Name: Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende un ensayo de citometría de flujo de alto rendimiento para detectar anticuerpos contra NMDA-R o D2R en suero humano. Este método cuantitativo mejora el diagnóstico de trastornos inmunomediados neurológicos.

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Este trabajo fue apoyado por el Health and Medical Consejo Australiano de Investigaciones Científicas, la Fundación Científica Star (Australia), el síndrome de Tourette Asociación (EE.UU.), la esclerosis múltiple Trish Fundación para la Investigación y la Investigación de Esclerosis Múltiple Australia, Fundación Petre (Australia), el Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Agradecemos a todos los pacientes y familiares que proporcionaron muestras para nuestro estudio.

<html> 1. Subclonación Estrategia para Construir pIRES2-EGFP vector que codifica D2R o NMDAR <ol><li> Obtener ADNc de longitud completa clon de D2R humano o de NMDAR subunidad 1 (NR1). </li><li> Elija un vector de expresión, tal como pIRES2-EGFP, que es adecuado para la expresión de proteínas de transmembrana con una proteína verde fluorescente (GFP) indicador bajo el control de un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), permite que tanto los antígenos y GFP para ser coexpressed en células por separado. </li><li> Subclónese ADNc humano dentro de pIRES2-EGFP del vector. <ol><li> Para subclonar ADNc, utilizar enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo NheI y XhoI para D2R ADNc humano). </li><li> CDNA corte Ligar insertar dentro restringido vector pIRES2-EGFP. </li><li> Secuencia ligada pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vector para comprobar si el vector contiene la secuencia correcta. </li><li> Purifica y amplificar D2R pIRES2-EGFP o NMDAR vector para su posterior uso en la transfección. </li></ol></li></ol>í tulo &quot;&gt; 2. HEK293 La transfección de células para la expresión de antígeno neuronal <ol><li> Células de cultivo HEK293 en matraces de cultivo de tejidos con medio Eagle modificado fresco de Dulbecco (1x) (DMEM) completo con 4,5 g / l de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg / piruvato de sodio L suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 2 mM de GlutaMAX, y 50 mg / ml de gentamicina. </li><li> Separar las células HEK293 usando tripsina y la transferencia a un tubo cónico. <ol><li> Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento de células en DMEM completo fresco. </li></ol></li><li> Contar las células y placas de semillas 6 pocillos a aproximadamente 8 x 10 5 células / pocillo y la cultura durante la noche en DMEM 2 ml a 37 ° C y 5% de CO 2 en una incubadora. </li><li> Una vez que han llegado a cerca del 70% de confluencia, transfectar las células HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (+ células HEK293 D2R), y (células HEK293 CTL; control de vectores) pIRES2-EGFP de la siguiente manera.Mantenga algunas células HEK293 transfectadas de indemnización más adelante. <ol><li> Preparar el volumen necesario de mezcla de transfección que comprende 2,5 g de ADN, 200 l de cloruro de sodio 0,9% y 4 mg / ml de polietilenimina / pocillo (cada uno conteniendo 2 ml de DMEM completo fresco). </li><li> Inmediatamente agite la mezcla durante 10 s y se incuba a temperatura ambiente (TA) durante 10 min, antes de la adición de volumen de mezcla de transfección a los pocillos apropiados. </li><li> Cubrir la placa, envuelva los lados con Parafilm, y centrifugar a 280 xg durante 5 minutos para ayudar a la transfección de células. </li><li> Retire el Parafilm y luego colocar en la incubadora para cultivo a 37 ° C. </li><li> Vuelva a colocar los medios de cultivo de 18 horas más tarde con DMEM completo fresco, y mantener en cultivo durante otras 72 horas. </li><li> Opcional: 72 horas después de la transfección, las células transfectadas se pueden seleccionar mediante el cultivo en DMEM completo suplementado con 250 g / ml de geneticina, con el fin de obtener un transfectante estable policlonal. