Name: La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprende a analizar estados de activación de macrófagos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa. Esta técnica rápida y rentable permite discriminar perfiles específicos de células inmunes.

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Richard Ouedraogo cuenta con el apoyo de una beca del Ministère de la Santé (PHRC 2010). Agradecemos a Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops y Nicolas Amstrong por su asistencia técnica.

En el presente protocolo, se utiliza la técnica MALDI-TOF de célula entera para obtener un espectro de masas considerado como una huella dactilar de la muestra. Un análisis bioinformático permitió la comparación y clasificación de estas huellas dactilares. Había tres partes principales en este protocolo:
<ol>
	<li>La preparación de las muestras biológicas: control de macrófagos y macrófagos estimulados con diferentes agonistas.</li>
	<li>El análisis de cada tipo de muestra con réplicas técnicas mediante MALDI-TOF MS de célula entera.</li>
	<li>El análisis bioinformático de los datos brutos.</li>
</ol>
Prepare soluciones estériles para el aislamiento y cultivo celular. Prepare y almacene todos los reactivos a 4 °C
1. Preparación de monocitos humanos
<ol>
	<li>Preparar el medio de cultivo celular. Añadir 55 ml de suero humano AB+ o suero fetal bovino (FBS) y 5 ml de la solución antibiótica (penicilina a 10.000 UI/ml y estreptomicina a 10.000 μg/ml; concentración final de 100 UI/ml para la penicilina y 100 μg/ml para la estreptomicina) al medio RPMI 1640 (500 ml).
	<ol>
		<li>Aísle células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucopacks (concentrados de leucocitos).
		<ol>
			<li>Prepare tubos de 50 ml que contengan 15 ml de Ficoll. Diluir la sangre en solución salina (vol/vol, 1/10). Deposite 30 ml de PBMC diluidos en Ficoll como se describió anteriormente26.</li>
			<li>Centrífuga a 700 x g durante 20 min. Recuperar PBMCs en la interfaz entre Ficoll (densidad de 1,077 g/ml) y plasma diluido. Diluir las PBMC en medio de cultivo y centrifugar a 300 x g durante 5 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare monocitos CD14+ a partir de PBMC utilizando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD14. 
		Nota: Mantener los productos y las células a 4 °C hasta la obtención del monocito.
		<ol>
			<li>Prepare un tampón de funcionamiento compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2, albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM.</li>
			<li>Disocie suavemente las PBMC granuladas (10a 7 células por ensayo) en 80 μl de tampón corriente.</li>
			<li>Agregue 20 μl de MicroBeads CD14 a las PBMC. Mezcle e incube las PBMC durante 15 minutos. Lave las PBMC con 5 ml de tampón corriente y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Disocie suavemente las PBMC peletizadas en 500 μl de tampón de funcionamiento para 108 PBMC. 
			Nota: utilice 500 μl de tampón de funcionamiento para concentraciones de PBMC inferiores a 108 PBMC.</li>
			<li>Proceda a la separación magnética. 
			Nota: para menos de 2 x 108 PBMC, use la columna MS; para más de 2 x 108 PBMC y menos de 2 x 109 PBMC, use la columna LS.</li>
			<li>Enjuague la precolumna y la columna con tampón de funcionamiento (500 μl para la columna MS o 3 ml para la columna LS).Agregue PBMC en la precolumna (espere a que las celdas sin etiquetar pasen a través de la columna). Enjuague 3 veces con tampón de ejecución (500 μl para la columna MS o 3 ml para la columna LS). Retire la precolumna.</li>
			<li>Coloque la columna en tubos de 15 ml. Añada tampón de ejecución (1 ml para la columna MS o 5 ml para la columna LS) en la columna y eluya las células CD14+ aplicando una presión sobre la columna.</li>
			<li>Centrifugar el eluido a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Lave el pellet de monocitos con 10 ml de medio de cultivo. 
			Nota: Analice la pureza de la preparación de monocitos utilizando anticuerpos anti-CD14 y citometría de flujo (clásicamente superior al 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diferenciación de monocitos en macrófagos.
