La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

El objetivo general del siguiente experimento es inducir eficazmente una respuesta de linfocitos T citotóxicos dirigida a un antígeno asociado al tumor en el cáncer de vejiga. Esto se logra mediante la inducción de cáncer de vejiga en ratones que expresan el antígeno mach uno asociado al tumor humano. A continuación, se inyecta una vacuna peptídica en los ratones y se genera una respuesta de linfocitos T citotóxicos específicos de Mach uno.

A continuación, se aíslan el tumor sérico y el bazo y se analizan los tejidos en busca de citocinas, antígenos y respuesta inmunitaria, respectivamente. El uso de Western blot multiplex, microperlas fluorométricas, inmunoensayo, inmunohistoquímica y un análisis de manchas en vivo nos permite probar la eficacia de una vacuna peptídica contra el cáncer de vejiga. Hola, soy el Dr. Gregory Wetz, científico investigador del Sistema de Salud Davis de la Universidad de California en Sacramento, California.

La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como los xenoinjertos, es que los xenoinjertos requieren huéspedes inmunocomprometidos, mientras que nuestro modelo utiliza un ratón transgénico inmunointacto que expresa un antígeno asociado a un tumor humano que es el objetivo de la vacuna peptídica. Demostrando las técnicas conmigo estarán Daniel V y los doctores Chaga y Audrey Gutiérrez, todos ellos colegas científicos investigadores, y el laboratorio del Dr. Michael de Gregorio y el Sistema de Salud de UC Davis. Antes de administrar la primera dosis de N butilo, N cuatro hidroxi, butil NITROSAMINA u O-H-B-B-N para inducir cáncer de vejiga, realice una hemorragia submandibular en cada ratón para recolectar sangre entera y tubos de coagulación de sangre y espere 30 minutos para que la sangre coagule.

A partir de las ocho semanas utilizando agujas de sonda nasogástrica de acero inoxidable de calibre 20, administre el O-H-V-B-N por vía oral cinco días a la semana durante 12 semanas. En la semana 20, use 600 microlitros de solución salina estéril al 0,9% para reconstituir cada vial de vacuna de péptidos liofilizados y vuelva a suspender completamente extrayendo la solución a través de una aguja de calibre 27 de 0,5 pulgadas seis veces con solución salina. Ajuste la concentración de modo que la dosis deseada se administre en un volumen de 100 microlitros después de la última dosis de O-H-B-B-N y administre la vacuna semanalmente durante un ciclo de ocho semanas utilizando una aguja de calibre 25 para inyectar 100 microlitros de la vacuna ocho semanas después de la última dosis de O-H-B-B-N.

Después de sacrificar a todos los ratones por asfixia con dióxido de carbono, coloque a cada ratón en una tabla de disección y sujete las cuatro extremidades. A continuación, con unas pinzas y unas tijeras, haz una incisión horizontal en la región abdominal superior. Inserte las tijeras en la incisión entre la capa epidérmica y la pared abdominal y, con la ayuda de unas pinzas, separe suavemente la piel del tejido subyacente.

Realice una incisión vertical desde la incisión horizontal siguiendo el eje central hacia el extremo anterior del ratón. A continuación, separa la piel de la caja torácica y, con una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 22, perfora el corazón y recoge la sangre con una extracción suave y constante con pinzas y tijeras. Corta y pela el resto de la capa epidérmica dentro de un armario de seguridad biológica.

Cortar a través de la pared abdominal y el peritoneo y de forma aséptica. Extirpar el tumor de la vejiga para la inmunohistoquímica o IHQ y Western blot para la IHQ. Coloque el espécimen del tumor de vejiga en un casete de pañuelos y fíjelo en formina enfriada durante la noche.

A temperatura ambiente, recoja el bazo para el análisis de viabilidad celular y un punto de mentira para llevar a cabo el inmunoensayo multiplexado de microbios fluorométricos. Utilice 200 microlitros de tampón de ensayo para humedecer previamente. Una placa inferior de filtro de 96 pocillos, lo que permite que el filtro se empape por completo.

A continuación, utilice un aparato de vacío de placa de 96 pocillos para drenar suavemente el filtro y utilice toallas de papel para secar con sangre la parte inferior de la placa con una pipeta multicanal, pipetear 25 microlitros de matriz de suero en los pocillos asignados para los blancos y los estándares, y pipetear 25 microlitros de tampón de ensayo en los pocillos asignados para los controles y las incógnitas. A continuación, pipetee 25 microlitros de los patrones en blanco, controles e incógnitas a los respectivos pocillos asignados. Agite la mezcla de cuentas durante 20 segundos y transfiera las cuentas a un depósito.

A continuación, pipetea 25 microlitros de la mezcla de perlas en cada uno. Cubra bien la placa para protegerla de la luz y agite la placa en una coctelera a 500 RPM durante dos horas a temperatura ambiente, escurra la placa y use 200 microlitros de PBST para lavarla dos veces antes de escurrirla y secarla. Para preparar la solución de anticuerpos de detección, combine la cantidad necesaria de 0,1 % de PBST y anticuerpo de detección en un tubo de 15 mililitros y un vórtice durante 10 segundos.