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. La citometría de flujo ensayo basado en células para la detección de anticuerpos contra los antígenos de superficie neuronales <ol><li> Separar HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, y células HEK293 de CTL mediante incubación con 500 l / pocillo Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C. <ol><li> Resuspender en 2ml/well de PBS (-Ca 2 + / Mg 2 +) suplementado con FBS al 2% (PBS / FBS) y traslado a unas 15 ml o 50 ml tubo cónico. </li><li> Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento celular en 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavado 2x. </li><li> Contar las células y luego volver a suspender en PBS / FBS al 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> Diseño de la plantilla de 96 pocillos para la adquisición de citometría de flujo, teniendo en cuenta que + células HEK293 D2R + o HEK293 NMDAR, así como células HEK293 CTL tendrán que ser incubados con cada muestra de paciente o anticuerpo primario. </li><li> Se siembran las células en una placa de 96 pocillos de fondo en V a 50 000 células / nosotrosLL de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación de la placa de 96 pocillos a 450 xg durante 5 min y suavemente eliminar el sobrenadante usando una pipeta multicanal electrónica o manual, inclinando la placa en un ángulo y teniendo cuidado de no aspirar el sedimento celular. </li><li> Incubar HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, y células HEK293 CTL durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con: <ol><li> Diluciones seriadas de anticuerpo primario con el fin de evaluar la expresión del antígeno de superficie. </li><li> Las muestras de pacientes con el fin de detectar anticuerpos. </li></ol></li><li> Utilice flujo apropiado citometría controles de compensación, por ejemplo. células HEK293 no transfectadas no teñidas, GFP + células HEK293 (AF647 -), y AF647 + células HEK293 no transfectadas (GFP). </li><li> Lavar las células por centrifugación a 450 xg durante 5 min y resuspender el sedimento de células en 170 l de PBS / FBS. Repita el paso de lavado dos veces más. </li><li> Se incuban las células durante 1 hr a TA en la oscuridad con una dilución 1:100 de anticuerpo secundario AF647-conjugado (IgG anti-humana para el suero del paciente y anti-IgG de ratón para el anti-NR1 o anti-D2R anticuerpos primarios). </li><li> Lavar las células tres veces, como en el paso 3.7, y volver a suspender en 35 l de PBS / FBS para citometría de flujo de células de adquisición. </li><li> Configure el muestreador de alto rendimiento (HTS) en el citómetro de flujo (BDLSRII). </li><li> Adquirir 10.000 eventos / pocillo de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición. </li><li> Export y luego analizar los datos para el análisis utilizando una citometría de flujo paquete de software, tales como FlowJo v7.5: <ol><li> En primer lugar, puerta de las células HEK293 vivos basada en adelante (tamaño) y lateral (granularidad) dispersa. </li><li> HEK293 células vivas Además de puerta basado en alta GFP-positividad para analizar sólo las células transfectadas. </li><li> Determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la canal AF647 dentro de las células positivas para GFP en vivo. </li><li> Exportar datos a Excel o Prism para el análisis: <ol><li> Terreno concentrations de anticuerpo primario (anti-NMDAR o anticuerpo anti-D2R) frente al IMF obtuvieron a partir de las células incubadas con estos anticuerpos. </li><li> Para cada paciente y control de ejemplo, determinar el ΔMFI restando el MFI de las células HEK293 de CTL de la IMF de las células HEK293 NMDAR + D2R + HEK293 o, respectivamente. </li><li> Calcule el umbral de positividad de anticuerpos mediante la adición de tres desviaciones estándar por encima de la ΔMFI media de la cohorte de control. </li><li> Muestras individuales Parcela agrupan de acuerdo a su tipo de suero en un gráfico y representan el umbral como una línea. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
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<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
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<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
<li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li>
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<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
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<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Conflicto de intereses: Una patente ha sido presentada por el FB y el RCD (Universidad de Sydney), alegando D2R como objetivo para autoanticuerpos.

En este trabajo se describe una nueva aplicación de la citometría de flujo ensayo basado en células vivas para detectar anticuerpos dirigidos a proteínas neuronales específicas de la superficie celular usando un muestreador de alto rendimiento. Usando esta técnica, nos informan de que un subgrupo de pacientes afectados con enfermedades del SNC autoinmunes tienen anticuerpos séricos a aflorar a la superficie NMDAR o D2R. Los pasos esenciales para la detección óptima de anticuerpos utilizando ...