	<ol>
		<li>Incubar los monocitos (10,6 monocitos por pocillo en placas de 6 pocillos) en 3 ml de medio de cultivo que contenga un 10% de suero humano AB+ a 37 °C. Después de 4 días, reemplace el medio de cultivo que contiene suero humano por 3 ml de medio de cultivo que contenga 10% de FBS durante 3 días adicionales.</li>
		<li>Identifique la población celular obtenida como macrófagos derivados de monocitos (MDM) mediante citometría de flujo (ver Figura 1).
		<ol>
			<li>Sustituya el medio de cultivo por 3 ml de PBS. Raspe los MDM con un policía de goma y recoja las suspensiones de MDM. Centrifugar a 400 x g durante 5 min. Agregue PBS que contenga un 2% de BSA a los MDM granulados y agite suavemente la suspensión celular. Ajustar la concentración celular (106 MDMs en 200 ml de PBS) e incubar a 4 °C.</li>
			<li>Añadir 10 ml de anticuerpos anti-CD14 y 10 ml de anticuerpos anti-CD68 a la suspensión de MDM e incubar a 4 °C durante 20 min en la oscuridad. 
			Nota: estos anticuerpos deben marcarse con dos fluorocromos diferentes de acuerdo con el análisis de citometría de flujo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD14 se pueden conjugar con ficoeritrina acoplada (para la tinción de monocitos) y anticuerpos anti-CD68 con Alexa Fluor 647 acoplado (para la tinción de macrófagos).</li>
			<li>Centrifugar los MDM a 400 x g durante 5 min. Eliminar los sobrenadantes. Disociar suavemente el gránulo de celda e incubar los MDM en 250 ml de paraformaldehído (PFA) al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar MDM fijados con PFA a 400 x g durante 5 min. Lave los MDM con 3 ml de PBS y centrifugue los MDM a 400 x g durante 5 min. Disociar suavemente el pellet de MDM en 400 ml de PBS.</li>
			<li>Analizar la diferenciación de monocitos (que expresan CD14 pero no CD68) en monocitos (que expresan CD68 pero no CD14). Nota: clásicamente, más del 95% de las células son MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estimulación de MDMs durante 18 horas.
	<ol>
		<li>Reemplace el medio de cultivo de los MDM adheridos por un medio de cultivo fresco de 3 ml (que contenga 10% de FBS).</li>
		<li>Para inducir una polarización M1 o M2, utilice las siguientes citocinas recombinantes humanas: IFN-γ y TNF para la polarización M1, e IL-4 para la polarización M2. Los macrófagos M1 también se obtienen por estimulación con LPS. Obsérvese que las soluciones madre de citocinas se conservan a -80 °C y que la solución madre de LPS se conserva a -20 °C.
		<ol>
			<li>Diluir la solución madre de IFN-gγ (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de IFN-γ a los MDM para obtener una concentración final de IFN-γ de 20 ng/ml.</li>
			<li>Diluir la solución madre de TNF (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de TNF a los MDM para obtener una concentración final de TNF de 20 ng/ml.</li>
			<li>Diluir la solución madre de IL-4 (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de IL-4 a los MDM para obtener una concentración final de IL-4 de 20 ng/ml.</li>
			<li>Añadir 3 μl de la solución madre de LPS (1 mg/ml) a los MDM para obtener una concentración final de LPS de 1 μg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Para estimular los MDM con bacterias, use bacterias muertas por calor. Lave las bacterias vivas con PBS y caliéntelas a 95 °C durante 1 hora. El uso de Orientia tsutsugamushi (cepa Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP cepa 671203) y Coxiella burnetii (Nine Mile en fase I) se debió a que se sabe que estos patógenos infectan a los macrófagos. Por lo tanto, prepare una suspensión de O. tsutsugamushi a 109 bacterias/ml. Agregue 50 μl a los MDM. Repita el mismo paso para M. bovis y C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de muestras biológicas para MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>Lave los MDM estimulados con PBS sin Ca2+ o Mg2+ (las células pueden aglutinarse en presencia de Ca2+ o Mg2+). Raspe los MDM con un policía de goma y recoja las suspensiones de MDM. Lave de nuevo los MDM en PBS sin Ca2+ o Mg2+ a 400 x g durante 5 minutos para descartar la contaminación por FBS.</li>
		<li>Ajuste la concentración de células (2 x 106 MDM por ensayo). Centrifugar los MDM a 400 x g durante 5 min y desechar los sobrenadantes. Recoja los gránulos celulares en 20 μl de PBS sin Ca2+ o Mg2+.</li>
		<li>Analice las muestras inmediatamente o guárdelas en PBS a -80 °C antes del análisis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Análisis de macrófagos por MS Maldi-TOF de células enteras
<ol>
	<li>Elaboración de matriz CHCA.
