Tecnología de Inserción Metamórfica temprana para insectos de vuelo Supervisión del comportamiento

Hola, soy Alex Derber del laboratorio del Dr. Albert Bos. Estoy en el Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Universidad Estatal de Carolina del Norte. Hoy vamos a demostrar un procedimiento quirúrgico novedoso para implantar electrodos en la manica sex durante las etapas tempranas de la metamorfosis.

En este procedimiento, denominado tecnología de inserción en metagénesis temprana, los electrodos implantados se integran en el tejido del insecto durante la etapa metamórfica de pupa. Una ventaja importante de este procedimiento es que produce un acoplamiento mecánicamente estable y eléctricamente confiable con el tejido neuromuscular y permite el estudio de la neurofisiología del vuelo del insecto. En la fase adulta, IC Mensa atraviesa un ciclo vital metamórfico que dura aproximadamente 40 días.

Mensa comienza su ciclo vital en una etapa de huevo. Después de siete a 10 días, la larva habrá eclosionado y alcanzado la tercera etapa larval estrellada. Existen un total de cinco etapas larvales estrelladas, y en cada una de estas etapas, la larva realiza recolección de energía y crecimiento.

Cinco a seis días después de la quinta fase larval, el insecto entrará en la etapa temprana de pupa. Durante la etapa de pupa, ocurre una degeneración programada extensa y la posterior regeneración de los tejidos del insecto. En preparación para la emergencia como polilla adulta, el insecto pasa de 17 a 19 días.

En la etapa temprana de pupa, antes de entrar en la etapa tardía de pupa, durante la etapa tardía de pupa, insertamos quirúrgicamente un electrodo conductor en la parte dorsal del tórax de la pupa. El tejido se desarrolla alrededor de los electrodos implantados y asegura su fijación al cuerpo del insecto. A lo largo de unos días, los electrodos insertados en el tórax de la pupa pasan a formar parte del cuerpo del insecto en la etapa adulta final como polilla, aprovechando así la reconstrucción completa del sistema de tejidos del insecto.

Durante el desarrollo metamórfico, los electrodos se implantan en los músculos indirectos del vuelo en el tórax. Estos grupos musculares responsables de forma indirecta del movimiento de las alas son los músculos dorsoventrales y los músculos longitudinales dorsales. Aquí demostraremos la inserción de un electrodo en los músculos dorsoventrales, responsables de manera indirecta del movimiento ascendente de las alas.

Con esta inserción, registraremos de forma inalámbrica el electromiograma de los músculos dorsoventrales durante un movimiento de ya. Mientras el insecto está suspendido mediante una plataforma levitada electromagnéticamente dentro de una arena de LED, que estimula el movimiento. El procedimiento para la tecnología de inserción en metamorfosis temprana comienza con la construcción de un circuito impreso que se utilizará como interfaz entre los electrodos insertados y el instrumento de registro.

Los electrodos de alambre se sueldan en la placa de circuito impreso, que está conectada a un conector plano y flexible para cable. Para comenzar, mida y corte un trozo de laminado revestido de cobre de 0,5 por cinco centímetros cuadrados utilizando un marcador permanente de punta fina y tijeras, usando el mismo marcador permanente de punta fina. Dibuje tres pastillas de 0,1 por cinco centímetros cuadrados como patrones de máscara para grabado.

Utilice un instrumento de borde recto, como una regla, para hacer las marcas a lo largo de toda la longitud del recorte de lámina de cobre. Asegúrese de que las marcas sean nítidas y no se superpongan entre sí. Si las líneas de marca se superponen, los electrodos quedarán en cortocircuito.

Al realizar la conexión con el conector plano y flexible, lo que hace que las placas sean inservibles, lleve el recorte de lámina de cobre a un área ventilada, preferiblemente con campana extractora, para grabar las marcas sobre la lámina de cobre. Tenga cuidado al manipular el grabado de la placa de circuito impreso, ya que es tóxico. Si se ingiere o traga, y puede irritar la piel al entrar en contacto, coloque la cinta de teflón en un extremo del recorte de lámina de cobre, cubriendo aproximadamente un centímetro a lo largo de su longitud.

