapias tumorales. Las variedades de células humanas del cáncer representan un primer paso importante para las manipulaciones ines vitro y los estudios in vivo del xenografting (xenoinjertos secundarios)1. Sin embargo, los cultivos celulares de cáncer estándar experimentan la transformación fenotípica y genotípica2-4 que puede no ser restaurada en xenoinjertos secundarios5. Además, las alteraciones genéticas como las mutaciones de la isocitrato deshidrogenasa(IDH)6,las distintas poblaciones de células madre7 y la dependencia de las vías de señalización clave8 pueden perderse en cultivos de células cancerosas. Los perfiles genómicos pueden mantenerse en mayor medida en el cultivo de la esfera del cáncer, aunque todavía no reflejan plenamente el genotipo de los tumores primarios2,3. El trasplante ortotópico directo niega las influencias del cultivo in vitro, proporciona un microambiente adecuado y preserva la integridad de las células iniciadoras de tumores9,10. Por lo tanto, los xenoinjertos primarios representan un modelo preclínico potente y relevante para probar rigurosamente agentes dirigidos para ayudar en el diseño racional de futuros ensayos clínicos5,11,12.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Solución de azul de tripano 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl</td><td>Obtenido de una farmacia institucional o de una empresa</td><td></td><td></td>local de suministros veterinarios</tr><tr><td>Xylazine HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ungüento oftálmico </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidona yodada </td><td>Fisher Scientific</td><td>190061617</td><td> </td></tr><tr><td> Suplemento de medio de criopreservación y proliferación </td><td>StemCell Technologies</td><td>05751</td><td> </td></tr><tr><td> 0.2% Sal sódica de heparina en PBS </td><td>StemCell Technologies</td><td>07980</td><td> </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td> </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6250-5X10ML</td><td> </td></tr><tr><td> NOD. Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ ratones </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td> NSG ratones </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-vimentina humana </td><td>Dako</td><td>M7020 <</td><td>p>Use 1:200 a 1:800</tr><tr><td> > Anticuerpo humano IDH1 R132H </td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td> Use 1:100 a 1:400 </td></tr><tr><td> Centrífuga con rotor de cangilón oscilante </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Pipetera con control de velocidad de dispensación </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Hemocitómetro desechable </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td> </td></tr><tr><td> Guantes quirúrgicos estériles </td><td>Fisher Scientific</td><td>11-388128</td><td> </td></tr><tr><td> Bata desechable </td><td>Fisher Scientific</td><td>18-567</td><td> </td></tr><tr><td> Quirúrgico mascarilla </td><td>Fisher Scientific</td><td>19-120-1256</td><td> </td></tr><tr><td> Jeringa de tuberculina </td><td>BD</td><<td>p>305620</td><td> </td></tr><tr><td> Alcohol </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246-073</td><td> </td></tr><tr><td> Báscula electrónica portátil </td><td>Fisher Scientific</td><td>01-919-33</td><td> </td></tr><tr><td> Zoom Microscopio estereoscópico </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Quirúrgica </td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td> </td></tr><tr><td> Mango de bisturí </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td> </td></tr><tr><td> Hojas de bisturí, #10 </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxico </td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td> </td></tr><tr><td> Taladro de alta velocidad </td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td> </td></tr><tr><td>Broca, Jeringa</td><td>514552</td><td></td> <td>de almacenamiento</td></tr><tr><td> de Hamilton </td><td>Hamilton</td><td>80336</td><td> </td></tr><tr><td> Autoclip, 9 mm </td><td>BD</td><<td>p>427630</td><td> </td></tr><tr><td> Almohadilla de calentamiento de agua circulante </td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700 TP-1215EA </td><td> </td></tr><tr><td> Esterilizador seco de perlas calientes </td><td>Kent Scientific</td><td>INS300850</td><td> </td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14101-14</td><td> </td></tr><tr><td> Tijeras finas </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14094-11</td><td> </td></tr><tr><td> Tijeras de resorte </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15018-10</td><td> </td></tr><tr><td> Pinzas de Dumont </td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11251-30</td><td> </td></tr><tr><td> Espátulas semimicro </td><td>Fisher Scientific</td><td>14374</td><td> </td></tr><tr><td> Matriz de corte de cerebro de ratón </td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS002-1</td><td> </td></tr><tr><td> Viales de almacenamiento criogénico </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-501</td><td> </td></tr></tbody></table>

xenoinjertos de glioma ortotópico primario recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa i

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos. Para modelar gliomas malignos de grado III e IV de la OMS en ensayos de trasplante, las células tumorales humanas se xenoinjerten en un sitio ortotópico, el cerebro, de ratones inmunocomprometidos. En contraste con los xenoinjertos secundarios que utilizan las células cultivadas del tumor, las células humanas de la glioma se disocian de especímenes resecados y se trasplantan sin el paso anterior en cultura del tejido para generar xenoinjertos primarios. El procedimiento en este informe detalla la preparación de la muestra del tumor, el trasplante intracraneal en ratones immunocompromised, la supervisión para el engraftment del tumor y la cosecha del tumor para el paso subsecuente en animales o análisis receptores. La preparación de células tumorales requiere 2 horas y el procedimiento quirúrgico requiere 20 min/animal.