	<ol>
		<li>Agregue 500 μl de acetonitrilo, 250 μl de ácido trifluoroacético al 10% y 250 μl de agua de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) a un vial. Diluya 10 mg de CHCA en esta solución hasta una concentración final de 10 mg/ml. Mezclar y sonicar durante al menos 20 min. 
		Nota: la sonicación mejorará la saturación de la matriz, pero este paso no es obligatorio.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el pellet y conserve el sobrenadante. 
		Nota: prepare la solución de matriz justo antes de usarla. Una solución de matriz que contiene cristales no permite una buena ionización de las moléculas de la muestra, y esto puede afectar la calidad de los espectros.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de la diana de acero MALDI.
	<ol>
		<li>Humedezca el objetivo de acero pulido con agua caliente del grifo. Frote con papel de limpieza de precisión. Agregue etanol al 70% y frote. Enjuague con agua frotando. Agregue etanol al 70% y frote con papel de precisión.</li>
		<li>Sumerja el objetivo en etanol al 70% y soniquelo durante al menos 15 min. Cubra el objetivo con 500 μl a 1 ml de ácido trifluoroacético al 80%. Frote y limpie con papel de precisión. Enjuague con agua HPLC sin frotar. Seque el objetivo a temperatura ambiente. 
		Nota: un objetivo mal limpiado puede afectar a la calidad de los espectros.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de depósitos.
	<ol>
		<li>Coloque el objetivo limpio sobre un soporte horizontal y nivelado para obtener depósitos uniformes.</li>
		<li>Descongele suavemente las muestras de MDM en hielo. Nota: una descongelación rápida y vigorosa puede alterar las muestras, afectando así a la calidad de los espectros. Homogeneizar los MDM (pipeteando hacia adelante y hacia atrás la suspensión celular) antes de la deposición de 1 μl (que contiene aproximadamente 1 x 105 células) en el objetivo MALDI. Añadir 1 μl de la solución de matriz MALDI en la muestra. Evite mezclar la mancha con la pipeta. La mezcla de puntos con pipetas altera la calidad de los espectros. Deponer 12-16 muestras/ensayo (réplicas técnicas).</li>
		<li>Se evapora espontáneamente a temperatura ambiente. Nota: la evaporación tiene lugar gradualmente y conduce a la formación de cristales de matriz/muestra. Los depósitos pueden analizarse inmediatamente o almacenarse en la oscuridad durante varios días antes del análisis (hasta 2 semanas).</li>
		<li>El usuario debe controlar que las citocinas o bacterias muertas por calor utilizadas en el experimento no proporcionen picos dentro del rango de espectros de los macrófagos estimulados. Aquí, comprobamos que las citocinas y las bacterias muertas por calor por sí solas no proporcionaban ninguna señal dentro del rango estudiado (0-20 kDa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajuste de espectrómetro de masas y adquisición de datos.
