Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de la lesión por estiramiento como un modelo de lesión cerebral traumática. Esto se logra primero cultivando células endoteliales microvasculares en pozos con fondos flexibles. El segundo paso consiste en diferenciar las células mediante la reducción de suero de feto bovino en el medio de cultivo.

A continuación, las células se lesionan utilizando el dispositivo estirador celular. El paso final consiste en evaluar el grado de lesión en las células. En última instancia, la lesión inducida por estiramiento en células endoteliales cerebrales se utiliza para mostrar la lesión en la barrera hematoencefálica in vitro.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la lesión cerebral traumática porque modela el impacto real que ocurre durante la LCT en la barrera hematoencefálica, utilizando una lesión por estiramiento de células endoteliales cerebrales marinas. El procedimiento será demostrado por la Dra. Elaine Salvador, posdoctoranda de mi laboratorio. Comience este procedimiento cultivando las células endoteliales microvasculares cerebrales marinas en un matraz de cultivo T 75.

Cambie el medio dos veces por semana hasta alcanzar la confluencia. A continuación, lave las células con PBS. Luego retire el PBS y la tripsina.

Trate las células con dos mililitros de solución tibia de EDTA tripsina. Incube las células a 37 grados Celsius durante cinco minutos o hasta que la capa celular se haya dispersado. A continuación, añada ocho mililitros de medio de cultivo a las células y golpee el frasco varias veces para desprender las células.

Observe las células bajo el microscopio para asegurar la desprendimiento completo del frasco. Luego, aspire y expulse el medio con las células desprendidas varias veces con una pipeta. Agite suavemente el frasco para mezclar la suspensión celular posteriormente.

Añada 20 microlitros de la suspensión celular a un hemocitómetro y cuente el número de células. Determine la densidad celular y siembre 20.000 células por centímetro cuadrado en el pocillo. A continuación, transfiera la suspensión celular al colágeno.

Una placa de cultivo de seis pocillos con fondos flexibles y un volumen total de tres mililitros por pocillo. Cambie el medio de cultivo dos veces por semana y cultive las células a 37 grados Celsius durante una semana hasta alcanzar confluencia.

Para la diferenciación celular, cambie el medio de cultivo de las células por medio de diferenciación e incube las células a 37 grados Celsius durante 24 horas. En este procedimiento, encienda el dispositivo controlador de lesión celular y establezca el retardo en 50 milisegundos. A continuación, ajuste la presión del regulador a 15 PSI y presione el disparador varias veces hasta que la presión pico registrada se estabilice.

Luego, ajuste la presión del regulador al valor deseado. A continuación, coloque la placa de cultivo de fondos flexibles de seis pocillos en el soporte de bandeja. Asegúrese de que el selector de pocillos esté configurado al tamaño de pocillo correcto.

Luego, coloque firmemente el enchufe adaptador sobre el, mantenga el enchufe firmemente en su lugar con una mano mientras con la otra presiona el disparador y registre la presión máxima generada posteriormente. Inmediatamente coloque la placa de nuevo en el incubador a 37 grados Celsius durante el tiempo deseado, o utilícela inmediatamente para experimentos o evaluaciones posteriores para evaluar la lesión por estiramiento mediante el ensayo de absorción de DI. Inmediatamente después de que las células son estiradas, agregue 30 microlitros de una solución de tinción de viabilidad de un miligramo por mililitro, que actúa como marcador de citotoxicidad, al medio de cultivo celular.

Para evaluar la lesión por estiramiento mediante la liberación de lactato deshidrogenasa. Después del estiramiento, retire inmediatamente 200 microlitros de medio de cultivo celular del pocillo, y haga lo mismo para cada punto temporal post-lesión que desee incluir en su estudio de liberación de LDH. A continuación, centrifugue el medio de cultivo celular a la máxima velocidad de una microcentrífuga durante cinco minutos.

Para eliminar cualquier resto celular, retire el sobrenadante y utilícelo para los pasos posteriores. Una vez que se hayan tomado las muestras necesarias de los diferentes puntos temporales, lise las células utilizando la solución de lisis incluida en el kit del ensayo de LDH. A continuación, agregue 100 microlitros del medio de ensayo incluido en el kit de ensayo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos proporcionada en el kit.

Luego, agregue 100 microlitros del medio de cultivo celular libre de células en dos pocillos paralelos de la placa de 96 pocillos. Incube la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos y lea la absorbancia a 492 nanómetros. Aquí se muestra el examen mediante microscopía óptica de células normales frente a células dañadas.

La monocapa de células en confluencia normal, sin estirar, está estrechamente empaquetada y alargada; cuando se aplica un pulso de presión máxima de 1,8 a 2,0 PSI, las células aparecen menos compactas. Cuando las células sufren un daño moderado con un pulso de presión máxima de 2,5 a 3,0 PSI, algunas de ellas parecen hinchadas y deformadas. Las células se retraen tras un estiramiento severo de 3,5 a 4,5 PSI.

Aquí se muestra el examen microscópico de fluorescencia de células normales frente a células dañadas. Las células fueron tratadas con un colorante de viabilidad dos horas después del daño. Estas son las células de control sin estirar, las células estiradas moderadamente y las células estiradas severamente.

Esta figura muestra la liberación del enzima LDH al medio después de una lesión por estiramiento. La LDH liberada al medio de cultivo se midió en diversos intervalos de tiempo tras la lesión inducida por estiramiento y se expresó como un porcentaje del total de LDH liberable proveniente de células sometidas a estiramiento leve y moderado. No presentó diferencias significativas respecto a los controles sin estiramiento ni entre sí.

Las células que fueron severamente estiradas liberaron una cantidad significativamente mayor de LDH en comparación con todas las demás muestras, excepto con la muestra moderadamente estirada a una hora después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran la lesión cerebral traumática en células endoteliales cerebrales marinas in vitro.