Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como In Vitro Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de la lesión por estiramiento como modelo de lesión cerebral traumática. Esto se logra cultivando primero células endoteliales microvasculares y pozos de fondo flexible. El segundo paso es diferenciar las células mediante la reducción del suero fetal de ternero en el medio de cultivo.

A continuación, las células se lesionan utilizando el dispositivo de estiramiento de células. El paso final es evaluar el grado de lesión en las células. En última instancia, la lesión inducida por estiramiento en las células endoteliales del cerebro se utiliza para mostrar la lesión en la barrera hematoencefálica in vitro.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la lesión cerebral traumática porque modela el impacto real que se produce durante la LCT en la barrera hematoencefálica utilizando la lesión por estiramiento de las células endoteliales cerebrales marinas. La Dra. Elaine Salvador, postdoc de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento cultivando las células endoteliales microvasculares del cerebro marino en un matraz de cultivo T 75.

Cambie el medio dos veces por semana hasta alcanzar la confluencia. A continuación, lave las celdas con PBS. A continuación, retire el PBS y los tryps.

Analice las células con dos mililitros de solución tibia de EDTA. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos o hasta que la capa celular se disperse. Después de eso, a ocho mililitros de medio de cultivo en las células, golpee el matraz varias veces para separar las celdas.

Observe las células bajo el microscopio para asegurar un desprendimiento completo del matraz. A continuación, pipetee el medio con células desprendidas hacia arriba y hacia abajo. Agite el matraz para mezclar la suspensión de celdas después.

Agregue 20 microlitros de la suspensión celular en un hemocitómetro y cuente el número de células. Determine la densidad de celdas y vea 20.000 células por centímetro cuadrado en el pozo. A continuación, transfiere la suspensión celular a colágeno.

Un seis precodificado. Placas de cultivo de fondos flexibles para pozos en un volumen total de tres mililitros por pocillo. Cambie el medio de cultivo dos veces por semana y cultive las células a 37 grados centígrados durante una semana hasta que confluyan.

Para la diferenciación celular, cambie el medio de cultivo de las células con medio de diferenciación e incube las células a 37 grados centígrados durante 24 horas. En este procedimiento, encienda el dispositivo controlador de lesiones celulares, establezca el retraso en 50 milisegundos. A continuación, ajuste la presión del regulador a 15 PSI y presione el gatillo un par de veces hasta que la presión máxima registrada se estabilice.

A continuación, ajuste la presión del regulador al valor deseado. Después de eso, coloque la placa de cultivo de seis fondos flexibles en el soporte de la bandeja. Asegúrese de que el selector de pozos esté configurado en el tamaño de pozo correcto.

A continuación, coloque el enchufe adaptador firmemente sobre el, bien sostenga el enchufe firmemente en su lugar con una mano con la otra mano empujando el gatillo para registrar la presión máxima generada después. Vuelva a colocar inmediatamente la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante el período de tiempo deseado, o utilícela inmediatamente para experimentos o evaluaciones posteriores para evaluar la lesión por estiramiento mediante el ensayo de absorción de DI. Inmediatamente después de que las células se estiran a 30 microlitros de un miligramo por mililitro de la tinción de viabilidad que actúa como marcador de citotoxicidad para el medio de cultivo celular.

Evaluar la lesión por estiramiento por liberación de lactato deshidrogenasa. Después del estiramiento, las células eliminan inmediatamente 200 microlitros de medio de cultivo celular de la célula, bueno, haga lo mismo por cada punto de tiempo después de la lesión que desee incluir en su investigación de la liberación de LDH. A continuación, centrifugar el medio de cultivo celular en la configuración más alta de una microcentrífuga durante cinco minutos.

Para eliminar cualquier residuo celular, retire el sobrenadante y utilícelo para los pasos siguientes. Una vez que se han tomado las muestras necesarias de varios puntos temporales, se lian las células utilizando la solución de lisis incluida en el kit de ensayo de LDH. Después de eso, agregue 100 microlitros del medio de ensayo incluido en el kit de ensayo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos provista en el kit.

A continuación, añada 100 microlitros del medio de cultivo celular libre en dos pocillos paralelos de los 96. La placa de pocillos incuba la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos y lee la absorbancia a 492 nanómetros. Aquí se muestra el examen de microscopía óptica de células normales contra células lesionadas.

La monocapa de células de confluencia normal no estirada está muy compacta y alargada cuando las células se estiran aplicando un pulso de presión máxima de 1,8 a 2,0 PSI, parecen menos compactas. Cuando las células están moderadamente lesionadas con un pulso de presión máxima de 2,5 a 3,0, algunas de ellas parecen hinchadas y deformes. Las células se retraen con un estiramiento severo de 3,5 a 4,5 PSI.

Aquí está el examen microscópico de fluorescencia de células normales contra lesiones lesionadas. Las células fueron tratadas con tinción de viabilidad dos horas después de la lesión. Estas son las células de control no estiradas, las células moderadamente estiradas y las células muy estiradas.

Esta figura muestra la liberación de la enzima LDH en el snat después de la lesión por estiramiento La LDH liberada en el cultivo. El medio se midió en varios intervalos de tiempo después de la lesión inducida por estiramiento y se expresó como un porcentaje del total de L-D-H-L-D-H liberado de las células que fueron sometidas a un estiramiento bajo y moderado. No difiere significativamente de la de los controles no estirados y entre sí.

Las células que se estiraron severamente liberaron una cantidad significativamente mayor de LDH en comparación con todas las demás muestras, excepto la muestra moderadamente estirada una hora después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran in vitro la lesión cerebral traumática en células endoteliales cerebrales marinas.