Name: Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 19 min 32 s
Description: Aprende el protocolo estandarizado de condicionamiento del miedo contextual y señalizado en ratones utilizando un sistema automatizado de análisis de video. Este método mejora la fiabilidad de las evaluaciones conductuales en neurociencia.

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Algunos de los datos que se muestran aquí se obtuvieron en el laboratorio de la Dra. Jacqueline N. Crawley en el Instituto Nacional de Salud Mental de EE.UU. y nos gustaría darle las gracias por lo que nos permite mostrar los datos en el papel. También agradecemos a Kazuo Nakanishi por su ayuda en el desarrollo de programas para el análisis del comportamiento ImageFZ. Esta investigación fue apoyada por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) (21.300.121), subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (Red Integral de la Ciencia del Cerebro) del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón , subvención de Neuroinformática Japan Center (NIJC), y subvenciones de CREST de Japón Organismo de Ciencia y Tecnología (JST).

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</ol>

Confirmamos que no hay conflictos de interés conocidos asociados con esta publicación y no ha habido un importante apoyo financiero para este trabajo que podría haber influido en el resultado.

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y complementada es uno de los paradigmas más utilizados para evaluar el aprendizaje y la memoria. Esta prueba es una forma de condicionamiento pavloviano en el que se hace una asociación entre un contexto y / o un estímulo condicionado (señal auditiva) y un estímulo aversivo (estímulo eléctrico plantar eléctrica). Después de incluso una sola pareja formada por el contexto / señal auditiva y descarga en las patas, los ratones muestran una congelación de larga duración cuando se enfrentan ya sea con el contexto o el taco. En esta prueba, el comportamiento de congelación se utiliza como un índice de la memoria del miedo. Los estudios farmacológicos y de lesión han puesto de manifiesto que la formación de la memoria, la consolidación, y la recuperación están regulados por varias regiones del cerebro, tales como la amígdala, el hipocampo, la corteza prefrontal y 3,33-35. Además, los estudios de genética molecular han demostrado el papel de los genes y moléculas que participan en el aprendizaje y la memoria en estas regiones del cerebro utilizando ratones modificados genéticamente 36 específicos. Por lo tanto, esta prueba es simplcorreo y útil para explorar la base neurobiológica subyacente aprendizaje miedo y la memoria. En este artículo de la película, presentamos nuestro protocolo para proporcionar experimentadores con información detallada de entender y fácil de realizar la prueba. Comportamiento de congelación se cuantificó a través de la observación directa de los experimentadores humanos. Se espera que un experimentador bien entrenado para producir resultados fiables y estables a través de observaciones. Sin embargo, este método implica problemas potenciales, tales como las diferencias en el método de observación, sesgos del observador, y los errores de cuantificación simples, lo que dificulta la comparación directa de los resultados de los experimentadores independientes y diferentes laboratorios. Un sistema de medición de equipo basado en Photobeam automatizado también se ha utilizado 26,30-32. Sin embargo, este sistema también presenta problemas potenciales en la medición de las conductas de congelación. Debido a la disposición de sensor, este sistema podría ser incapaz de detectar pequeños movimientos de la cabeza que Typically marcarán como &quot;activa&quot; a través de la observación humana. Además, temblores durante la congelación podría ser considerado como nonfreezing porque cuando se congela un animal, interrupciones intermitentes en la Photobeam se observan como consecuencia de temblor. Como método alternativo, la imagen-y el vídeo-análisis de los sistemas automatizados se han desarrollado 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 describieron unos sistemas con programas de software de análisis de imágenes que tienen una buena validez y la puntuación de la congelación, así 17,20,37-38. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas y programas de análisis tienen que ser obtenidos de proveedores comerciales y son típicamente costosos. Hemos desarrollado el programa de software ImageFZ para el análisis del comportamiento de la congelación, y este programa se distribuye como un programa de software libre. ImageFZ detecta el ratón como un cuerpo de píxeles (una partícula) y discrimina sutil movimiento del ratón como &quot;congelamiento&quot; o &quot;no-congelación&quot; en función de la cantidad deárea de regiones que no se superponen entre las partículas de cada par de imágenes consecutivas. Como se muestra en los resultados representativos, las mediciones utilizando el programa de ImageFZ son consistentes con o más precisa que la obtenida usando otros métodos. Así, el programa ImageFZ mide automáticamente el comportamiento que los observadores humanos juzgan como la congelación utilizando criterios definidos. Además, el programa ImageFZ calcula la distancia recorrida (cm) antes, durante, y después de la exposición descarga en las patas, lo que facilita una evaluación de la sensibilidad de choque y análisis del comportamiento de congelación. Existen diferencias metodológicas entre los laboratorios. Estas diferencias pueden resultar en dificultades en la comparación de los datos entre los laboratorios y en la reproducción de los resultados de diferentes laboratorios. Para obtener datos más estables y comparables, es necesario estandarizar el protocolo de prueba tanto como sea posible. El sistema de análisis con ImageFZ conduce a la automatización de los procedimientos de ensayo, que puede contribuir ala estandarización de protocolos utilizado a