ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング
2011年9月13日
この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。
この手順の全体的な目標は、ランゴール灌流ウサギの心臓における光学マッピング技術を使用して、伝導、再分極、不整脈形成、カルシウムの取り扱いなどの心臓電気生理学的特性を研究することです。これは、最初に大動脈を介して無傷のウサギの心臓を分離し、逆行性灌流することによって達成されます。手順の次のステップは、心臓の表面を露出させ、心臓の収縮を廃止し、Coler BLEsスタチンの興奮収縮を使用し、電位感受性およびカルシウム蛍光インジケーターを使用して心筋を適切に染色することです。
次に、心室心外膜の大部分からの光学活動電位の記録は、パノラマ光学マッピングシステムを使用して行われます。次に、光信号は、心臓心外膜表面の再構築された3D形状にマッピングされます。このステップでは、非パノラマデュアルイメージングシステムを使用して、光学活動電位とカルシウム過渡現象を同時に記録できます。
この手順は、空間的および時間的な心筋、興奮および再分極、およびカルシウムの取り扱いの一致特性の定量的データを提供し、規則的なリズムだけでなく、心房および心室性不整脈中に分析することができます。こんにちは、私の名前はDr.Iger Eovです。私はセントルイスのワシントン大学で医用生体工学の教授をしています。
今日紹介する光学技術は、数万、数万の活動電位とカルシウム過渡現象を同時に記録できるため、従来のマイクロおよびマイクロ電位に比べて多くの利点を持つ独自の技術です。さらに、この技術は、電気刺激や除細動によって生じるアーチファクトの影響を受けず、電位によって記録された活動電位を強く歪めます。さらに、カルシウムの過渡現象は、この手法によってのみ記録できます。
他に選択肢はありません。この方法は、生命を脅かす心房性および心室性不整脈の誘導、維持、および終了のメカニズムや、先天性心疾患、代謝性疾患、心不全などの疾患における伝導化と興奮および構築カップリングの機能モデリングなど、心臓電気生理学の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。手術の準備ができたら、ペントバルビタールナトリウムとヘパリンのカクテルでウサギを安楽死させます。
ウサギが痛みの反射に反応しなくなったらすぐに、胸を開いて心臓と肺を切除します。大動脈アーチのすべての枝がポンプをオンにして、非再循環LRF灌流システムのTyro溶液の流れを開始する前に、上行大動脈の上端に切り込みを入れます。LOR灌流システムに接続された16ゲージの大動脈カニューレに心臓を素早く取り付けます。
大動脈から空気を洗い流し、完全に灌流されたら大動脈カニューレを結びます。心膜を切り開くのに時間を無駄にしないでください。次に、心臓と結合組織を囲む肺気管脂肪を取り除きます。
虚血を引き起こす左心室に体液が溜まるのを防ぐことは非常に重要です。したがって、シリコンドレーンチューブを肺静脈と僧帽弁から左心室に挿入します。次に、カニューレで心臓を光学マッピングシステムを備えた再循環式ラングアドルフ灌流システムに移動します。
カスタムメイドの六角形チャンバーに心臓を置き、カニューレを灌流システムに接続します。圧力トランスデューサを使用して大動脈圧をモニターし、灌流ポンプの流量を調整して、約60±5ミリメートルの水銀柱に維持します。pHを7.35±0.05前後に維持します。
室内の照明を消し、カニューレの上にある気泡トラッパーの注入口から、感光性BLEスタチンストック溶液をゆっくりと注入します。10マイクロモルのBLEsスタチンの濃度に達するには、0.1ミリリットルのBLEsスタチンをゆっくりと注入します。ボーラス注入のたびに、圧力が安定するのを待ってから次の注入を行います。
フォトダイオードアレイまたはPDAを、心臓の周囲に3つの等間隔の角度に配置します。次に、各PDAで、画像面のすりガラスに心臓の画像に焦点を合わせます。六角形チャンバーと各PDAのカニューレの位置を調整し、心臓が3つのPDAすべての視野に収まるまで
調整します。次に、すりガラスに焦点を絞った各画像の写真を撮ります。10〜20マイクロリットルのD 4 Anep原液を、気泡トラップの注入口から灌流溶液にゆっくりと注入します。そして3分待ちます。
次に、ペーシング電極を目的の場所にそっと置きます。ここでは、心臓の正面図の中心に配置されています。PDAからの同時光記録を開始します。
光信号にモーションアーチファクトがなく、信号対雑音比がその後のデータ分析に十分であることを確認してください。終了したら、部屋の照明をつけ、PDAの1つの位置に配置されたカメラから10度回転するごとに1枚の写真を撮って、心臓の写真記録を作成します。次に、灌流システムのクリーンアップに進みます。
カニューレを装着した心臓をラドエッチなガラスチャンバーに入れ、カニューレを灌流システムに接続します。心室尖と心房のチャンバーのシリコン底に心臓を固定します。心臓を固定するには、室内の照明を消し、注入口からBLEsスタチンをゆっくりと注入して、溶液表面の動きを減らします。
心筋表面の上にガラス窓カバーを置きます。.手順のこの部分は通常、暗闇で行われますが、光の中で行われます。ビデオ画像を改善するには、デュアルイメージングシステムを心臓の上部に動かします。
次に、2 つの CMO カメラを同じ視野に合わせます。次に、励起フィルター付きの2つのハロゲンランプのライトガイドを配置します。注入ポートを通して10〜20マイクロリットルの電圧感受性染料RH2 37を追加して心臓を染色します。
次に、200マイクロリットルのロード2:00 AMとonic F1 27をバブルトラップポートを介して1対1の混合物で追加します。マッピングを開始する前に、道路のDS化を午前2:00に許可するために約20分待ちます。次に、テスト録音を行います。
溶液の表面での動きを避けるために、超融着ポンプをオフにしてください。ハロゲンランプを点灯し、両方のカメラから光学記録を撮ります。次に、励起ライトをオフ
にしてください。スーパーフュージョンポンプの電源を入れ、光信号の品質を確認します。信号が弱い場合は、追加のRH2 37とロード2:00 AMで心臓を塗り替えます。モーションアーティファクトがある場合は、BLEスタチンを追加して、すべてを順番にモーションを削除します。計画された実験を進め、システムをクリーンアップします。
完成した後、パノラマ光学マッピングシステムを使用して、Lang Endorf灌流ウサギの心臓の正面図を示しました。比較すると、心臓の形状を再構築すると、同じ正面図が表示されます。ここに示されている包み出されていない心外膜表面は、位相ごとに色分けされています。
心臓は、ローターの周りの5か所から粘着性不整脈のエピソードを受けていました。光学的活動電位が提示されました。ここで赤は、安定した再走性不整脈のサイクル中に伝播する活性化波面です。
波面は、心臓の前面にある位相特異点を中心に時計回りに回転します。再分極は透明な青色で表示され、後面の波面を視覚化できます。心臓は、活動電位とカルシウム過渡現象の同時マッピングを示すために、デュアルマッピングシステムを使用して分析されました。
1つのサイトからの記録のクローズアップビューは、活動電位が青、カルシウムが過渡的であることを示しています。サンプル トレースの配列は、この前方ビューのドットで示されているように、等間隔に配置されたサイトの配列から示されています。これらのデータは、ピクセルあたり200ミクロン×200ミクロンの光学解像度で収集されました。
この治療の意味は、電気療法中の強い電気刺激の影響を直接視覚化できるため、心房および心室10K不整脈の除細動療法を拡張します。それを可能にする他の方法はありません。この方法を用いて、心房細動や心室頻拍に対する新しい低電圧無痛収縮療法を開発し、検証します。
概要
この記事では、パノラマイメージングシステムを使用して、Langendorff灌流ウサギ心臓で光学マッピング実験を行う手順について説明します。研究は、伝導とカルシウム処理を含む心臓の電気生理学的特性に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学の領域
- 心臓の電気生理学
- 光学マッピング技術
- 不整脈発症
背景
- 光学マッピングは、活動電位とカルシウム遷移の同時記録を可能にします。
- この方法は、心臓機能と不整脈に関する洞察を提供します。
- 従来の方法は、電気刺激からのアーティファクトによって制限される可能性があります。
- 研究では、Langendorff灌流ウサギ心臓モデルを使用しています。
研究の目的
- 心臓の伝導、再分極、不整脈発症を調査すること。
- 心筋のカルシウム処理を分析すること。
- 興奮と再分極のダイナミクスに関する定量的データを提供すること。
使用された方法
- ウサギの心臓の分離と逆行性灌流。
- 電位依存性およびカルシウム蛍光指標による心筋の染色。