En los últimos años, se han identificado formas autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Se ha demostrado que estas enfermedades están asociadas y definen por la presencia de autoanticuerpos. Estos anticuerpos se unen a los receptores neuronales o proteínas sinápticas implicadas en la neurotransmisión 1,2. Diferentes antígenos se han detectado, tales como receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor de γ-aminobutírico B (GABA B) del receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolpropiónico (AMPA) 7, el canal de potasio dependiente de voltaje (VGKC) proteínas asociadas: rica en leucina 1 glioma proteínas activadas (LGL-1) y contactina asociada a la proteína 2 (capsr2) receptor de 8,9, glutamato 5,10 , y la dopamina-2 del receptor (D2R) 11. En el pasado, estos trastornos del SNC autoinmunes (principalmente llamados encefalitis) eran a menudo sin diagnosticar y sin tratar. Estos biomarcadores de anticuerpos novedosos, por ejemplo,Anticuerpos NMDAR o anticuerpo D2R, han mejorado sustancialmente el diagnóstico y la sensibilización, y se han abierto las opciones de tratamiento para los pacientes. De hecho, el tratamiento temprano con inmunoterapias se asocia con un mejor resultado 11,12. Los métodos tradicionales para detectar anticuerpos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y Western Blot se han utilizado para la detección de anticuerpos en el suero. Sin embargo, no permiten fácilmente el reconocimiento de epítopos extracelulares o de superficie y, más bien, pueden revelar inmunorreactividad hacia un epítopo intracelular. Además, los anticuerpos que se unen al dominio extracelular de las proteínas importantes implicadas en la neurotransmisión es probable que sean 2,3,7,13,14 patógena. Por lo tanto, el desarrollo de ensayos precisos y sensibles para descubrir superficie de la célula relevante o los objetivos de anticuerpos extracelulares en los pacientes es de suma importancia. El método estándar de oro en el campo se basa en el uso de células vivas, en la así llamada &quot;célula-BAensayos de sed &quot;. Este método implica la expresión de un antígeno en la superficie de células de mamíferos (de riñón (293) más a menudo células embrionarias humanas HEK293) en su forma nativa por la transfección de vectores que contienen la secuencia completa de ADNc del antígeno de interés. Nonpermeabilized células vivas se incubaron después con suero diluido del paciente y seguidas por-fluorocromo conjugado anti-inmunoglobulina humana (Ig) anticuerpo secundario. Después se detecta la intensidad o nivel de fluorescencia y se asocia con el nivel de unión de autoanticuerpos. Esta técnica es específica, ya que sólo un antígeno se sobreexpresa en las células. El más ampliamente utilizado &quot;lectura&quot; ha sido el análisis de microscopía confocal después de inmunocitoquímica 4,5,8-10. Sin embargo, la citometría de flujo ensayos basados ​​en células se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos en pacientes con enfermedades desmielinizantes 15-17. En particular, Waters et al. 15 compararon la detección de anticuerpos usando una cacerolaEL de técnicas de detección de anticuerpos, incluyendo ensayos basados ​​en células, seguido por microscopía o el flujo de análisis de citometría, y ha demostrado citometría de flujo ensayo basado en células para ser el método más sensible, preciso y fiable. Por lo tanto, citometría de flujo ensayo basado en células es ventajosa, ya que es cuantitativo, no investigador-dependiente, y no implica ningún uso de material radiactivo. También es conveniente, ya que permite a las grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo en un corto período de tiempo. Más recientemente, hemos optimizado un flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células para detectar anticuerpos de NMDAR y D2R anticuerpo en pacientes con enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central 11. Nuestro grupo detectado recientemente anticuerpo de NMDAR en sueros de pacientes usando citometría de flujo ensayo basado en células. Estos NMDAR sueros anticuerpos positivos fueron analizados previamente por microscopía confocal y también resultaron ser positivos 11. Este protocolo describe una citometría de flujo ensayo basado en células para la detección de canticuerpo SNC onformation-sensible en el suero del paciente utilizando un muestreador automatizado de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>Vector pIRES2-EGFP</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Receptor humano de HA-dopamina-2 (D2R) ADNc</td><td>Missouri S& Centro de Recursos de ADNc</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Subunidad humana 1 del ADNc</td><td></td><td></td> NMDAR (NR1) <td>Regalo del Prof. A. Vincent&nbsp; (Oxford, Reino Unido)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-NR1 monoclonal purificado de ratón (clon: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>IgG monoclonal anti-DRD2 purificado de ratón (clon: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 burro anti-ratón IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 cabra anti-humano IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Águila Modificado (1x) 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) con rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit de purificación de PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>Plásmido&nbsp; Además&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del equipo/software</td><td></td><td>Empresa Número de catálogo</td><td>Modelo/Versión</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo con sistema de muestreo de alto rendimiento</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII con HTS</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (con lámpara de mercurio y fuente de alimentación U-RFLT50)</td></tr><tr><td>Pipeta electrónica multicanal (15-300 &mu; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12 canales Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>50 ml tubos cónicos de polipropileno</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Embalaje de plástico</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Fondo en V de 96 pocillos placa</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la n-metil-d-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Durante los últimos años, los anticuerpos contra las proteínas de superficie y conformacionales implicados en la neurotransmisión se han detectado en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central en niños y adultos. Estos anticuerpos se han utilizado para guiar el diagnóstico y el tratamiento. Ensayos basados ​​en células han mejorado la detección de anticuerpos en el suero del paciente. Se basan en la expresión de superficie de antígenos del cerebro en las células eucariotas, que luego se incubaron con sueros de paciente diluida seguido por anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo. Después del lavado, el anticuerpo secundario de unión se analizó a continuación por citometría de flujo. Nuestro grupo ha desarrollado un flujo de alto rendimiento de la citometría de ensayo basado en células vivas para detectar de forma fiable anticuerpos contra los receptores de neurotransmisores específicos. Este método de citometría de flujo es sencillo, cuantitativa, eficiente, y el uso de un sistema de toma de muestras de alto rendimiento permite grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo fácilmente en un corto espacio de tiempo. Además, esta basado en células comodecir se puede adaptar fácilmente para detectar anticuerpos a muchas dianas antigénicas diferentes, tanto desde el sistema nervioso central y la periferia. El descubrimiento de biomarcadores de anticuerpos novela adicionales permitirá un diagnóstico precoz y preciso y mejorar el tratamiento de los trastornos autoinmunes.