través de los laboratorios. Varias respuestas de comportamiento deben ser considerados al analizar el comportamiento de la congelación. En primer lugar, cuando los animales se enfrentan a una situación de miedo, pueden huir en lugar de congelar 39. Huir es una de las respuestas de miedo, y su incidencia va llevar a subestimar la memoria del miedo. En segundo lugar, la congelación puede depender de un nivel de actividad general, y el nivel de actividad en los ratones experimentales y de control necesita ser examinado. Por ejemplo, aunque los ratones que carecen del receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostraron niveles reducidos de congelación en comparación con los ratones de tipo salvaje, diversas pruebas de comportamiento indican que los resultados se pueden atribuir a su fenotipo hiperactividad en lugar de su deterioro de la memoria 18. ImageFZ calcula la distancia (cm) recorrida por los sujetos. Están disponibles para examinar si existen diferencias en los niveles de actividad en general entre los sujetos de los datos. Si hay una diferencia de grupo enla distancia recorrida, un posible enfoque para el problema es considerar la distancia recorrida durante la primera 2 min de la formación como la actividad de línea de base y utilizar una relación de supresión (relación de supresión = (actividad durante el ensayo) / (actividad durante la línea base + la actividad durante testing)) como un índice secundario de miedo 17,40. Por último, una diferencia en la sensibilidad al dolor, la inducción de los cambios en la reactividad a una descarga en las patas eléctrica, en su caso, puede resultar en variaciones en el comportamiento de congelación. ImageFZ también calcula la distancia recorrida (cm) en detalle desde 2 segundos antes de una exposición de una descarga en las patas 2 segundos a 2 segundos después de su exposición (durante 6 s), que se puede utilizar como un índice de sensibilidad descarga en las patas. Sistemas de vídeo-análisis de se han desarrollado para medir el comportamiento de congelación del albino, negro, agouti, y diluir los ratones marrones. ImageFZ utiliza una bandeja de suelo negro y negro rejillas para examinar ratones blancos (véase la Figura 1B). Las rejillas negros están hechos de especificación<html> aliado procesado metales con recubrimiento de pintura negro y tienen una conductividad eléctrica similar a la de las rejillas de metal no recubiertos, que se utilizan típicamente para ratones negros. ImageFZ también analiza el comportamiento de congelación en ratas y otros roedores a través de ajustes de los parámetros del programa. En la versión actual de ImageFZ, el comportamiento del sujeto se registra utilizando una cámara de vídeo desde la pared superior para analizar la congelación. ImageFZ también podría ser utilizado en una configuración donde se capturan las imágenes desde el lado de la cámara. Además, la ImageFZ controla un máximo de 4 aparatos. Esta característica permite al investigador para examinar simultáneamente 4 ratones, ahorrando tiempo y reduciendo las posibles influencias de las diferencias en el tiempo de ejecución de cada sujeto y el fin de las pruebas sobre el comportamiento. Por lo tanto, ImageFZ simplifica el procedimiento de prueba y análisis del comportamiento de congelación, y este programa facilita la prueba con menos mano de obra y sin ningún tipo de formación para los experimentos conductuales. e_content &quot;&gt; En el laboratorio Miyakawa, hemos evaluado más de 110 cepas de ratones genéticamente modificados y el control de ratones de tipo salvaje en la prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves utilizando el sistema de análisis de video para dilucidar los efectos de un determinado gen en el aprendizaje y la memoria 41-42 Hemos obtenido un gran conjunto de datos en bruto para más de 5.000 ratones Los datos en bruto que se utilizó para los artículos de investigación publicados 4-16 se incluyen en el &quot;Ratón Fenotipo Database &#39;como una base de datos pública (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). El presente artículo película proporciona información detallada acerca de los detalles de nuestro procedimiento experimental y promueve la comprensión de la situación de prueba.

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es el paradigma conductual se utiliza para evaluar el miedo asociativo aprendizaje y la memoria en roedores 1-3. Esta prueba ha sido ampliamente utilizada para comprender los mecanismos neurobiológicos del aprendizaje y la memoria en el miedo transgénicos y knock-out ratones 1,4-16. Comportamiento de congelación, que se define como la inmovilidad completa, con la excepción de la respiración, es una respuesta común a situaciones de miedo. En este paradigma de comportamiento, después los animales son expuestos a un emparejamiento de una señal auditiva con una descarga en las patas eléctrica, que responden al estímulo produce miedo por mostrar un comportamiento de congelación, que se mide como un índice de aprendizaje asociativo miedo y la memoria. Esta prueba requiere equipo menos elaborado, menos esfuerzo físico por parte del investigador, y mucho menos tiempo de entrenamiento para los ratones que otras tareas de aprendizaje y memoria, sino que por lo general requiere aproximadamente 5-10 min / día por ratón durante 2 días. Aunque el procedimiento de la prueba es simple y requiere poco tiempo para llevar a cabo, el investigador debe observar cuidadosamente y medir el comportamiento del ratón, por lo que varios sistemas de medición automáticos se han desarrollado para llevar a cabo el análisis del comportamiento 17-20. Nuestro sistema de vídeo-análisis, que hemos desarrollado con el programa de software ImageFZ, nos permite analizar fácilmente el comportamiento de congelación y producir resultados de alta fiabilidad. En este artículo se proporciona información detallada sobre los procedimientos de pruebas y se describe cómo utilizar el programa de software ImageFZ.