A continuación, sujete el recorte de lámina de cobre al interior de un vaso graduado utilizando cinta adhesiva de celulosa de manera que la mitad de la tira de lámina de cobre quede sumergida en el agente grabador. Coloque el vaso en una plataforma giratoria durante 20 minutos. Retire la lámina de cobre grabada del vaso y colóquela en un vaso lleno de agua durante 10 minutos.

Para enjuagar el residuo, aplique alcohol isopropílico a un trozo de tejido limpiador delicado y limpie las marcas para exponer las almohadillas de cobre no grabadas. Elimine todos los rastros del rotulador permanente. Corte la placa de circuito impreso en cuadrados más pequeños de aproximadamente un centímetro de lado.

Una vez que las placas de circuito impreso han sido grabadas, es necesario preparar los electrodos para su fijación. Se recomienda realizar estos pasos con la ayuda visual de un microscopio. Corte dos trozos de alambre de acero inoxidable revestido, con una parte revestida de 0,11 pulgadas de diámetro y una parte desnuda de 0,008 pulgadas, utilizando una cuchilla afilada, con dos longitudes de tres centímetros cada una.

Estos trozos de alambre de acero inoxidable son los electrodos activos que se insertarán en el tórax del insecto. Con una cuchilla de afeitar, retire cuatro a cinco milímetros del recubrimiento plástico de cada extremo de cada alambre. A continuación, corte.

Un trozo de alambre de acero inoxidable aislado de 0,7 centímetros para crear una extensión de punta para el electrodo de tierra. Retire suavemente el recubrimiento con la cuchilla de afeitar como se realizó en el paso anterior o derrítalo con el calor de un soldador. A continuación, corte un trozo de alambre lititz a una longitud de 4,5 centímetros.

El alambre del inductor también puede utilizarse para esta soldadura. La pieza previamente preparada de 0,7 centímetros de acero inoxidable se conecta al alambre de tierra lititz. Debe haber una punta expuesta de acero inoxidable en el extremo de la conexión a tierra.

Sujete la placa de circuito grabada al área de soldadura utilizando cinta de teflón. Coloque la cinta sobre la placa de circuito de manera que uno o dos milímetros de las pistas queden expuestos para permitir la soldadura de los electrodos a la placa. Los extremos libres de soldadura de las pistas, que están protegidos con la cinta, se insertarán en el conector FCC.

Alinee los tres cables del electrodo con cinta de teflón de manera que un extremo de cada uno pueda soldarse a las pistas correspondientes en la placa del electrodo. Los dos electrodos activos deben soldarse en las pistas cercanas a los bordes de la placa. Los electrodos de tierra iluminados deben soldarse en la pista central.

Aplique una capa de fundente de acero inoxidable sobre las almohadillas del electrodo para facilitar la soldadura. Tenga cuidado de evitar puentes entre las conexiones de las almohadillas al aplicar demasiada soldadura. Sumerja los electrodos en acetona y luego en alcohol isopropílico durante 10 minutos cada uno.

Para limpiar los residuos de soldadura. Las soluciones se pueden verter en recipientes o vasos separados. Para mejorar el rendimiento de la limpieza, puede colocar los electrodos en un baño ultrasónico durante la inmersión y las soluciones de limpieza. Los insectos estarán más activos durante las transiciones entre el día y la noche.

Por lo tanto, se debe establecer un ciclo artificial de día y noche dentro de una cámara para insectos utilizando temporizadores automáticos para enchufes. Estos deben configurarse para simular un ciclo de siete horas de oscuridad y 17 horas de luz. Examine diariamente el manduka sex eye pu eye para determinar el momento adecuado de inserción.

Los ojos pu están listos para la inserción aproximadamente un día después de las alas. Las inserciones en manchas oscuras tienen más éxito cuando se realizan de siete a cuatro días antes del cierre aquí. El pu más oscuro en la parte inferior está listo para la inserción quirúrgica de los electrodos para anestesiar el pui.