HEK293 células vivas D2R + y CTL HEK293 fueron adquiridas en el citómetro de flujo usando un muestreador de alto rendimiento. Durante el análisis, las células fueron cerrada sobre la base de dispersión frontal (tamaño) y los parámetros de dispersión lateral (granularidad) (Figuras 1A y 1D). Células HEK293 transfectadas expresan la molécula informadora, GFP, en el citoplasma, y las células no transfectadas fueron excluidos del análisis (Figuras 1B y...

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en detectar anticuerpos neuronales contra el receptor D2 o el receptor NMDA en muestras de pacientes mediante un ensayo celular basado en citometría de flujo de alto rendimiento. Esto se logra clonando la secuencia completa de ADNc del receptor D2 humano o del receptor NMDA dentro de un plásmido. Como segundo paso, se transfecta una línea celular humana, lo que conduce a la expresión en la superficie celular de antígenos neuronales.A continuación, las células transfectadas se incuban con suero de paciente y un anticuerpo secundario apropiado antes de la adquisición por citometría de flujo. Con el fin de detectar la unión de anticuerpos a antígenos de superficie celular, los resultados se obtienen en función del análisis de citometría de flujo. Nuestro ensayo celular basado en citometría de flujo de alto rendimiento con tres canales es rápido, cuantitativo y eficiente para grandes cohortes de muestras de pacientes.Esta es una ventaja significativa frente al uso de un ensayo basado en células con inmunoquímica y análisis confocal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la pérdida de células durante el transcurso del experimento para obtener el número adecuado de células en el citómetro de flujo. Tenga cuidado de no aspirar las células entre los lavados.Seleccione un vector de expresión adecuado para la expresión de proteínas transmembrana y que permita la coexpresión celular de los antígenos y la proteína verde fluorescente por separado. Por ejemplo, este vector posee un gen reportero GFP mejorado bajo el control de un sitio de entrada de ribosomas internos. Clone la secuencia completa del CD humano en el vector utilizando las enzimas de restricción apropiadas. Después de verificar los clones mediante secuenciación, prepare stocks de plásmidos adecuados para su uso en la transfección de cultivos. Las células HEK 293 en DMEM completo con 10 % de suero bovino fetal.Recoger las células mediante tripsina después de un lavado; centrifugar las células y resuspender el sedimento celular en DMM completo fresco. Contar las células y luego sembrar cultivos de dos mililitros en placas de seis pocillos a aproximadamente el 70 % de confluencia. Asignar los pocillos de células HEK 293 para la transfección con los constructos de expresión, así como con el vector control. Reservar algunas células HEK 293 sin transfectar para la compensación posterior.Prepare las mezclas de transfección que contienen 200 microlitros de cloruro de sodio al 0,9 %, 2,5 microgramos de ADN y cuatro microgramos por mililitro de polietileno. Vortexee inmediatamente durante 10 segundos e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir la mezcla de transfección a cada pocillo de 2 mililitros de dmm completo fresco. Tape la placa, envuelva los bordes con perfil y centrifugue a 280 ×g durante cinco minutos para facilitar la transfección celular.Luego, retire la película para y coloque la placa en condiciones de cultivo durante 18 horas. Reemplace el medio de cultivo por DM EM completo fresco y mantenga en cultivo durante otras 72 horas. Para desprender las células, agregue 500 microlitros de varice a cada pocillo e incube aproximadamente cinco minutos a 37 grados Celsius.Luego, resuspenda las células de cada pocillo en dos mililitros de PBS con 2 % de FBS y transfiera las células a un tubo cónico tras tres lavados. Resuspenda los pellet celulares a un millón de células por mililitro en solución de 2 % de FBS. Ahora, diseñe la plantilla de 96 pocillos para la adquisición por citometría de flujo de manera que las diferentes líneas celulares sean tratadas con cada muestra de paciente o anticuerpo primario.Luego, siembre 