変形性関節症におけるプログラの保護的役割を調査するためにマウスの外科的誘発モデルの確立

この手順の全体的な目標は、マウスでDMMモデルを作成し、DMM手術後の変形性関節症の発症を研究することです。動物を準備した後、膝関節を露出させるために1センチメートルの縦内側傍膝蓋骨切開が行われます。次に、膝関節包を解剖し、膝の内側脱臼を行います。

最後のステップは、内側半月板脛骨靭帯を切断し、膝を縫合することです。最終的には、病理組織学的解析を用いて、関節構造の破壊、プロピオ、糖鎖、変形性関節症の喪失が明らかになります。重症度は、サフランとo染色のMANKINスコアを使用して評価されます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、マウスで行われた手術を見たことがない限り、苦労します。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。詳細な手順を学ぶのが難しく、現在では顕微鏡下で行われるため、膝関節のすべての構造を明確に認識する必要があります。

このモデルを確立するには、体重が約 25 グラムの 8 週から 12 週齢のオス C 57 ブラック シックス マウスに麻酔をかけることにより、内側半月板または DMM 手術の不安定化に備えます。次に、膝の周りの領域を剃った後、眼科用軟膏を目に置きます。ベタジンとアルコールで部位を3回滅菌し、その領域を外科的にドレープします。

膝関節を露出させるために、縦方向に1センチメートルの縦内側傍膝蓋骨切開を行うことから手術を開始します。次に、大腿骨が露出するまで、内側膝蓋骨切開部を通じて膝関節包を縦方向に慎重に切断します。次に、鉗子を使用して、切り口を広く深くすることでカプセル構造を緩めます。

後足の遠位部を片手で優しくつかみます。鉗子を使用して、膝蓋骨と膝蓋骨靭帯の側方脱臼を行います。関節包が切断されている場合、脱臼は多くの力を必要としないはずです。関節軟骨表面に滅菌生理食塩水を手術の残りの部分で

次に、大腿骨の内側顆と脛骨の内側プラトーの間にある内側半月板を特定します。必要に応じて、半月板脛骨靭帯を覆っている脂肪パッドを脇に引っ張って、内側半月板の外側を脛骨の顆間隆起に接続する半月板脛骨靭帯を露出させます。片手で後ろ足を優しく持ちます。

DMM手術は、10番の手術用ブレードで内側半月板脛骨靭帯を丁寧に切り裂き、行います。関節軟骨やその他の靭帯を傷つけないように注意してください。次に、6 aut 吸収性縫合糸で膝関節包を閉じ、6 aut silk 縫合糸で皮膚を閉じます。

術後の痛みを最小限に抑えるために、メロキシカム1キログラムあたり10ミリグラムの皮下注射を行い、麻酔が切れた後にマウスをケージに戻します。手術の数週間後、マウスを犠牲にし、10番の刃で両方の後肢を切除します。その後、後肢から皮膚と筋肉を慎重に解剖し、サンプルを4%パラホルムアルデヒドに室温で3日間固定します。

3日後、パラホルムアルデヒドを除去し、蒸留水でサンプルを3分間洗浄します。その後、EDTAでサンプルを摂氏4度で2週間脱灰します。2週間後、エタノールグラジエントでサンプルを脱水します。

最終的なエタノールを除去した後、サンプルを3つのLene浴にそれぞれ1時間ずつ入れます。次に、サンプルをパラフィン型に埋め込みます。回転式ミクロトームを使用して5ミクロンの切片を作成し、スライドガラス上に切片を収集します。

外側顆の中心から内側顆の中心まで連続矢状切片を引き続き切断して、サフランとoの染色を行います。最初に de セリーヌのスライドを3〜5分間パリゼーションします。セリーヌ風呂を2回繰り返します。

次に、蒸留水で終わるエタノールグラジエントでスライドを水和します。次に、スライドをヴァイゲルトの鉄ヘマチン溶液、0.05%ファストグリーン溶液、1%酢酸溶液、および0.1%サフランとO溶液に通します。次に、軟骨中の赤色プロト糖鎖の色の損失と軟骨構造の破壊率に基づいて、サフランとOで染色されたスライドを樹脂質の媒体スコアでスライドをマウントします。

次に、O-A-R-S-I組織学的スコアリングシステムを使用して統計分析を行います。これらの画像は、偽手術または DMM 手術の 8 週間後、野生型および PG rrn ノックアウトマウスのサフランと O 染色された膝関節を示しています。偽の手術後、どちらの遺伝子型でも軟骨の明らかな変性はありません。

しかし、A DMM手術の8週間後、軟骨の赤色の消失で示されるプロチオグリカンの喪失、また野生型とPGRNノックアウトマウスの両方で赤矢印で示される軟骨構造の破壊が見られ、変形性関節症の表現型の誘導が成功したことを示しています。DMM手術後、野生型マウスとPGRNノックアウトマウスの変形性関節症スコアの比較。DMM手術後、ノックアウトマウスでは有意に高いスコアが示され、PGRNの欠損がより重篤な変形性関節症の表現型につながったことが示された。

この手法は、適切に実行すれば10〜15分で実行できます。このビデオを見れば、DMMの一括操作の方法について十分に理解できるはずです。