ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

この手順の全体的な目的は、ラングドル灌流 rabbit 心臓における光学マッピング技術を用いて、伝導、再分極、不整脈誘発、およびカルシウムハンドリングなどの心臓電気生理学的特性を研究することです。まず、rabbit 心臓を摘出し、大動脈を介して逆行性灌流を行います。次に、心臓表面を露出させ、excitation-contraction 解離剤を用いて心収縮を停止させ、電位感受性およびカルシウム蛍光指示薬を用いて心筋を適切に染色します。

次に、パノラマ光学マッピングシステムを用いて、心室心外膜の広範囲から光学的な活動電位の記録を行います。その後、これらの光学信号を再構築した心外膜表面の3Dジオメトリ上にマッピングします。このステップにおいて、非パノラマのデュアルイメージングシステムを使用することで、光学的な活動電位とカルシウムトランジェントを同時に記録することが可能です。

この手順では、心筋の空間的および時間的な興奮と再分極、ならびにカルシウムハンドリングの整合的な特性に関する定量的なデータを提供し、これらは正常リズムのほか、心房および心室の不整脈時においても解析可能です。こんにちは、私はDr. Iger Eovです。セントルイスのワシントン大学で生物医学工学の教授を務めています。

本日ご紹介する光学的手法は、従来のマイクロ電極やマイクロエレクトログラムに対して多くの利点を持つ独自の技術であり、数十から数万件のアクションポテンシャルとカルシウムトランジェントを同時に記録することが可能です。さらに、本技術は電気刺激や除細動によって生じるアーチファクトの影響を受けません。これらのアーチファクトは、あらゆるエレクトログラムで記録されるアクションポテンシャルに強い歪みを与えます。また、カルシウムトランジェントは本手法を用いることでのみ記録可能です。

他に代替策はありません。この手法は、致死的な心房および心室不整脈の誘発、維持、および停止のメカニズムや、先天性心疾患、代謝性疾患、心不全などの疾患における伝導系、興奮、および興奮収縮連関の機能モデリングなど、心臓電気生理学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。手術の準備が整い次第、ペントバルビタールナトリウムとヘパリンの混合液を用いてウサギを安楽死させます。

ウサギが疼痛反射に反応しなくなった直後に、胸腔を開き、心臓と肺を摘出します。大動脈弓のすべての分枝よりも上の上行大動脈の上端を切断し、非再循環式LRF灌流システムでTyro液の流れを開始させるためにポンプを起動します。速やかに心臓を、LOR灌流システムに接続された16ゲージの大動脈カニュラに取り付けます。

大動脈内の空気を十分に排出し、灌流が完了したら大動脈カニューレを縛ります。速やかに心膜を切開してください。その後、心臓周囲の肺・気管脂肪および結合組織を除去します。

左心室内の液体蓄積は虚血を引き起こすため、これを防ぐことが非常に重要です。したがって、シリコンドレンチューブを肺静脈と僧帽弁を通して左心室に挿入します。次に、カニューレで心臓を、光学マッピングシステムを備えたLangendorf再循環灌流システムへと移動させます。

心臓を特製の六角形チャンバーに配置し、カニューレを灌流システムに接続します。圧力トランスデューサーを用いて大動脈圧をモニタリングし、灌流ポンプの流量を調整することで、大動脈圧を60 ± 5 mmHgに維持します。pHは7.35 ± 0.05付近に維持してください。

室灯を消し、カニューレ上部の気泡除去トラップにある注入ポートから、光感受性のBLEs statinストック溶液をゆっくりと注入します。BLEs statinの濃度を10 µMにするには、0.1 mLのBLEs statinをゆっくりと注入してください。ボルタス注入を行う際は、次の注入の前に圧力が安定するまで待機してください。

フォトダイオードアレイ（PDA）を、心臓の周囲に等間隔に3つの角度で配置します。次に、各PDAにおいて、心臓の像を像面のすりガラス上に結像させます。心臓が3つすべてのPDAの視野に収まるまで、ヘキサゴンチャンバー内のカニューレの位置と各PDAの位置を調整します。