- パノラマ光学マッピングシステムを使用した光学活動電位の記録。
- 光学活動電位とカルシウム遷移の同時デュアルイメージング。
主要な結果
- 心筋の空間的および時間的特性の定量的データ。
- 不整脈と心臓疾患のメカニズムに関する洞察。
- 光学マッピングが従来の電気図よりも有利であることの実証。
結論
- 光学マッピングは心臓の電気生理学を研究するための強力なツールです。
- この技術は、不整脈研究の主要な質問に答えるのに役立ちます。
- 将来の研究は、この方法を活用して心臓機能のより深い洞察を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optical mapping in Langendorff-perfused rabbit hearts enables high-resolution, artifact-free visualization of cardiac electrophysiology, supporting mechanistic de-risking in arrhythmia target validation. This approach provides quantitative spatial-temporal data on action potentials and calcium transients, directly informing predictive confidence in preclinical models of ventricular and atrial arrhythmias. The method bridges discovery biology and translational research by enabling reproducible, scalable assessment of pro-arrhythmic liability and therapeutic response in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping reentrant wave dynamics and phase singularities during induced arrhythmias.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous voltage and calcium imaging to de-risk excitation-contraction coupling mechanisms.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying arrhythmogenic substrate vulnerability under controlled perfusion conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline electrophysiological and calcium handling phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through Langendorff perfusion control and dye-staining protocols.
- Scalability: Highlights screening readiness via panoramic and dual imaging systems capable of simultaneous multi-site optical recording.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses rabbit heart model with demonstrated similarity to human excitation-contraction coupling and arrhythmia wave patterns.
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through quantitative analysis of conduction, repolarization, and calcium handling during regular rhythm and arrhythmia.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing mechanistic insights into arrhythmia induction, maintenance, and termination.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, enabling iterative refinement of antiarrhythmic candidates based on electrophysiological and calcium handling profiles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing rotor dynamics and action potential calcium transient relationships during arrhythmogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible optical signal acquisition with sufficient signal-to-noise ratio for spatial-temporal analysis.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of excitation and repolarization dynamics, enabling comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via disease-relevant arrhythmia models and calcium handling insights relevant to heart failure and metabolic disease.
- Enterprise Reuse: Frames the optical mapping system as a reusable platform for assessing multiple compounds or genetic modifications in a standardized perfused heart preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in arrhythmia mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of electrophysiological and calcium transient measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative arrhythmia liability data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac isolation, Langendorff perfusion, and fluorescent dye handling.
- Needs optical mapping systems with photo diode arrays or CMOS cameras, light sources, and perfusion pressure control.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, excitation-contraction uncoupling, and signal acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations for species-specific flow rates, optics, and dye loading when extending beyond rabbit hearts.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching, motion artifact susceptibility, and the need for precise temperature and pH maintenance during experiments.