<table><tbody><tr><td>Programa ImageFZ</td><td>Desarrollado por Tsuyoshi Miyakawa</td><td></td><td>Este programa está disponible a través de O'Hara & Co., Tokio, Japón y para descarga gratuita en http://www.mouse-phenotype.org/. Este software se ejecuta en Windows XP/Vista/7 de 32 bits.</td></tr><tr><td>Cámara de acondicionamiento</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>CL-3002L</td><td>para ratón.</td></tr><tr><td>Cámara de prueba con señales</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>CLT-3002L</td><td>para ratón.</td></tr><tr><td>Interfaz</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>CL-1040</td><td>La interfaz incluye un generador de ruido blanco/tono, que puede ser controlado por el programa ImageFZ.</td></tr><tr><td>Generador de choque codificado</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>SGA-2040</td><td>El generador de choque puede ser controlado por el programa ImageFZ.</td></tr><tr><td>Probador de rejilla de choque (amperímetro)</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>Dispositivo de captura de video USB SG-T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>XLR8</td><td>USB2IVOSX</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de imagen cuádruple</td><td>inalámbrico Tsukamoto Co., Ltd., Japón</td><td>400AS</td><td></td></tr><tr><td>Sala insonorizada</td><td>O' Hara & Co., Japón</td><td>CL-4210</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de congelación</td><td>San Diego Instruments, Inc., CA, EE. UU</td><td></td>. <td>Matriz de haz photbeam de 16 x 16&nbsp; (Espaciado de 2,5 cm)</td></tr></tbody></table>

contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

La prueba de acondicionamiento miedo contextual y con claves es una de las pruebas de comportamiento que evalúa la capacidad de los ratones para aprender y recordar una asociación entre las señales ambientales y experiencias aversivas. En esta prueba, los ratones se colocan en una cámara de acondicionamiento y se dan recortes de un estímulo condicionado (una señal auditiva) y un estímulo no condicionado aversivo (una descarga en las patas eléctrica). Después de un tiempo de retardo, los ratones son expuestos a la misma cámara de acondicionamiento y una cámara en forma diferente con la presentación de la señal auditiva. Congelación comportamiento durante la prueba se mide como un índice de la memoria del miedo. Para analizar el comportamiento de forma automática, se ha desarrollado un sistema de análisis de vídeo utilizando el programa de software de aplicación ImageFZ, que está disponible como descarga gratuita en http://www.mouse-phenotype.org/. En este caso, para mostrar los detalles de nuestro protocolo, demostramos nuestro procedimiento para el contexto y con claves de prueba acondicionado miedo en ratones C57BL/6J usando el sist ImageFZem. Además, hemos validado nuestro protocolo y el rendimiento del sistema de análisis de vídeo mediante la comparación de tiempo de congelación medida por el sistema ImageFZ o un sistema de medición de equipo basado en Photobeam con que anotado por un observador humano. Como se muestra en nuestros resultados representativos, los datos obtenidos por ImageFZ fueron similares a los analizados por un observador humano, lo que indica que el análisis de comportamiento utilizando el sistema de ImageFZ es altamente fiable. El presente artículo película proporciona información detallada sobre los procedimientos de prueba y promover la comprensión de la situación experimental.