Colóquelos en el refrigerador a cuatro grados Celsius durante aproximadamente seis horas. A continuación, prepare la inserción del espacio de trabajo. El espacio de trabajo debe incluir alcohol isopropílico y puntas de pinzas afiladas en una aguja hipodérmica de calibre 30.

Como opción, se puede utilizar adhesivo de cianoacrilato para mejorar la fijación del electrodo, y se deben esterilizar las pinzas de aguja y los electrodos sumergiéndolos o limpiándolos con alcohol isopropílico. Retire el espécimen del refrigerador después de seis horas y transfiéralo al área de trabajo. Determine la ubicación en el tórax dorsal que corresponde al grupo muscular de interés.

Aquí estamos interesados en los músculos dorsoventrales responsables del movimiento del ala hacia arriba. Con una hoja afilada o una aguja hipodérmica, raye suavemente un rectángulo cuadrado de un centímetro por un centímetro a través de la capa del exocutículo. Con las pinzas, retire lentamente estas piezas.

Utilice las pinzas para eliminar el vello de las alas de la región expuesta del tórax. Opcionalmente, se puede utilizar un vacío para ayudar en el proceso de limpieza. Es importante eliminar la mayor cantidad posible de vello para evitar que interfiera con los electrodos insertados.

Inserte lentamente la aguja aproximadamente cinco milímetros en el mesotórax, donde las alas se unen al tórax, para crear dos puntos de inserción dirigidos al grupo muscular. Recuerde la ubicación de los orificios realizados, ya que pueden ser difíciles de encontrar si se pierde su posición. Estabilice la pupa sobre la mesa y utilice pinzas para guiar los dos electrodos de registro hacia los dos puntos de inserción, como una opción para mejorar la durabilidad mecánica.

Limpie todo el cabello alrededor de los electrodos y aplique generosamente adhesivo de ciano acrilato alrededor de cada punto de inserción en el tórax con el aplicador de alambre. Prepare la jaula para ELO con un material áspero y texturizado que cubra las paredes y el techo, para que el insecto pueda trepar. Tras la emergencia, pueden utilizarse cajas de cartón perforado o papel de embalaje.

Prepare una fijación rígida. Utilice una varilla de aproximadamente seis centímetros de longitud y dos milímetros de diámetro. Deslice cuidadosamente esta varilla a través del orificio situado debajo de las pros que sobresalen.

Agitadores de plástico. Un hisopo de algodón o alambres metálicos pueden utilizarse en este paso. Fije ambos extremos del palo sobre la superficie de la jaula de manera que la pupa no pueda rodar.

Coloque la pupa dentro de la jaula de manera que el mesotórax quede orientado hacia arriba. Los movimientos extensos pueden causar daño a los electrodos, pérdida de helio o hacer que la inserción sea inútil. El electrodo de tierra debe insertarse en el abdomen o en las partes distales del tórax.

Para evitar el acoplamiento de señal, la inserción puede realizarse ya sea durante las etapas finales del desarrollo de la pupa o después de que el insecto emerja. El sitio de inserción del electrodo de tierra debe prepararse en esta etapa de pupa, tanto para la inserción en la etapa de pupa como para la inserción en la etapa adulta. A continuación se muestra la inserción del electrodo de tierra en la etapa adulta.

Coloque la polilla en el refrigerador a cuatro grados Celsius durante seis horas. Para la inmovilización mediante tratamiento frío, prepare el área de inserción, que incluye alcohol isopropílico, pinzas finas, una aguja hipodérmica de calibre 30, adhesivo cianocrilato y un trozo de alambre para la aplicación del pegamento, un cauterizador térmico opcional y un bastoncillo de cera dental opcional. Como antes, sumerja la aguja hipodérmica en alcohol isopropílico antes de ponerla en contacto con la polilla; coloque la aguja en un punto de inserción situado aproximadamente entre uno y dos centímetros de distancia de los electrodos de registro, a lo largo del abdomen posterior, e insérrela lentamente para perforar el abdomen y crear un orificio de inserción.

