Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

El objetivo general de este procedimiento es generar ensamblajes basados en péptidos en forma de collares biomoleculares. Esto se logra preparando primero soluciones madre disolviendo la difenil alanina y su análogo protegido de Bach por separado en la cantidad adecuada de HFP hasta una concentración final de 100 miligramos por mililitro. El segundo paso es mezclar las soluciones madre peptídicas en una proporción de cinco a tres mezclando 10 microlitros de la solución de péptido de difenil alanina con seis microlitros de la solución de péptido de difenil alanina protegida por Bach.

A continuación, la solución madre de péptidos mezclados se añade a un etanol al 50% recién preparado para obtener una concentración final de cinco miligramos por mililitro de difenil alanina y tres miligramos por mililitro para la difenil alanina protegida de Bach, respectivamente. En última instancia, se utiliza la microscopía electrónica de barrido para mostrar los collares biomoleculares ensamblados conjuntamente por los dos péptidos. La principal ventaja de utilizar procesos de autoensamblaje como el que se muestra aquí, es que por progresión espontánea, es posible generar una estructura compleja.

Aquí in vitro se representa el autoensamblaje de péptidos, concretamente el co ensamblaje de dipéptidos demostrando este procedimiento será nuran, un estudiante graduado de laboratorio anterior. Para comenzar el procedimiento para el autoensamblaje de difenil alanina en estructuras tubulares, prepare 100 miligramos por mililitro de solución madre de péptido disolviendo el péptido de difenil alanina en HFP. Para asegurar la homogeneidad de la solución, mézclala con un mezclador de vórtice durante unos segundos y déjala a un lado en el banco durante unos minutos hasta que el péptido se disuelva por completo y la solución sea clara.

Diluir la solución madre peptídica hasta una concentración final de dos miligramos por mililitro en agua triplemente destilada. Mantenga la solución a temperatura ambiente durante 24 horas. Para el procedimiento de coensamblaje, se disolvieron dos miligramos de péptido de difenil alanina y un miligramo de péptido de difenil alanina protegido de Bach por separado en HFP a una concentración de 100 miligramos por mililitro.

A continuación, mezcle las soluciones con un mezclador de vórtice durante unos segundos y déjelas a un lado en el banco durante unos minutos hasta que los péptidos se disuelvan por completo y las soluciones sean claras. Mezcle las soluciones madre peptídicas en una proporción de cinco a tres mezclando 10 microlitros de la solución de péptido de difenil alanina con seis microlitros de la solución de péptido de difenil alanina protegida de Bach. A continuación, mezcle la solución con un mezclador de vórtice.

A continuación, agregue ocho microlitros de la solución madre de péptidos mezclados a 92 microlitros de etanol al 50% recién preparado para obtener una concentración final de cinco miligramos por mililitro para difenil alanina y tres miligramos por mililitro. Para Bach protegido difenil alanina. Utilice una pipeta para mezclar suavemente la solución.

Después de 24 horas de incubación a temperatura ambiente, aplique una gota de 10 microlitros de la solución peptídica en un cubreobjetos de vidrio y deje que se seque a temperatura ambiente. Cubra la muestra en el engobe de la cubierta de vidrio con una fina capa de oro con un coter de pulverización catódica durante 90 segundos. Cuando termine, imagine los ensamblajes utilizando SEM operando a 10 a 20 kilovoltios.

Para el análisis TEM, coloque una gota de 10 microlitros de solución peptídica en una rejilla de cobre de malla 200 cubierta con carbono y estabilizada por un soporte de película de polímero. Después de un minuto, retire el exceso de líquido con papel de filtro. A continuación, transfiera una solución de acetato de urinario al 2% a una jeringa y fíltrela con una unidad de filtro de 22 micrómetros de punto cero.

Para permanecer en la muestra, coloque una gota de 10 microlitros de solución de acetato urinario en la rejilla. Después de 30 segundos, retire el exceso de líquido con papel de filtro e imagine la muestra en la red por TEM que funciona a 120 kilovoltios. Para el análisis FTIR, aplique una gota de 30 microlitros de la solución peptídica a una ventana de fluoruro de calcio.

Deje que la solución se seque a temperatura ambiente para suprimir la señal de agua en el espectro FTIR. Coloque una gota de óxido de deuterio sobre la muestra de péptido seco. Después de secar la muestra en un desecado al vacío, repita los pasos anteriores dos veces para garantizar el máximo intercambio de hidrógeno a deuterio.

Por último, registre los espectros FTIR utilizando un detector de sulfato de triglicina deuterado. Determine los valores mínimos de transmitancia utilizando el software suministrado con el instrumento para demostrar la formación de estructuras ordenadas por autoensamblaje de péptidos. El coensamblaje de dos péptidos aromáticos simples se preparó y caracterizó mediante análisis SEM y TEM.

Los péptidos mezclados formaban una arquitectura de ensamblajes esféricos con un diámetro de varias micras conectados por estructuras alargadas con un diámetro de unos pocos cientos de nanómetros debido a la gran semejanza en morfología para batir sus cuerdas. Estas estructuras se denominan collares moleculares. Un análisis FM de estas estructuras demuestra claramente su disposición tridimensional.

Además, el análisis SEM de diferentes regiones de varias muestras indica que este proceso ocurrió con alto rendimiento. El análisis FTIR proporciona información sobre la estructura secundaria de los ensamblajes de péptidos. El espectro absorbente de la amida.

Una banda de los ensamblajes esféricos formados por el péptido difenil alanina protegido por Bach en etanol mostró un pico de una sola amida a 1.657 centímetros recíprocos, lo que indica una confirmación de hélice alfa. Las estructuras tubulares formadas por el péptido difenil alanina en etanol mostraron dos picos distintivos a 1.613 centímetros recíprocos y 1.682 centímetros recíprocos, que se correlacionan con una estructura secundaria de lámina beta. El espectro FTIR de los collares biomoleculares formados por el coensamblaje de los dos péptidos diferidos de la asignación de picos para cada péptido individual.

El primer pico a 1.653 centímetros recíprocos corresponde a una estructura de hélice alfa y el segundo pico a 1.684 centímetros recíprocos se relaciona con una confirmación de giro beta. La diferencia entre los distintos espectros indica una estructura única para los collares biomoleculares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un ensamblaje basado en péptidos por péptido de tinte.

Este método se puede aplicar fácilmente a otras biomoléculas para formar una estructura compleja. No olvide que caminar con solventes orgánicos puede ser extremadamente peligroso. Guantes. La bata de laboratorio y las gafas de seguridad siempre deben usarse mientras se realiza este procedimiento.