En la prueba de condicionamiento del miedo, los experimentadores humanos utilizan para cuantificar el comportamiento de congelación a través de la observación directa de trabajo intensivo 26-29, pero los sistemas de medición de la computadora recientemente Photobeam-basado (por ejemplo, el sistema de &#39;Freeze monitor&#39;) y la imagen-de análisis se han utilizado para automáticamente medir el comportamiento de congelación 26,30-32. ImageFZ es un sistema de imagen-el análisis automatizado, que produce resultados comparables a los obtenidos a través de la observación humana, como se describe a continuación. En este caso, se compararon los resultados de la observación humana con los de análisis ImageFZ bajo diferentes parámetros: &#39;Tarifa (cuadros / s) &quot;y&quot; Freezing criterio (píxeles).&#39; En este experimento, cinco ratones C57BL/6J macho (peso corporal medio ± SD (g), 31,4 ± 3,55, con una media ± SD tamaño del cuerpo (píxeles), 351,6 ± 62,2) fueron utilizados en 15-27 semanas de edad. La observación humana se realizó utilizando un programa de eventos de grabación (un programa de software Macintosh OS9), un evento clave de prensado que continúand durante 2 segundos o más cuando un ratón aparece un brote de ningún movimiento fue considerado &quot;congelación&quot;. El porcentaje de congelación se calcula cada 60 segundos en cada prueba y se utiliza para los análisis de correlación. El porcentaje de congelación anotado por los 2 observadores (fiabilidad entre observadores, para el acondicionamiento, r = 0,879; prueba de contexto, r = 0,957; para la prueba con claves, r = 0.866, para todos los casos, r = 0.888) fue en promedio de generar un ser humano anotar. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de ImageFZ con cada velocidad de cuadro (es decir, 1, 2, y 4 fps) y los obtenidos a través de observaciones humanos. Como se ilustra en la Figura 4, los porcentajes calculados de congelación a través de ImageFZ (1, 2, y 4 fps) fueron altamente correlacionados con el valor promedio obtenido de las mediciones de los 2 observadores. En particular, la captura de imágenes a una velocidad más alta no siempre produce la mejor correlación. Análisis de imágenes a 1 fps generado resultados similares a los obtenidos a partir de los observadores humanos en eprueba ach. Se examinaron las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos a través de las observaciones humanas y utilizando ImageFZ en cada condición de los &quot;criterio de congelación (píxeles)&quot; (es decir, 20, 30 y 40 píxeles). Los porcentajes de congelación calculados utilizando ImageFZ en el &#39;criterio de congelación (píxeles) &quot;de 20, 30 y 40 píxeles fueron, en todos los casos, altamente correlacionados con los obtenidos a través de las observaciones humanas (Figura 5). Como se muestra en la Figura 5D, cuando el criterio de congelación se establece en un valor bajo, el sutil movimiento de un ratón, que se considera ser &quot;congelamiento&quot; por los observadores humanos, sería considerado &quot;no congelar &#39;usando ImageFZ. Por el contrario, si el criterio se establece en un valor alto, el movimiento de un ratón, calificó como &quot;no-congelación&quot; por los observadores humanos, se consideraría «congelación» utilizando ImageFZ (Figuras 5C, 5F y 5I). Por lo tanto, para obtener los resultados más fiables, cada parámetro del programa ImageFZ debe ser calibrado nosotrosción de los datos obtenidos a través de observaciones humanos en cada entorno de prueba. Además, se compararon los resultados generados por un observador humano, usando un sistema basado en ordenador de haz de luz de medición (el sistema de congelación del monitor), a los obtenidos utilizando ImageFZ (véase la Figura 6). El observador humano fue cegado al grupo de tratamiento y los resultados de la puntuación ImageFZ. Para los ajustes de los parámetros del sistema de congelación del monitor, se utilizó 3 medidas del porcentaje de congelación de un sistema previamente validado 30. En pocas palabras, el número de intervalos de 10 segundos en los que los animales requiere más de 1 o 2 segundos para cruzar la primera viga de nuevo el intervalo de (10 seg 1 seg y 10 seg 2 seg, respectivamente) y la latencia entre el comienzo de cada intervalo de 5 seg y Se midió la tercera nueva interrupción del haz dentro de este intervalo (Latency3). Los porcentajes de los intervalos en los que el ratón estaba helada o el porcentaje de la cantidad total de tiempo rEQUIRED para romper se calcularon la tercera Photobeam. Los porcentajes de congelación medidos en cada sistema se ilustran en la Figura 6. Los grupos se compararon mediante dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (véase la Tabla 1). Los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ (Figura 6B) fueron más similares a los obtuvo a través de la observación humana (Figura 6A) de los datos obtenidos usando un sistema basado en Photobeam (figuras 6C-E). Los porcentajes de congelación medidos utilizando el programa ImageFZ en cada prueba fueron altamente correlacionados con los marcados a través de la observación humana (acondicionamiento, r = 0,947; prueba de contexto, r = 0,970; cued prueba, r = 0,934), mientras que las correlaciones entre los porcentajes de congelación mide utilizando el sistema de medición de equipo basado en Photobeam (10seg 1seg, 10 seg 2 seg o Latency3) y el observador humano fueron menores (acondicionamiento, r = 0.503, 0.593 y 0.761; contexto test, r = 0,772, 0,819, y 0,912) en comparación con las correlaciones entre los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ y la observación humana (Figuras 7A y 7B). Además, la Figura 7 revela que las diferencias entre los porcentajes obtenidos de congelación a través de la observación humana y utilizando ImageFZ en cada ratón fueron las diferencias más pequeñas. Estos resultados indicaron que los porcentajes de congelación medidos usando ImageFZ fueron similares a los obtenidos a través de la observación humana y que ImageFZ es altamente preciso en la medición de la cantidad de congelación. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> Figura 1. Aparatos para el contexto y con claves de prueba condicionamiento del miedo. (A) Una cámara cuadrada de acrílico para la prueba de acondicionamiento y el contexto, ( <strong&gt; B) rejillas de metal sobre un suelo de plástico blanco para ratones marrón negro, agutí o diluir (arriba) y las rejillas de metal negro electrificables en un piso de plástico negro para ratones blancos (abajo), las imágenes ampliadas de las redes se muestran en la derecha Panel, (C) un generador de ruido blanco / tono y un generador de shock, (D) una sala insonorizada, y (E) una cámara triangular de acrílico con un piso plano para la prueba con claves. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática del protocolo. (A) Descripción general del contexto y cued prueba acondicionado miedo, (B) acondicionamiento, (C) cONTEXTO prueba, y (D) con claves de prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de la imagen por el programa de software ImageFZ. Para cada par de imágenes sucesivas, la cantidad de área (píxeles) a través del cual el ratón se movía se calcula por ImageFZ. Cuando esta zona se encuentra por debajo de un cierto umbral (por ejemplo, 30 píxeles), el comportamiento es juzgado para ser «congelación». Cuando la cantidad de área igual o superior al umbral, el comportamiento es considerado como &quot;no-congelación&quot;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Las comparaciones de los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes a diferentes velocidades de cuadro utilizando ImageFZ con los medidos a través de la observación humana. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores anotaron el comportamiento de la congelación. Al mismo tiempo, se capturaron las imágenes en directo a 4 fps utilizando el programa ImageFZ. Los archivos capturados a 4 fps se recortan después de extraer los fotogramas que corresponden a las imágenes captadas a 1 fps o 2 fps. Los valores de los parámetros de la &quot;Tarifa (cuadros / s)&quot; se establece en 1, 2 o 4 fps, y los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de archivos de imagen usando ImageFZ análisis fuera de línea. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson entre los datos obtenidos a partir de la observación humana y el análisis ImageFZ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Los porcentajes de congelación calculados a partir de las imágenes en diferentes valores criterio de congelación utilizando ImageFZ y los medidos a través de observaciones humanos se compararon. Las pruebas de condicionamiento de miedo se llevaron a cabo utilizando ratones macho C57BL/6J (n = 5). Durante las pruebas, dos observadores registraron el comportamiento de congelación, y las imágenes en directo fueron capturados utilizando el programa ImageFZ. Los porcentajes de congelación en cada 60 seg bin se calcularon a partir de las imágenes (1 cuadro / s) a través ImageFZ análisis fuera de línea, el establecimiento de los valores de los parámetros de &quot;criterio de congelación (píxeles) &#39;a 20, 30, o 40 píxeles. Cada punto representa un porcentaje de congelación de cada bandeja de 60 seg. Coeficiente de correlación de Pearsoncoeficientes entre los datos obtenidos de la observación humana y el análisis ImageFZ se calcularon en cada prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> Figura 6. Los porcentajes de congelación se midieron utilizando sistemas automatizados y la observación humana en grupos no acondicionados y acondicionado de los ratones macho C57BL/6J (n = 5, cada grupo). (A) la observación humana, (B) ImageFZ, (C) Congelar sistema de monitor 1 (10seg 1seg), (D) Congelar sistema Monitor 2 (10 seg 2 seg), y (E) Congelar sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparaciones se realizaron utilizando dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido de pruebas t (uncovs acondicionado grupo nditioned grupo, *, P &lt;0,05; †, p &lt;0,01). Los datos obtenidos utilizando ImageFZ fueron similares a los marcados a través de la observación humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> Figura 7. Se muestran la correlación y la distribución de frecuencia de las diferencias entre los porcentajes de congelación, medidos utilizando sistemas automatizados y la observación humana. (AB) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson entre porcentajes de congelación obtenidos a través de sistemas automatizados y la observación humana. Los porcentajes de congelación, calculadas utilizando ImageFZ, están altamente correlacionados con los obtenidos a través de la observación humana. (CF) Ocurrencias de menos de un 10% DIFrencia entre los porcentajes de congelación obtenidos de los sistemas automatizados vs observación humana fueron mayores cuando los datos analizados utilizando ImageFZ se compararon con los analizados a través de la observación humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ANOVAs </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Condición </td><td> Tiempo </td><td> Condición x Tiempo </td></tr><tr><td> Día 1 (acondicionamiento) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 </td><td> F (7,56) = 20.79, p &lt;0.0001 </td><td> F (7,56) = 16,58, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 </td><td> F (7,56) = 21.40, p &lt;0.0001 </td><td> F (7,56) = 11.69, p &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 </td><td> F (7,56) = 2.39, p = 0.0329 </td><td> F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (2sec10sec) </td><td> F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 </td><td> F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 </td><td> F (7,56) = 1.52, p = 0.1803 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 </td><td> F (7,56) = 9,94, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 </td></tr><tr><td> Día 2 (contexto) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 1.91, p = 0.1336 </td><td> F (4,32) = 1.48, p = 0.2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 </td><td> F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 </td><td> F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 20,28, p = 0,002 </td><td> F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 </td><td> F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (2sec10sec) </td><td>F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 </td><td> F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 </td></tr><tr><td> Freeze Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 </td><td> F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 </td><td> F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las comparaciones de las estadísticas.

En este artículo se presenta un protocolo para un temor prueba contextual y complementada acondicionado mediante un sistema de análisis de vídeo para evaluar el aprendizaje del miedo y la memoria en ratones.

Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

La prueba de condicionamiento contextual y agudo al miedo es una prueba conductual que se utiliza ampliamente para evaluar la capacidad de Lawrence para aprender. Recuerde las asociaciones entre una experiencia agresiva y las señales ambientales. Sin embargo, en esta prueba existen algunas diferencias metodológicas entre los lugares de trabajo, lo que puede resultar en la dificultad de comparar datos y en duplicar los resultados.Para obtener datos más estables y tivos, es importante estandarizar el protocolo de prueba tanto como sea posible. En esto demostramos el protocolo de la prueba de campo. El test de funcionamiento del miedo es una prueba sencilla, sensible y fiable para evaluar la memoria.Esta prueba se utiliza a menudo para comprender los mecanismos neurológicos y moleculares y el aprendizaje y la memoria, y también para evaluar la función cognitiva de posibles modelos de ratón de trastornos psiquiátricos como el trastorno postestrés y la esquizofrenia. En la prueba de comportamiento de enfrentamiento, que se mide como un índice de aprendizaje y la memoria se puntúa mediante la ización de observadores humanos, se utilizaron algunos sistemas automatizados para analizar el comportamiento de uso de forma automática. Desarrollamos un sistema de análisis de imágenes utilizando el programa de software basado en imagen FG e imagen A.Estamos distribuyendo dicho programa de software y se puede descargar gratuitamente en esta dirección. En este presentamos nuestro protocolo de pruebas y el sistema de análisis automatizado. En primer lugar, mostramos cómo proteger el operador de la aplicación como imagen del programa de software.En segundo lugar, demostramos los protocolos detallados de la prueba, incluida la prueba de contexto de condicionamiento y la prueba Q para el dispositivo que usa el sistema. Finalmente, presentamos los resultados actuales que indican que el sistema FD de imágenes N puede producir resultados altamente confiables. Ahora comencemos.Comienza rápido en la prueba de condicionamiento del miedo. Se coloca un ratón en una cámara con piso nivelado. El OID se presenta como un auditor.Cola de auditor durante 30 segundos. A continuación, se proporciona una descarga eléctrica. Este emparejamiento de una cola de auditor y la descarga de pie se da tres veces para mejorar la asociación entre la cola de auditor y la descarga de código eléctrico.Durante la prueba, el comportamiento de congelación se mide como un índice de aprendizaje asociado y memoria injusta. En segundo lugar, después de 24 horas, el ratón se coloca en la misma cámara de acondicionamiento y se le califica por comportamiento de pulga. Para medir el miedo de control contextual, el ratón se transfiere a una G de forma diferente sin ninguna cola auditiva y, a continuación, se presenta la cola auditiva.En esta prueba, la conducta de congelación se utiliza como un índice de la memoria de miedo agudo. Durante la prueba, el comportamiento del mouse se registra a través de una cámara conectada a una computadora. El comportamiento se juzga como congelante o no congelante.Mediante el programa de software de imagen, el programa puede calcular el porcentaje de tiempo de congelación y el tráfico de distancia. Aquí, por ejemplo, se demuestra el análisis de imágenes durante la prueba. Las imágenes en vivo se capturan a una longitud por segundo.Image of the crea una imagen binaria a partir de cada imagen en vivo para cada par. Con llamas sucesivas, la cantidad de área a través de la cual se movió el mouse se calcula mediante la imagen del programa. Cuando el área está por debajo de un cierto umbral, el comportamiento se juzga como congelación, que generalmente se define como una ausencia total de cualquier movimiento, excepto la respiración y difícil de superar.El comportamiento de congelación que dura menos del umbral de tiempo definido no se considera inmovilizado. El valor umbral debe establecerse de antemano para que produzca el mejor ajuste entre los tiempos de congelación medidos por la imagen Z y las observaciones humanas. Cuando la cantidad de área es igual al umbral o X tres Z, se considera que el comportamiento es no congelante.Aquí demostramos nuestro protocolo de prueba en ratones utilizando este sistema de análisis de video. En este protocolo, los operadores están construidos en una cámara cuadrada de rejilla con rejillas metálicas y descubierta con una imagen de plomo transparente. FD puede distinguir el sujeto oscuro de un fondo blanco en cada imagen de video capturada.Pero este proceso nos permite analizar el comportamiento de congelación del sujeto que necesita colocar la cámara sobre un suelo blanco para analizar el comportamiento de ratones negros, buenos o negros directos. El comportamiento de congelación de los ratones de aluminio también se puede analizar mediante la imagen D utilizando rejillas de metal negro Bajo una regla negra, las luces de diodos emisores de luz se unen a la vela sobre el aparato. La regla de la cuadrícula se ilumina en 100 techos mediante luces LED.Un altavoz conectado con el generador de tonos de ruido blanco está montado en una vela sobre la tapa. Un ruido blanco de 55 se presenta como una cola auditiva. Las rejillas están conectadas a un generador de choque para proporcionar descargas eléctricas de alimentos.La prueba de viento de choque se establece en 0,3 millones de pares antes de que se inicie la prueba. La intensidad de la corriente en la red debe ser verificada por un metal porque la prueba de choque