	<ol>
		<li>Inserte el objetivo de acero que contiene muestras en el espectrómetro de masas.</li>
		<li>Configure el espectrómetro de masas y ejecute la adquisición de datos. Utilice la configuración predeterminada para la adquisición automatizada de los datos.</li>
		<li>Nota: en el apéndice/Tabla 1 se ofrece una visión detallada de la configuración del software flexControl. Esto puede variar según el espectrómetro de masas y el software utilizado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Análisis bioinformático
Nota: el análisis bioinformático se realizó utilizando el software de análisis estadístico libre y de código abierto R, junto con bibliotecas de análisis específicas (MALDIquant). R se puede descargar gratuitamente desde su sitio web <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. Se proporciona una descripción detallada del guión como <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">material complementario.</a>
<ol>
	<li>Carga y pretratamiento de datos brutos.
	<ol>
		<li>Almacene los datos sin procesar en el equipo asociado con el espectrómetro de masas en varios archivos y carpetas. Recupere la carpeta raíz del experimento con todas las subcarpetas. Copie la carpeta raíz en la computadora personal para su análisis.</li>
		<li>Utilice las bibliotecas readBrukerFlexData y MALDIquant para cargar y analizar datos sin procesar. 
		Nota: readBrukerFlexData permite la carga de datos sin procesar del espectrómetro de masas en un objeto específico en R para su posterior análisis. Para más información, véase la descripción de MALDIquant 27.</li>
		<li>Analice los espectros generados. 
		Nota: cada espectro consta de una lista de picos con sus respectivas masas e intensidades (abundancia relativa). Utilice la raíz cuadrada de las intensidades para mejorar la visualización gráfica de los espectros. Corrija el fondo utilizando un algoritmo de recorte de picos no lineal sensible a estadísticas para la estimación de la línea base27. Utilice una relación señal-ruido de 6 para detectar picos. Tenga en cuenta que los picos detectados son similares en todos los espectros cuando los valores de masa/carga (m/z) están dentro de una ventana de 2.000 ppm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definición y cálculo de puntuaciones. Clasifique los espectros utilizando un agrupamiento jerárquico con un algoritmo de barrio para la aglomeración y una matriz de disimilitud basada en la distancia de Jaccard. 
	Nota: el índice de Jaccard mide la similitud entre conjuntos de muestras booleanas (es decir, la presencia/ausencia de una lista de picos).</li>
	<li>Comparación de espectros y visualización.
	<ol>
		<li>Analice gráficos de espectros sin procesar. Nota: el eje x representa la relación m/z (en Daltons) y el eje y representa la intensidad (abundancia relativa).</li>
		<li>Evaluar la similitud entre espectros mediante agrupamiento jerárquico. Representa la similitud (o divergencia) como dendrograma.</li>
		<li>Evaluar la reproducibilidad mediante la representación virtual en gel-view. Nota: la representación virtual de vista gel es un gráfico de mapa de calor modificado donde la abundancia relativa está codificada por colores con intensidades crecientes de azul.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar. RO, JLM y CC son inventores de una patente internacional WO 2011/154650, denominada "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Este protocolo describe el uso de MALDI-TOF-MS en células enteras eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión del método analizando los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microambiente.
El éxito del protocolo depende de pocos pasos críticos. Primero, cualquier contaminante de solución puede alterar los espectros. Por ejemplo, es importante lavar las células en PBS para eliminar el medio de cultivo y las proteínas séricas antes de depositarlas en el objetivo. Tamb...

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es una técnica popular de espectrometría de masas para estudiar muestras biológicas. El uso de un rayo láser y una matriz absorbente de energía permite un proceso de ionización suave: la evaporación y génesis de grandes biomoléculas, en su mayoría de carga única. Este proceso se denomina desorción/ionización, justificando el acrónimo MALDI. A continuación, estos iones se aceleran mediante la aplicación de voltaje y entran en un analizador TOF que permite la separación de estos iones y la cuantificación de sus respectivas masas1.