La aguja no debe penetrar más de cuatro milímetros. Si aparece hemolinfa en el sitio de inserción, significa que ha insertado la aguja demasiado profundamente y es menos probable que el procedimiento tenga éxito. Utilizando pinzas, inserte cuidadosamente el electrodo de tierra en el sitio de inserción y aplique presión hasta que alcance una profundidad de tres a cuatro milímetros.

Sostenga el electrodo en su lugar y use un alambre para aplicar pegamento alrededor del sitio de inserción como paso opcional. Para mejorar aún más la resistencia mecánica de la inserción, use el cauterizador térmico y recoja una pequeña cantidad de cera de dos a tres milímetros en la punta. Coloque la punta cerca del sitio de inserción y aplique calor de manera que la cera rodee el electrodo y lo mantenga firmemente en su lugar.

Tras el enfriamiento, permita que el insecto un día para recuperarse de la inserción antes de realizar los experimentos. Se requiere una placa adaptadora con conectores de cable flexible plano para conectar la placa de electrodos del insecto con la unidad de etapa en cabeza internacional de Triangle Biosystems. La placa adaptadora utiliza una placa laminada de cobre grabado que debe prepararse siguiendo los pasos presentados anteriormente para preparar el borde de la placa de electrodos en la estación de soldadura; suelde un conector de cable flexible plano a un extremo de la placa preparada.

Un conector plano flexible de 10 pines puede soldarse a la placa con los dos pares de pines en los bordes del conector y el par central de pines en contacto con las tres pistas de cobre. A continuación, suelde tres cables de conexión de calibre 30 AWG a tres pistas. En el otro extremo de la placa, conecte tres conectores mini a las tres pistas de la placa adaptadora para realizar lecturas con el osciloscopio, como se describe.

En la siguiente etapa, coloque dos de los conectores perpendiculares a los bordes de la placa. El conector central debe estar ligeramente inclinado hacia arriba, alejándose del plano de la placa, y corte el otro extremo de estos tres cables para conectarlo al conector del cabezal. Cortesía de Triangle Biosystems International.

La placa del circuito de la etapa de cabezal debe fijarse luego encima del marco de levitación para ayudar a garantizar la fiabilidad de los electrodos y observar la relación señal-ruido. Pueden obtenerse grabaciones con osciloscopio mediante cable. Antes de implementar el sistema de grabación inalámbrico, conecte el osciloscopio a un amplificador neurológico de grabación de corriente alterna multicanal.

Configure los parámetros del amplificador con una frecuencia de corte de paso alto de un hercio, una frecuencia de corte de paso bajo de 20 kilohercios y una ganancia de 100. Conecte cada uno de los conectores hembra miniatura del cable en la placa adaptadora a los canales de entrada del amplificador. Retire el insecto con la placa de electrodos implantada de la jaula.

Cuando se encuentra en estado activo, se puede colocar un fragmento de tejido debajo de la polilla para que descanse antes de tomar mediciones; utilizando pinzas, deslice la placa de electrodos hacia el conector del cable flexible plano en la placa adaptadora. Retire el tejido situado debajo del insecto y observe la generación de picos de electromiograma. Mientras el insecto aletea, capture y guarde los datos en el osciloscopio.

Esta figura muestra la señal del potencial muscular adquirida con el osciloscopio desde uno de los músculos antes y durante el aleteo de las alas. La señal ha sido procesada con una amplificación de cien veces y un filtro pasaaltos de un hercio y un filtro pasabajas de veinte kilohercios, y el periodo de reposo. No se observan potenciales musculares.

Los potenciales musculares durante el aleteo de las alas ocurren aproximadamente entre 15 y 20 hercios. Una vez que se han recopilado y verificado las mediciones del osciloscopio, se deben obtener las señales inalámbricas de EMG. Se puede construir una plataforma de levitación electromagnética para la grabación inalámbrica de señales de EMG durante el vuelo atado de Manus sex.

La plataforma de levitación consta de un marco diseñado para equilibrar un mecanismo de sujeción. La levitación libre permite que el marco y, por lo tanto, el insecto, se desplacen. Durante las pruebas sin la restricción de los cables de sujeción, el marco puede prototiparse rápidamente utilizando una máquina de modelado por deposición fundida.