puede disminuir por una acumulación de fe y orina en los ratones, la cámara de prueba se coloca en un telar insonorizado para minimizar el ruido externo. Durante la prueba, la apelación se encuentra en un sonido diferente al que se realizan las pruebas de cono y contexto.Está compuesto por una cámara que tiene propiedades diferentes a la cámara de cono. Proporcionando un contexto normal, es necesario cambiar los códigos sensoriales tanto como sea posible para que el ratón perciba el contexto del Nobel como no relacionado con la cámara de contención. En este protocolo, el aparato es una cámara triangular acri con una regla de acri plana y el cable transparente.Un altavoz se monta en una vela sobre el plomo para presentar en una o tres colas. Esta cola es la misma señal que se proporcionó a los ratones en hawing. El nivel de iluminación del suelo se ajusta para estudiar el aspecto.Cada cámara es un cubo con una cabina de carga montada en una vela, cámara de dispositivo para monitorear el comportamiento del mouse. Antes de que comience cada prueba, las paredes y los pisos acrílicos se limpian con una lengua, por lo que se mezclan con agua bruta súper alta y las rejillas se limpian con etanol al 70%. Para evitar un sesgo basado en el corte olfativo, las rejillas se limpian con Ethan en lugar de agua bruta súper exagerada para injuri que las rejillas no deducen su conductividad eléctrica debido a los últimos dos a cuatro ratones, un paquete de casa en una sala de almacenamiento con temperatura controlada para reducir los posibles aumentos del transporte de la jaula en el comportamiento y para adaptar los ratones al entorno experimental.La jaula que contenía los ratones se transfirió a una sala de espera insonorizada al menos 30 minutos antes de que comience cada prueba. Todos los experimentos deben realizarse durante el mismo período de tiempo para minimizar las variaciones de comportamiento que se pueden producir al realizar pruebas en diferentes momentos. Los ratones de cada grupo deben ser probados en un contrapeso para reducir los efectos potenciales del tiempo experimental.Bajo el orden de prueba del sujeto sobre el rendimiento conductual, la imagen D puede controlar un máximo de cuatro aparatos que prueban de ratones simultáneamente mientras que el investigador para ahorrar tiempo y digital para deducir en los efectos potenciales del procedimiento experimental sobre el comportamiento del ratón. Antes de que comience la sesión continua, ejecute el software de aplicación A FD. Seleccione el menú de enchufe FD concerniente y FD en línea y configure los valores de los parámetros establecidos paso a paso de la siguiente manera.Paso uno, el ID del proyecto especifica la carpeta donde desea almacenar la fecha de los archivos. Paso dos, tipo de nombre de sesión. Cualquier palabra en el cuadro de sesión es la fecha experimental y el texto de referencia a archivar en el que se escriben en el cuadro de referencia la hora de inicio y la duración del ruido blanco y el choque alimentario.El texto de deferencia al archivo debe prepararse en la carpeta de deferencia de la imagen, la carpeta de antemano. Paso tres ajustes de parámetros. Introduzca los valores de los parámetros, como la duración, el tiempo y los criterios de congelación, tal y como se muestran en la película.Paso cuatro, identificación del sujeto. Ingrese la identificación del sujeto. Paso cinco, la configuración de la cámara contrasta el brillo y el contraste de la imagen capturada.Paso seis, configuración del umbral. Primero para medir la distancia recorrida desde las imágenes consecutivas, ajuste el valor principal del umbral del programa, que está configurado para segmentar las imágenes en partículas negras y fondo blanco. La distancia recorrida se calcula entre cada conjunto con coordenadas XY para el centro de gravedad con la partícula en las imágenes consecutivas.En segundo lugar, el mayor para el comportamiento de las imágenes consecutivas, simplemente asumiendo x valor adicional del programa que está configurado para segmentar las imágenes en partículas negras debajo del fondo y luego calcular la cantidad de área de regiones no superpuestas entre partículas de cuyo par de ventanas de entrada de imágenes consecutivas se muestra la región no superpuesta. Cambiar las medias expresas al valor en la cantidad de valor de la región debe estar por debajo del valor del grito ING cuando el mouse muestra el comportamiento ing. Estos valores deben ajustarse para que los datos por fatiga de imagen coincidan con los de la plantilla por el propio humano.El paso siete, establecido en el campo de captura, especificó el campo, la cámara que desea capturar después de hacer clic con el botón rectangular en la caja de herramientas para rectangular alrededor del piso de la misma. Cámara en la ventana de imagen en vivo. A continuación, seleccione la novela de cámara y haga clic en el botón establecer para finalmente hacer clic en el botón completar.Una vez que se hayan definido los ajustes de los parámetros, se debe realizar una prueba preparatoria utilizando ratones de práctica antes de la primera prueba de la fecha para determinar si el sistema de análisis de imágenes y qué generadores de choque de ruido funcionan con esos problemas mover la jaula de peine que contiene los ratones de práctica a la penumbra de prueba de sonido desde la penumbra adyacente a la penumbra en espera y colocar cada ratón en la cámara de acondicionamiento inmediatamente después de colocar los ratones en la cámara, haga clic en la parte inferior de inicio