MALDI-TOF MS se ha utilizado ampliamente en biología, química y medicina para identificar moléculas y biomarcadores2-4 o para monitorear modificaciones postraduccionales en proteins5,6. Recientemente, varios grupos aplicaron MALDI-TOF MS a la identificación de microorganismos a partir de muestras clínicas7,8. En la actualidad, esta aplicación microbiológica se utiliza de forma rutinaria en los entornos clínicos. El MALDI-TOF de célula completa tiene muchas ventajas en comparación con las aplicaciones clásicas de MALDI-TOF MS. Las muestras que contienen células enteras se procesan directamente, lo que evita pasos que consumen mucho tiempo para fraccionar o separar grandes cantidades de material. Además, no es necesaria la caracterización de los distintos picos: todo el espectro se considera como una huella dactilar de la muestra, y los algoritmos de coincidencia comparan el espectro probado con una base de datos de espectros de referencia.
Nosotros y otros hemos aplicado esta técnica de análisis de células enteras a células eucariotas. De esta técnica se pueden derivar muchas aplicaciones: (1) identificar los principales tipos de células a partir de una muestra mixta9-11; (2) evaluar la viabilidad de los cultivos celulares a lo largo del tiempo (incluidas las aplicaciones industriales de control de calidad)12; (3) monitorear los estados de activación de una sola célula tipo13; (4) evaluar la transformación maligna de una muestra clínica14,15.
Aquí, describimos el uso de MALDI-TOF MS de célula entera para explorar los diversos fenotipos de polarización de los macrófagos en respuesta a citocinas o bacterias muertas por calor. Los macrófagos desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria a los patógenos microbianos. Detectan agentes infecciosos en los tejidos a través de receptores de reconocimiento de patrones capaces de detectar patrones microbianos conservados, como el lipopolisacárido (LPS)16. Los macrófagos son células presentadoras de antígenos profesionales que interactúan con las células T para montar la respuesta inmunitaria adaptativa. Las células T influyen en los macrófagos mediante la liberación de citocinas que refuerzan o regulan la actividad microbicida de los macrófagos. Por analogía con la polarización de linfocitos Th1/Th2, los macrófagos inflamatorios, microbicidas y tumoricidas se han clasificado en macrófagos M1 y macrófagos inmunorreguladores como macrófagos M217-19. El término M1 se refiere a la activación clásica de los macrófagos por citocinas de tipo I, como el interferón (IFN)-γ y el factor de necrosis tumoral (TNF), o productos bacterianos, como el LPS18,20-23, mientras que los macrófagos activados por vías alternativas (interleucina (IL)-4, IL-10, Factor de Crecimiento Transformante-β1 se consideran macrófagos M219,24,25. La alta plasticidad fenotípica y funcional de los macrófagos en respuesta a su microambiente hace que estos macrófagos sean útiles para analizar cambios sutiles mediante un enfoque MALDI-TOF MS.

la espectrometría de masas maldi-tof de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF es una técnica de espectrometría de masas ampliamente utilizada en química y bioquímica. También se ha aplicado en medicina para identificar moléculas y biomarcadores. Recientemente, se ha utilizado en microbiología para la identificación rutinaria de bacterias cultivadas a partir de muestras clínicas, sin pasos de preparación o fraccionamiento. Nosotros y otros hemos aplicado con éxito esta técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras a células eucariotas. Las aplicaciones actuales van desde la identificación de tipos de células hasta el control de calidad, la evaluación de cultivos celulares y aplicaciones de diagnóstico. Aquí, describimos su uso para explorar los diversos fenotipos de polarización de los macrófagos en respuesta a citocinas o bacterias muertas por calor. Permitió la identificación de huellas dactilares específicas de macrófagos que son representativas de la diversidad de respuestas proteómicas de los macrófagos. Esta aplicación ilustra la precisión y simplicidad del método. El protocolo que describimos aquí puede ser útil para estudiar la respuesta inmune del huésped en condiciones patológicas o puede extenderse a aplicaciones diagnósticas más amplias.

El objetivo del presente protocolo es demostrar la precisión de la MALDI-TOF MS de células completas para evaluar la respuesta de los macrófagos a su microambiente.