A continuación, pipetea 25 microlitros en cada uno. Agite bien la placa a 500 RPM durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, escurrir y lavar la placa con 200 microlitros de 0,1%PBST, escurrir dos veces y secar la pipeta seca 25 microlitros del estreptococo recién preparado, AVID y FICO eryn o SAPE a cada uno, colocar bien la placa en el agitador de placas e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente a 500 RPM.

Escurrir y lavar con PBST dos veces. Para suspender las perlas, agregue 100 microlitros de 0.1%PBST a cada pocillo y agite a 500 RPM durante al menos dos minutos. Utilice la máquina Luminex LX 200 para leer y analizar la placa en una cabina de seguridad biológica.

Procese los bazos de ratón a través de tamices de tejido de nailon de 100 micrómetros en cinco mililitros de PBS estéril en placas de Petri estériles. Coloque los áytes PLE en tres mililitros de medio de separación de linfocitos en tubos estériles de 15 mililitros. Centrifugar los tubos a 600 GS durante 15 minutos.

Para separar los linfocitos de los glóbulos rojos, transfiera los linfocitos en capas por encima del gradiente a nuevos tubos estériles de 15 mililitros en tubos centrífugos con tapón de rosca de 1,5 mililitros. Utilice el reactivo de viabilidad countin para realizar una dilución en serie de los linfocitos. A continuación, analice en la musa.

Prepare un mapa de la placa de las muestras y las condiciones para la placa aliada preparando la placa de acuerdo con el protocolo del fabricante y pipetee 100 microlitros de péptido medio o mezcle el péptido en cada uno. Pues añadir 100 microlitros de suspensión celular e incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Siga el protocolo del fabricante para el ensayo puntual ALI y utilice el microscopio de disección para analizar la placa puntual Aly desarrollada.

Cuantifique los resultados contando el número de manchas coloreadas correspondientes a cada analito en cada pocillo. Las manchas corresponden al número de células formadoras de manchas en cada pocillo en nuestro modelo de ratón transgénico de inducción con el carcinógeno químico. O-H-B-B-N dio lugar a una tasa alta de incidencias de cáncer de vejiga de carcinoma predominantemente de células de transición o TCC con algunos carcinoma de células escamosas o SCC, que es similar al cáncer de vejiga en humanos, como se muestra en esta figura.

Ocho semanas después de la inducción de O-H-B-B-N, la tasa de incidencia de cáncer de vejiga tanto en ratones transgénicos o TG como en ratones de tipo salvaje fue del 67%La tinción de hematina y eosina confirmó la presencia de TCC y SCC, con predominio de TCC en una proporción de dos a uno. Entre estos, observamos una variedad de tumores no invasivos de bajo y alto grado a invasivos de alto grado. Todos los especímenes de cáncer de vejiga de Mach 1 fueron positivos para la expresión de Mach 1 por IHQ.

Durante el desarrollo del modelo, los niveles séricos de citocinas inflamatorias se monitorizaron en serie entre las semanas ocho y 28. Observamos que los niveles de citocinas inflamatorias aumentaron con el tiempo desde la inducción hasta el final del estudio. Este patrón de citocinas es muy similar a lo que observamos anteriormente en nuestro modelo de cáncer de pulmón, lo que sugiere fuertemente que el aumento de los niveles de citocinas inflamatorias puede correlacionarse con el desarrollo de tumores.

Para evaluar la respuesta de una citocina sérica a la vacuna peptídica, se sacrificaron 15 ratones vacunados y 14 ratones GT 1 tratados con placebo y se recolectó sangre al final del estudio, 24 horas después del último tratamiento con la vacuna. El análisis multiplex muestra un aumento de los niveles séricos de citocinas de TNF, alfa, interferón gamma, IL, dos IL, IL 12 e IL 17 en el grupo de vacunas.

En comparación con el grupo placebo, los niveles de TNF, alfa, interferón gamma e IL 17 fueron significativamente más altos en los ratones tratados con la vacuna. Estos resultados sugieren una respuesta de citocinas polarizadas a la vacuna peptídica con el fin de evaluar la respuesta inmune TH uno, TH dos a la vacuna peptídica. Los citos SP se evaluaron mediante interferón gamma IL cuatro puntos ALI que se muestran aquí es una evaluación de la viabilidad de linfocitos aislados después de sembrar placas de puntos ALI con linfocitos viables, los resultados en este experimento fueron una respuesta clara y específica de interferón gamma al péptido, lo que confirma la respuesta inmune de TH a la vacuna peptídica después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología del cáncer exploraran nuevas inmunoterapias utilizando un modelo preclínico de cáncer de vejiga avanzado.