Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

El objetivo general del siguiente experimento es detectar anticuerpos neuronales anti D, dos R o N-M-D-A-R en muestras de pacientes utilizando un ensayo celular de citometría de flujo de alto rendimiento. Esto se logra mediante la subadherencia, la secuencia completa de CDNA de D humano dos R o N-M-D-A-R dentro de un plásmido. Como segundo paso, se transfecta una línea celular humana, lo que conduce a la expresión de antígenos neuronales en la superficie celular.

A continuación, las células transfectadas se incuban con suero del paciente y un anticuerpo secundario adecuado antes de la adquisición de la citometría de flujo. Para detectar la unión de anticuerpos a los antígenos de la superficie celular, los resultados se obtienen mediante el análisis de citometría de flujo. Este nuestro ensayo basado en células de citometría de flujo de tres puertos es rápido, cuantitativo y eficiente para grandes cohortes de muestras de pacientes.

Esta es una ventaja significativa sobre el uso de un ensayo basado en células con inmunoquímica y análisis confocal. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán con la pérdida de células en el transcurso del experimento para adquirir el número apropiado de células en el citómetro de flujo. Tenga cuidado de no aspirar células entre lavados.

Seleccione un vector de expresión que sea adecuado para la expresión de proteínas transmembrana y que permita la coexpresión celular de los antígenos y la proteína verde fluorescente por separado. Por ejemplo, este vector tiene un indicador de GFP mejorado bajo el control de un subclonado interno en el sitio de entrada del ribosoma de la CD NA humana de longitud completa en el vector utilizando las enzimas de restricción apropiadas después de verificar los clones por secuenciación, hacen que las existencias de plásmidos sean adecuadas para su uso en el cultivo transfectoso. El HEK 2 93 células en DMEM completo con 10% de suero bovino fetal.

Coseche las células con tripsina, después de un lavado, centrifuga las células y vuelva a suspender la célula en dmm completo fresco. Cuente las células, luego siembre dos cultivos de mililitros en placas de seis pocillos con una fluidez de alrededor del 70%Co, asigne los pocillos de las células HEK 2 93 para la transfección con las construcciones de expresión, así como el vector de control. Mantenga algunos en celdas HEK 2 93 transfectadas para compensarlas más adelante.

Prepare las mezclas de transfección que comprenden 200 microlitros de cloruro de sodio al 0,9%, 2,5 microgramos de ADN y cuatro microgramos por mililitro de polietalina. Inmediatamente Vortex durante 10 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de agregar la mezcla de transfección a cada pocillo de dos mililitros de dmm completos frescos. Cubra la placa, envuelva los lados con perfil y centrifugue a 280 GS durante cinco minutos para ayudar a la transfección celular.

A continuación, retire la película paradiscíproca y, a continuación, coloque la placa en condiciones de cultivo durante 18 horas. Reemplace el medio de cultivo con DM EM completo y fresco y manténgalo en cultivo durante otras 72 horas. Para separar las células, agregue 500 microlitros de várices a cada pocillo e incube durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados centígrados.

Luego resuspender las celdas de cada pocillo en dos mililitros de 2%FBS en PBS y transferir las celdas a un tubo cónico después de tres lavados. Vuelva a suspender las paletas de celdas a 1 millón de celdas por mililitro en una solución de 2%FBS. Ahora diseñe la plantilla de 96 pocillos para la adquisición de citometría de flujo de modo que las diferentes líneas celulares se traten con cada muestra de paciente o anticuerpo primario.

A continuación, siembre 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en V y granule las células centrifugando a 450 Gs durante cinco minutos. Incline una placa en ángulo y retire suavemente el supra natin teniendo cuidado de no aspirar el pellet de celdas. A continuación, agregue una dilución seriada del anticuerpo primario para evaluar la expresión de superficie del antígeno.

Y luego muestras del paciente para detectar anticuerpos, incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad después de tres lavados en 170 microlitros de solución de FBS al 2%, agregar el anticuerpo secundario conjugado AF 6 47 IgG anti-humano apropiado para el paciente y anti-US. IgG para anticuerpos primarios. Hibridar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad después de tres lavados.

Resus suspende las células en 35 microlitros de solución FBS al 2% para la adquisición de células de citometría de flujo en el citómetro de flujo. Primero configure el muestreador de alto rendimiento. Adquiera 10.000 eventos por pocillo de acuerdo con la plantilla de adquisición de citometría de flujo.

Exporte y analice los datos utilizando un paquete de software de citometría de flujo para controlar las células HEK 2 93 en vivo en función de las dispersiones internas directas. Además, se puede utilizar una alta positividad de GFP para analizar solo las células transfectadas. Determine la intensidad de fluorescencia media del canal AF 6 47 dentro de las células vivas positivas para GFP.

A continuación, exporte los datos a Excel o Prism para su análisis. Grafique las concentraciones de anticuerpo primario frente al MFI obtenido de las muestras correspondientes para cada paciente y muestra de control. Determine el delta MFI: calcule el umbral de positividad de anticuerpos sumando tres desviaciones estándar por encima del delta MFI medio de la cohorte de control.

A continuación, trace las muestras individuales agrupadas según el grupo de pacientes en un gráfico. Aquí represente el umbral como una línea. Las células que expresan el receptor n metil de aspartato o el receptor dos de dopamina se adquirieron en el citómetro de flujo utilizando un muestreador de alto rendimiento.

Durante el análisis, las celdas se comprimieron en función de la dispersión directa para el tamaño y la dispersión lateral para la granularidad. Las células HK 2 9 3 transfectadas expresaron la molécula reportera GFP en el citoplasma y las células transfectadas UNT se excluyeron del análisis dentro de la marcha GFP positiva. Se midió el MFI asociado con la unión secundaria de anticuerpos IgG anti-humanos conjugados AF 6 47 con el fin de eliminar la fluorescencia de fondo al analizar sueros humanos.

El MFI delta se calculó restando el MFI de fondo de las células de control. Este ensayo basado en células de citometría de flujo se basa en la detección de anticuerpos del antígeno de la superficie celular de interés. Por ejemplo, las células a GK 2 93 transfectadas con el plásmido de expresión para N-M-D-A-R mostraron una alta expresión del receptor de superficie y metilo de.

De manera similar, las células transfectadas D dos R expresaron el receptor de dopamina dos, mientras que las células controladas no expresaron ninguno de estos antígenos. Este estudio clínico evaluó una cohorte de pacientes con encefalitis N-M-D-A-R, una cohorte de pacientes con encefalitis asociada a anticuerpos D dos R y una cohorte control con otras enfermedades neurológicas no inflamatorias. Nótese que ninguno de los pacientes positivos fue doble positivo para anticuerpos.

Apuntando a N-M-D-A-R-M-D dos R como se esperaba. Los anticuerpos N-M-D-A-R y D, dos R, no se detectaron en ninguno de los controles analizados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar correctamente en cinco horas con una hora de adquisición de flujo para unas 80 muestras después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neuroinmunología descubrieran nuevos objetivos de anticuerpos en trastornos mediados por el sistema inmunitario.