Figura 1 describe la preparación de macrófagos estimulados a partir de muestras de sangre. Figura 2 representa el análisis de monocitos y MDM mediante citometría de flujo. Obsérvese que los monocitos expresaron CD14 pero no CD68 (Figura 1A). Por el contrario, los MDM expresaron CD6...

Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras en células eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión de esta técnica mediante el análisis de los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microentorno.

La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

Este experimento utiliza células completas múltiples para espectrometría de masas. Para analizar con precisión los múltiples estados de activación de los macrófagos, primero derive los macrófagos a partir de monocitos positivos para CD14 y luego estimule las células con agonistas como citocinas y bacterias. Analice las muestras mediante moly en un blanco de acero, separando las proteínas y obteniendo un espectro para cada muestra.Los resultados de huellas específicas pueden discriminar entre diversos estados de activación de una única célula eucariota, el macrófago, basándose en un análisis bioinformático de los espectros obtenidos mediante espectrometría de masas de células completas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la citometría de flujo es que es rápida, sencilla y no costosa. En este experimento, demostramos que se obtuvieron espectros reproducibles a partir de macrófagos y que se logró discriminar entre distintos estados de activación mediante la célula completa ov.También obtenemos espectros del BBMC, que podrían ser útiles para el diagnóstico de la respuesta del huésped a la infección. Este método puede proporcionar información sobre los estados de activación de las células inmunitarias. Asimismo, podría aplicarse a otros sistemas, como el perfilado de conceptos para reemplazar, por ejemplo, el análisis ex extra durante la cirugía, aíslense las células del opax en tubos de 50 mililitros.Añada 15 mililitros de fi call, diluya la sangre diez veces en solución salina. Luego, separe 30 mililitros de la sangre diluida en el gradiente fol. Después de recuperar el anillo de CPMs, mantenga las células en hielo.Disociar suavemente los PBMCs en pellet en 80 microlitros de tampón de corrida. Añadir 20 microlitros de perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD14. Mezclar e incubar durante 15 minutos.Lave una vez con cinco mililitros de tampón de lavado y centrifugue a 300 G durante cinco minutos. Disocie suavemente las células sedimentadas en 500 microlitros de tampón de lavado. Seleccione la columna adecuada para la separación magnética.Lave el precolumna y la columna con tampón de corrida. A continuación, cargue los PBMC sobre el precolumna. Aplique un campo magnético y lave tres veces con tampón de corrida.Retire el precal y coloque la columna en un tubo de 15 mililitros. Añada tampón de elución y eluya las células positivas para CD14 aplicando presión sobre la columna. A continuación, centrifugue.Centrifugar a 300 G durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante. Lavado del pellet de monocitos con 10 mililitros de medio de cultivo.Tomar una alícuota del medio para determinar la pureza de la preparación de monocitos mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-CD14. Sembrar los monocitos en tres mililitros de medio de cultivo que contenga suero humano al 10%, de tipo AB positivo, durante cuatro días. Luego, sustituir el medio por RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal y determinar la población celular obtenida como macrófagos derivados de monocitos mediante citometría de flujo.Estimule las muestras según el diseño experimental. Después de lavar los MDM estimulados con PBS, raspe las células con la espátula de goma y recoja las suspensiones de MDM. Pelote las células por centrifugación y luego lávelas una vez con PBS para eliminar restos de FBS.Centrifugar los M dms para obtener el sedimento y resuspender los sedimentos en 20 microlitros de PBS. Analizar las células inmediatamente o almacenarlas en PBS a menos 80 grados Celsius antes del análisis. Para preparar la matriz de CHCA, añadir 500 microlitros de acetonitrilo, 250 microlitros de ácido trifluoroacético al 10% y 250 microlitros de agua grado HPLC a un vial.Luego, agregue 10 microlitros de la mezcla CHCA y someta la matriz a ultrasonido durante al menos 20 minutos. Centrifugue a 13.000 G durante cinco minutos, guarde el sobrenadante y deseche el sedimento. A continuación, humedezca la placa de acero pulido