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en V y pelete las células mediante centrifugación a 450 G durante cinco minutos. Incline la placa en un ángulo y retire suavemente el sobrenadante teniendo cuidado de no aspirar el pelet celular. A continuación, agregue una dilución seriada del anticuerpo primario para evaluar la expresión superficial del antígeno.Luego, para detectar anticuerpos en muestras de pacientes, incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad tras tres lavados en 170 microlitros de solución de FBS al 2 %, y añadir el anticuerpo secundario conjugado con AF 6 47 adecuado: anti-IgG humano para el paciente y anti-IgG de EE. UU. para los anticuerpos primarios. Hibridar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad tras tres lavados.Re-suspender las células en 35 microlitros de solución de FBS al 2% para la adquisición de células por citometría de flujo en el citómetro de flujo. Primero, configurar el muestreador de alto rendimiento. Adquirir 10.000 eventos por pocillo según la plantilla de adquisición de citometría de flujo.Exporte y luego analice los datos utilizando un paquete de software de citometría de flujo, delimite las células HEK 293 viables según la dispersión directa e interna. Además, delimite la alta positividad para GFP para analizar únicamente las células transfectadas. Determine la intensidad media de fluorescencia del canal AF 647 dentro de las células viables positivas para GFP.Luego exporte los datos a Excel o Prism para su análisis. Represente gráficamente las concentraciones del anticuerpo primario frente a la MFI obtenida de las muestras correspondientes para cada paciente y cada muestra de control. Determine la MFI delta y calcule el umbral de positividad del anticuerpo sumando tres desviaciones estándar por encima de la media de la MFI delta del grupo de control.Luego, represente en una gráfica las muestras individuales agrupadas según el grupo de pacientes. Represente el umbral como una línea aquí. Se adquirieron células que expresaban el receptor de aspartato N metilado o el receptor de dopamina dos en el citómetro de flujo utilizando un muestreador de alto rendimiento.Durante el análisis, las células fueron seleccionadas según la dispersión directa por tamaño y la dispersión lateral por granularidad. Las células HK 2 9 3 TRANSFECTADAS expresaron la molécula reportera GFP en el citoplasma, mientras que las células no transfectadas UNT fueron excluidas del análisis dentro de la población positiva para GFP. Se midió la intensidad media de fluorescencia (MFI) asociada a la unión del anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con AF 6 47 con el fin de eliminar la fluorescencia de fondo al analizar sueros humanos.El delta MFI se calculó restando el MFI de fondo de las células de control. Este ensayo celular basado en citometría de flujo se fundamenta en la detección mediante anticuerpos del antígeno de superficie celular de interés. Por ejemplo, las células GK 2 93 transfectadas con el plásmido de expresión para el receptor N-M-D-A-R mostraron una alta expresión del receptor superficial de metilo y desmetilación.De manera similar, las células transfectadas con D dos R expresaron el receptor de dopamina dos, mientras que las células control no expresaron ninguno de estos antígenos. Este estudio clínico evaluó una cohorte de pacientes con encefalitis por receptor N-M-D-A-R, una cohorte de pacientes con encefalitis asociada a anticuerpos contra el receptor D dos R y una cohorte control con otras enfermedades neurológicas no inflamatorias. Téngase en cuenta que ninguno de los pacientes positivos fue doblemente positivo para los anticuerpos.Dirigirse al N-M-D-A-R-M-D dos R como se esperaba. Los anticuerpos contra N-M-D-A-R y D dos R no se detectaron en ninguno de los controles analizados. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse adecuadamente en cinco horas, con una hora de adquisición de flujo para aproximadamente 80 muestras tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neuroinmunología descubrieran nuevos objetivos de anticuerpos en trastornos mediados por el sistema inmunitario.