de la imagen de Z.Los ratones pueden explorar completamente la cámara durante 120 segundos. Después. Durante 30 segundos se presenta un ruido blanco en forma de cola auditiva y durante los dos últimos segundos del sonido, se da un choque alimentario a los ratones. Este procedimiento se repite tres veces en sesión para reforzar la asociación entre la cola y el choque alimentario.Las mascarillas se dejan en la cámara durante 90 segundos después del último emparejamiento. Establecer aún más la asociación entre el contexto de la cámara y la experiencia pasiva. Después de 480 segundos de fuga, los ratones se devuelven a la jaula de inicio y la jaula se devuelve al estante de la sala de espera.Después de cada prueba, limpie cuidadosamente las cámaras y la rejilla. A continuación, haga clic en el botón siguiente análisis y repita la sesión en los ratones de prueba. Aproximadamente 24 horas después del traslado de la jaula a los ratones a una sala de telar de espera insonorizada.El telar de espera al menos 30 minutos antes de que comience cada prueba. Imagen larga de la y establezca los valores de los parámetros del software de la misma manera que en el acondicionamiento. Sin embargo, establezca el tiempo de duración en 300 segundos y seleccione 35 texto para archivar para la prueba contextual.35 El texto del archivo está en blanco. Coloque el mouse en la cámara de acondicionamiento y haga clic en la parte inferior de inicio. A los ratones se les permite explorar completamente la cámara durante 300 segundos sin ninguna presentación de estímulos.Después de 300 segundos, lleva a los ratones a su jaula de casa y limpia las cámaras. A continuación, haga clic en la siguiente parte inferior del análisis y repita el procedimiento en la imagen larga de los ratones de prueba de D y establezca los valores de los parámetros de la misma manera que en el texto de referencia continuo para archivar para esta prueba y establezca el tiempo de duración hasta 360 segundos. Este es un texto de referencia para archivar para esta prueba.Coloque cada ratón en la cámara triangular y haga clic en el botón de inicio de la imagen Z.Todos los ratones deben explorar la cámara en los primeros tres minutos. No se presenta ruido blanco ni choque en los pies. Esta cámara tiene diferentes propiedades que proporcionan un nuevo contexto y se relacionan con la cámara continua.En esta cámara, por lo general, debe moverse mucho y no mostrar comportamiento. Al final de los primeros tres minutos, el ruido blanco que se presenta en Concho se proporciona a los ratones durante tres minutos. Durante la presentación del auditor, el auditor pone en cola a los ratones o exhibe un comportamiento escrito después de que 360 segundos ha estallado, devuelve a los ratones a su jaula doméstica y devuelve la jaula al estante de la sala de espera.Después de la prueba, limpie las cámaras cuidadosamente. A continuación, haga clic en la siguiente parte inferior del análisis y repita el procedimiento con los ratones de prueba. Este video muestra que el paso de la congelación analizado por la imagen del sistema parece estar más estrechamente relacionado con el pensamiento medido por un observador humano.La observación fue confirmada por los detalles que mostraron que el porcentaje de arrendamiento medido por la imagen física en cada prueba estaba altamente correlacionado o puntuado por el observador humano. Además, esta figura demuestra que las diferencias entre los porcentajes de congelación medidos por las observaciones humanas y la imagen del sistema en su imagen fueron las más pequeñas. Estos resultados indicaron que el porcentaje de congelación medido por la imagen del sistema era similar a los obtenidos por la observación humana y que la precisión medindo la cantidad de razón por la imagen Z es alta. Bien.¿Qué te pareció? Como puede ver en la prueba, el análisis de comportamiento estándar se puede realizar fácilmente. Hay algunos consejos y puntos importantes para usar la imagen del sistema, así que permítanme preguntarle al respecto. Bien.En primer lugar, ¿qué le pareció el procedimiento de prueba de la imagen del sistema? Creo que nuestro procedimiento de prueba es muy simple y la imagen del sistema es una herramienta útil para medir la razón, el comportamiento de manera precisa y rápida. Cualquier persona puede utilizar fácilmente un programa de software con una formación previa Como resultado, este sistema puede servir para evaluar su memoria en muchos meses en poco tiempo, lo que nos ahorrará tiempo y más adelante.Ya veo. Entonces, ¿hay algo con lo que debamos tener cuidado cuando realizamos la prueba? Sí, porque el operador indica que es importante obtener la imagen más nítida para medir el comportamiento con precisión, por lo que debe ajustar la longitud de la cámara y las cosas de escritura belo.También en el estudio del programa, es necesario establecer cuidadosamente los valores sexuales y los criterios de razón para juzgar si el comportamiento puede o no ser calificado como razón. Es importante que el resultado haya sido inmediato, el programa como con el pensamiento de ellos por la observación humana Como se muestra en el presente resultado. Bien. Como puede ver, este puede ser un artículo, proporcionar información detallada sobre el procedimiento de prueba y el uso del programa de software.Esperamos que este pueda ser el artículo. Promover su comprensión de la prueba y contribuir a la estandarización del protocolo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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