Este marco cargado con imanes es levitado por una serie de electroimanes en la plataforma base. Esta plataforma levitadora se encuentra dentro del área de LED, que fue construida utilizando 60 paneles compuestos por una matriz de cinco por siete LED individuales. El área es controlada por el microcontrolador APIC 18 F 45 20, lo que permite simular rotaciones en sentido horario y antihorario, así como controlar la velocidad de rotación.

Configure el sistema inalámbrico de grabación TBSI conectando la etapa de cabezal TBSI al conector de la placa adaptadora en la plataforma de levitación. Retire el insecto de la jaula cuando esté activo, preferiblemente durante su período matutino.

Utilizando pinzas, inserte cuidadosamente la placa del electrodo en el receptor del cable flexible plano del marco levitador, de modo que el insecto quede suspendido firmemente dentro del montaje. Coloque la varilla magnética cerca del interruptor magnético en la etapa de la cabeza para activar la transmisión inalámbrica de datos.

Se encenderá una luz azul que indica que la etapa de cabezal está activa y lista para la grabación. Apague las luces de la habitación para lograr una oscuridad total y abra el software TBSI Neuro Aware en una computadora. Puede utilizar una lámpara roja para añadir iluminación adicional a la habitación.

Seleccione el archivo de configuración adecuado. El archivo de configuración utilizado en este procedimiento es la configuración predeterminada W cinco. A continuación, haga clic en el botón iniciar plataforma en la esquina superior izquierda de la interfaz inicial.

Para comenzar a visualizar las señales, seleccione la pestaña de ventana de todos los canales para observar las señales de EMG en el sistema de registro TBSI. Para garantizar una conexión inalámbrica y un funcionamiento de los electrodos confiables, encienda todos los componentes LED del área, la fuente de alimentación de corriente continua regulada y el microcontrolador. Equilibre lentamente la plataforma de levitación dentro del área.

Seleccione el registro en la pestaña binaria del panel izquierdo de la interfaz de nor aware. Especifique el tiempo de grabación y la ubicación donde guardar el archivo. Elija la configuración de salida adecuada para guardar sus datos.

Haga clic en el botón de inicio para iniciar una sesión de grabación dentro del software de grabación TBSI. Esto guardará su archivo como un archivo .next, que puede importarse a programas de procesamiento de datos comúnmente utilizados.

Observe cómo el insecto vuela en la dirección que corresponde con el movimiento de los LED. Invierta la dirección de los LED y confirme que el insecto invierte su dirección. Realice esto tantas veces como desee. La flecha mostrada indica la dirección de rotación del patrón de LED.

La flecha se vuelve amarilla. Cuando el insecto completa un giro en sentido antihorario, la flecha se vuelve azul cuando el insecto completa un giro en sentido horario. La reproducción de la película mostrada es un 50% más rápida de lo normal.

Esta figura muestra la señal del potencial muscular adquirida mediante el instrumento inalámbrico para un músculo antes y durante el aleteo, en el período de quietud. No se observan potenciales musculares. Los potenciales musculares durante el aleteo ocurren aproximadamente entre 15 y 20 hercios.

Aquí acabamos de mostrar una grabación de un solo canal. Sin embargo, una grabación multicanal realizada con este equipo puede utilizarse para observar la coordinación entre múltiples grupos musculares durante las maniobras de vuelo. Acabamos de mostrarles cómo realizar una inserción de electrodo en una mosca macho durante la etapa metamórfica temprana, desde la pupa.

Es importante sincronizar la inserción en la etapa tardía de la pupa de manera que no sea demasiado temprana ni tardía en esta etapa. De lo contrario, podría tener problemas para obtener una configuración confiable del electrodo. También le hemos mostrado cómo ensamblar los componentes eléctricos necesarios para realizar la grabación inalámbrica de datos de EMG de los músculos indirectos del vuelo mientras el insecto está levitado en la arena de LED.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.