Las células disociadas del glioma se trasplantan directamente en los cerebros de ratones immunocompromised para obtener líneas ortotopic primarias del xenoinjerto. A cada muestra de tumor se le asigna un número aleatorio antes del trasplante, como parte del proceso de desidentificación para eliminar la información de salud protegida. Utilizamos un número de base de datos REDcap de 5 dígitos para este propósito. La Figura 1 ilustra el proceso y la nomenclatura para establecer una línea de xenoinjerto desd...

Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos.

Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

El objetivo general de este procedimiento es generar glioma ortotópico primario, xenoinjertos para recapitular, características histopatológicas y moleculares de los subtipos de glioma maligno en modelos animales preclínicos. Esto se logra obteniendo primero muestras de tumores cerebrales humanos para trasplante directo. El segundo paso es preparar una suspensión celular a partir de la muestra.A continuación, las células tumorales se trasplantan al cerebro de un ratón inmunodeprimido. A continuación, se monitoriza el ratón receptor en busca de signos de tumor, injerto y crecimiento, y luego se extrae para su análisis o trasplante en serie. En última instancia, la histología, la secuenciación del ADN y otros ensayos moleculares se utilizan para mostrar el crecimiento tumoral infiltrativo y la retención de alteraciones genéticas, como las mutaciones de la citrato deshidrogenasa ISO.Los modelos animales preclínicos de cáncer son esenciales para investigar la biología y las terapias tumorales. La principal ventaja de los xenoinjertos de glioma primario sobre los métodos existentes, como los xenoinjertos secundarios de GLI, es que las células de glioma experimentan cambios genotípicos y

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Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior...

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

El cerebro es un sitio único con cualidades que no están bien representados por los análisis in vitro o ectópicos. Modelos ortotópico de ratón con la ubicación y características de crecimiento reproducibles se pueden crear de forma fiable con inyecciones intracraneales utilizando un instrumento de fijación estereotáxica y una bomba de inyección de baja presión.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

GL261 proporcionan un modelo animal inmunocompetente útil de glioblastoma. Los objetivos de este protocolo son demostrar las técnicas adecuadas para monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, y verificar la utilidad de las células GL261 modificadas con luciferasa para el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Este estudio presenta un método automatizado para generar organoides tridimensionales de glioblastoma derivados de pacientes utilizando un picador de tejidos. El método proporciona un enfoque adecuado y eficaz para obtener dichos organoides para pruebas terapéuticas.

Cultivo ex vivo de organoides de glioma derivados de pacientes con un picador de tejidos

Los gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 son tumores raros y difíciles de cultivar. Presentamos un método simple de explante no enzimático que preserva la expresión de la proteína mutante IDH1 y mantiene los cultivos durante meses. Es importante destacar que esta técnica funciona con tumores criopreservados, lo que ofrece un recurso valioso para la investigación del glioma.

Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

El desarrollo de modelos ortotópicos de tumores cerebrales pediátricos requiere una precisión meticulosa, utilizando un dispositivo estereotáxico para implantar células cancerosas con precisión. La metodología presentada aquí describe los pasos involucrados en la preparación de las células tumorales cerebrales, la realización de inyecciones intracraneales y la implementación de un sistema de monitoreo postoperatorio para evaluar el injerto de tumor cerebral.

Establecimiento de modelos ortotópicos de xenoinjertos derivados de pacientes para tumores cerebrales utilizando un dispositivo estereotáxico

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los investigadores una técnica altamente reproducible para las implantaciones intracraneales.

Implantación intracraneal estereotáctica de líneas celulares de xenoinjertos derivadas de pacientes con glioblastoma en ratones

Aprende a generar xenoinjertos ortotópicos primarios de glioma en ratones inmunocomprometidos para estudiar el crecimiento infiltrativo y las mutaciones de IDH. Este modelo preclínico conserva las características moleculares del tumor humano.

Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I (Video) | JoVE Journal

Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I

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