次に、すりガラス上の各フォーカス済み画像を撮影します。気泡トラップの注入ポートから、D4 Anepストック溶液10〜20 µLを灌流液にゆっくりと注入し、3分間待ちます。

次に、ペーシング電極を目的の部位にそっと配置します。ここでは、心臓の前面図の中央に配置しています。PDAによる同時光学記録を開始してください。

光学信号にモーションアーチファクトがなく、その後のデータ解析に十分な信号対雑音比（S/N比）が確保されていることを確認してください。完了後、室内の照明を点灯し、PDAの一方が配置されている位置にあるカメラを用いて、10度回転させるごとに1枚ずつ心臓の写真を撮影し、記録を作成します。その後、灌流システムの片付けを行ってください。

カニュレーションを施した心臓をラド・ノーティ・ガラスチャンバーに配置し、カニューレを灌流システムに接続します。心室尖端部および心房部で、心臓をチャンバーのシリコン底面にピンで固定します。心臓を固定するため、室内の照明を消し、溶液表面の揺れを抑えながら注入ポートから徐々にBLEs statinを注入します。

心外膜表面の上にガラスウィンドウカバーを配置します。この手順は通常、暗所で行われますが、ここでは明所で実施しています。ビデオ映像を改善するため、デュアルイメージングシステムを心臓の上に移動させます。

次に、2台のCMOSカメラを同一の視野に合わせます。続いて、励起フィルターを備えた2つのハロゲンランプのライトガイドを配置します。注入ポートから10～20 µLの電位感受性色素RH 2 37を添加し、心臓を染色します。

次に、ロード 2:00 AM と onic F1 27 を 1:1 で混合した液 200 µL をバブルトラップポートから注入します。マッピングを開始する前に、ロード 2:00 AM の DS 化を完了させるため、約 20 分間待ちます。その後、テスト録画を行ってください。

溶液表面の揺らぎを防ぐため、スーパーフュージョンポンプをオフにします。ハロゲンランプを点灯し、両方のカメラで光学記録を行います。その後、励起光をオフにします。

灌流ポンプを起動し、光学信号の品質を確認します。信号が弱い場合は、RH 2 37とroad 2:00 AMを追加して心臓を再染色してください。モーションアーティファクトがある場合は、BLEs statinを追加して、すべての状態を整えつつ動きを除去します。計画した実験を遂行し、システムを洗浄してください。

完了後、パノラミック光学マッピングシステムを用いて、Lang Endorf法で灌流したウサギ心臓のこの前面図を示しました。比較として、心臓幾何学の再構成による同じ前面図を示します。ここに表示されている展開された心外膜表面は、位相によって色分けされています。

心臓では、ローター周囲の5箇所から頻脈性不整脈が発生していました。光学的な活動電位が表示されています。赤色で示されているのは、安定したリエントリー不整脈のサイクル中に伝播する活動波面です。

波面は、心臓の前表面にある位相特異点（phase singularity）を中心に時計回りに回転しています。後表面の波面を可視化するため、再分極は透明な青色で表示されています。心臓はデュアルマッピングシステムを用いて解析されており、活動電位とカルシウム過渡現象の同時マッピングが示されています。

1つの部位からの記録の接写では、活動電位が青色で、カルシウム・トランジェントが赤色で示されています。この前面図の点で示される等間隔に配置された部位から得られた、サンプル波形の配列が示されています。これらのデータは、1ピクセルあたり200 microns × 200 micronsの光学分解能で収集されました。

この治療法の意義は、電気治療中の強力な電気刺激の効果を直接視覚化できるため、心房および心室の不整脈に対する除細動療法を拡張できる点にあります。これと同等のことが可能な代替法は他にありません。本手法を用いることで、心房細動および心室頻拍に対する、低電圧で痛みのない新しい除細動療法を開発し、その有効性を検証しました。