con agua corriente caliente y frótela con papel blanco de precisión.Añada etanol al 70 % y frote las RIN con agua. Luego, añada etanol al 70 % y frote con papel de precisión. Sumerja el objetivo en etanol al 70 % y someta a ultrasonidos durante al menos 15 minutos.Cubra el objetivo con 500 microlitros a un mililitro de ácido fluoroácido al 80%, frótelos y limpie con papel de precisión. Luego enjuague con agua grado HPLC sin frotar. Seque el objetivo a temperatura ambiente.Ahora descongele suavemente las muestras de MDM sobre hielo. Mezcle la suspensión de células MDM mediante pipeteo y deposite un microlitro sobre el blanco de MALDI. Añada un microlitro de la solución de matriz MALDI sobre la muestra.Para réplicas técnicas. Deposite de 12 a 16 muestras por ensayo; el disolvente evapora espontáneamente a temperatura ambiente. Ahora, inserte el blanco de acero que contiene las muestras en el espectrómetro de masas.Configure el espectrómetro de masas y realice la adquisición de datos. Cada espectro consiste en una lista de picos con sus masas e intensidades respectivas, que indican la abundancia relativa. Utilice la raíz cuadrada de las intensidades para mejorar la visualización gráfica de los espectros.Luego, corrija el fondo utilizando un algoritmo no lineal de recorte de picos sensible a estadísticas. Para la estimación de la línea base, aplique una relación señal a ruido de seis para detectar picos. Tenga en cuenta que los picos detectados son similares en los espectros cuando los valores de masa/carga se encuentran dentro de una ventana de 2000 PM.En este experimento, se prepararon macrófagos estimulados a partir de muestras de sangre. Los monocitos se seleccionaron según la expresión de CD14, pero no de CD68. Por el contrario, los macrófagos derivados de monocitos se identificaron por la expresión de CD68, pero no de CD14.Estos datos ilustran el papel de las preparaciones de muestras en la interpretación de los resultados de MALDI toff MS. Un espectro de buena calidad generalmente contiene un pico principal alrededor de cinco kilodaltons. Se requiere una concentración mínima de células para obtener muestras adecuadas, como lo indica este espectro de baja calidad obtenido con una concentración baja de células.Se obtienen resultados similares deficientes cuando la muestra se mezcla con la matriz antes de depositarla en la placa objetivo. Aquí, los espectros de diversas muestras se representan como un mapa de calor. La abundancia relativa se codifica por colores mediante intensidades de azul.Esta representación en vista de gel virtual ilustra la reproducibilidad de las muestras dentro de cada clase. Un análisis no supervisado mediante agrupamiento jerárquico se resume como un diagrama. Todas las muestras se agruparon en tres grupos diferentes.MDM no estimulados, MDM estimulados con IFN gamma o MDM estimulados con IL-4. Es importante destacar que el análisis MALDI TOF permite la discriminación de macrófagos M1 frente a macrófagos M2 y MDM no estimulados. La representación de picos de un espectro de referencia para MDM estimulados con IFN gamma, IL-4 o no estimulados muestra picos específicos para cada clase.Se pueden inducir huellas dactilares específicas mediante varios agonistas para ilustrar la precisión del maloff celular completo. De hecho, los espectros de todas las muestras estimuladas se separaron claramente de los de los macrófagos no estimulados. Los MDM también exhibieron huellas dactilares específicas inducidas por bacterias muertas por calor.Estos resultados respaldan la hipótesis de que la MALDI puede utilizarse para analizar células circulantes y evaluar la respuesta del huésped a infecciones o enfermedades inflamatorias en el entorno clínico cuando la muestra está lista. Esta técnica puede completarse en una hora si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar los estados de activación de células caóticas mediante espectrometría de masas de células completas por OV.

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La espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras es un método rápido y preciso para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

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Aprende a analizar estados de activación de macrófagos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa. Esta técnica rápida y rentable permite discriminar perfiles específicos de células inmunes.

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La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

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