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Este video describe una técnica de inmunoensayo que utiliza perlas magnéticas fluorescentes o microesferas junto con diferentes antígenos para detectar simultáneamente varios isotipos de anticuerpos en una muestra de suero. El ensayo es útil para comprender la seroconversión durante una infección o después de la vacunación.

Ensayo de inmunoperlas multianalitos: una técnica de inmunoensayo basada en flujo para la detección simultánea de múltiples subtipos de anticuerpos en muestras de suero humano

Este video muestra una técnica para identificar anticuerpos contra antígenos específicos en una muestra utilizando un cultivo neuronal de hipocampo de rata. Al exponer neuronas cultivadas a muestras de pacientes que contienen autoanticuerpos dirigidos a los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR), la presencia de autoanticuerpos unidos a la superficie neuronal se revela a través de la inmunotinción.

Un ensayo para detectar autoanticuerpos en suero humano utilizando un cultivo neuronal del hipocampo

Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.

Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal

Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.

Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

Ensayo basado en células es un método ampliamente utilizado para detectar la inmunoglobulina del suero de anti-Acuaporina-4 G. Este método podría aplicarse a diagnóstico clínico y las investigaciones científicas de los trastornos del espectro óptico de Neuromielitis óptica.

Suero humano Anti-Acuaporina-4 inmunoglobulina G detección por análisis Cell-based

Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo - y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

Modelamos un ensayo ECL multiplexado simple que combina 7 ensayos de autoanticuerpos. El ensayo es capaz de detectar DT1 y muchas otras enfermedades autoinmunes, simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y el síndrome poliglandular autoinmune 1.

Un ensayo de electroquimioluminiscencia 7-plex de alto rendimiento que detecta simultáneamente la diabetes tipo 1 y múltiples enfermedades autoinmunes

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Aprende un ensayo de citometría de flujo de alto rendimiento para detectar anticuerpos contra NMDA-R o D2R en suero humano. Este método cuantitativo mejora el diagnóstico de trastornos inmunomediados neurológicos.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano (Video) | JoVE Journal

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

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