Name: Modelos De Interacción Gen-Ambiente Para Desenmascarar Los Mecanismos De Susceptibilidad En La Enfermedad De Parkinson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a investigar el papel de las isozimas lipoxigenasa en la degeneración nigroestriatal relacionada con la enfermedad de Parkinson usando ratones deficientes en LOX y el modelo neurotoxina MPTP.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS 056062.

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El diseño de este estudio de la interacción gen-ambiente permitió ganar la nueva información con respecto a la naturaleza dual del isozyme 5-LOX en el camino nigrostriatal. Mediante la realización de HPLC para medir monoaminas estriadas después del tratamiento salino o MPTP en transgénicos que carecen de la isoenzima 5-LOX y sus compañeros de camada de tipo salvaje, pudimos observar que su deficiencia parece ser protectora en condiciones tóxicas(Figura 1),pero en condiciones normales, la falta de la enzi...

El uso de modelos de interacción gen-ambiente proporciona un enfoque para imitar los factores de riesgo que probablemente influyen en la enfermedad de Parkinson (EP) idiopática y ofrece la oportunidad de discernir conocimientos mecanicistas que es poco probable que se dilucidan mediante el uso de un sistema genético o tóxico solo1,2. Aquí ilustramos este punto y describimos la aplicación de la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) modelo de ratón de la degeneración nigroestriatal3 para comprender mejor la selectividad de la actividad de la isoenzima lipooxigenasa (LOX) en la neuroinflamación y toxicidad4. Mientras que un papel de las isoenzimas LOX ha sido ampliamente evaluado en trastornos periféricos5,6, así como la enfermedad del SNC, incluyendo el accidente cerebrovascular7 y la enfermedad de Alzheimer8,9,el papel de la familia de isoenzimas en la función nigroestriatal y la degeneración relacionada con la EP no se entiende bien y justifica el estudio. La neurotoxina MPTP demuestra la degeneración preferencial del camino nigrostriatal y recapitula el agotamiento estriado de la dopamina y la pérdida dopaminérgica nigral de la célula que es la base de debilitaciones motoras en pacientes delpaladio 10. Si bien este modelo no reproduce el cuadro completo de comportamientos de EP no motora y motora y la patología corporal de Lewy franca α-sinucleína positiva, ha sido útil para dilucidar nuevas dianas mecanicistas que contribuyen al daño nigroestriatal y para las pruebas de traslación en etapa temprana, ya que es el modelo no invasivo mejor caracterizado disponible para producir de manera confiable la muerte celular nigral acompañada de pérdida de dopamina estriatal11-15. El amplio uso del ratón MPTP, con paradigmas que van desde agudo, subagudo hasta crónico16-18,ha permitido estandarizar la dosificación para dar lugar a daños nigroestriatales leves a severos19,20 con activación de diferentes mecanismos de toxicidad dependiendo del régimen de tratamiento18,21,22. En consecuencia, esto permite que se dirija una "ventana de lesión" que puede resultar en una lesión nigroestriatal mejorada o reducida dependiendo del agente terapéutico o modelo transgénico utilizado23-25.
También son esenciales para los estudios de biología traslacional y de descubrimiento las técnicas utilizadas para evaluar el daño y la evidencia que proporcionan estos métodos. Para el modelo de ratón MPTP, las métricas establecidas para evaluar las lesiones son la medición de marcadores de tono dopaminérgico estriado, incluyendo la dopamina y sus metabolitos por HPLC, y el análisis de Western blot de tirosina hidroxilasa (TH), la enzima limitadora de la tasa en la síntesis de dopamina, e indicadores de eventos degenerativos como la activación glial mediante el análisis de Western blot e inmunohistoquímica4. Aunque éstos sean procedimientos neuroquímicos, bioquímicos, e histológicos clásicos, las técnicas proporcionan lecturas críticas y reproducibles en el grado del daño dentro del camino dopaminérgico nigrostriatal, indican mecanismos de la toxicidad, y han demostrado ser herramientas valiosas en la comprensión de eventos degenerativos en el paladio.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP-HCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0896</td><td>para el modelado</td></tr><tr><td>de DP Solución de formaldehído (paraformaldehído) al 4%, tamponada con fosfato (PFA)</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>BUP0157</td><td>para fijación por inmersión</td></tr><tr><td>Reactivo ACS de ácido perclórico, 70% (PCA)</td><td>244252 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>para la extracción</td></tr> <tr><td>de ácido por HPLCTris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratada (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5726</td><td>para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>para el ensayo de proteínas de Lowry</td></tr><tr><td>Sacarosa, biología molecular, &ge; 99.5% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>para crioprotección</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, polvo, pH 7,4 (para 0,01 M PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce/Thermo</td><td>23225</td><td>para la determinación de proteínas</td></tr><tr><td>Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 pocillos</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EC60052BOX</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Tampón (4x)</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Novex Sharp Prestained Protein Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5800</td> escalera <td>de proteínas</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio, electroforesis, 98,5% (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Alcohol metílico, anhidro, reactivo&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td></td><td>SPM1057C metanol para transferencia</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl), reactivo ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>solución salina y tampones Leche</td></tr><tr><td>en polvo descremada Clavel</td><td></td><td>n/a</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Solución de Ponceau S en ácido acético al 5%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Anti-tirosina hidroxilasa (TH), policlonal de ovejas</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB1542</td><td>para inmunofluorescencia&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-tirosina hidroxilasa (TH), policlonal de conejo</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101-0</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Anti-&beta; Actina, conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2066</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP), policlonal de conejo</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB5804</td><td>para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP), monoclonal de ratón</td><td>Covance Inc.</td><td>SMI-22R</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-conejo de cabra (H+L), peroxidasa conjugada&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>31462</td><td>para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>anti-ovejas en cabras, conjugada con peroxidasa</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31480</td><td>para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>anti-ratón en cabras, conjugada con peroxidasa</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31430</td><td>para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico sustrato quimioluminiscente</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34078</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>CL-XPosure Película 7 pulgadas x 9.5 pulgadas&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34089</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>21059</td><td>para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado, reactivo ACS, &ge; 99.0%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Millipore</td><td>S30-100ML</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), liofilizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-01</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Burro anti-Conejo IgG, Alexa Fluor 568 etiquetado&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A10042</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Burro Anti-Ovejas IgG (H + L), FITC&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-095-147</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje rígido con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Millipore</td><td>S26-100ML</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit (IgG de conejo) &nbsp;</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>PK-4001</td><td>para IHC; 10 y micro; l cada una de las soluciones A y B por 1 ml de PBS (según las instrucciones) Kit de</td></tr> <tr><td>sustrato de peroxidasa DAB, 3,3'-diaminobenzidina</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>para IHC; por 5 ml de ddH2 fríoO, agregue 2 gotas de solución tampón, 2 gotas de DAB y 1 gota de H2O2 (H2 O2 se añade inmediatamente antes de usar)</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>para la etapa de enfriamiento en IHC</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Biocare Medicals</td><td>CP290A</td><td>para</td></tr><tr><td>IHC Cresyl Violet Solution, Regular Strength&nbsp;</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PS102-01</td><td>contratinción para Iba1 IHC</td></tr><tr><td>95% Etanol, reactivo alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td>deshidratación para IHC</td></tr><tr><td>100% Etanol absoluto</td><td>Mallinckrodt</td><td>7019-10</td><td>deshidratación para IHC</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>decolorante para IHC</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>agente de limpieza para IHC</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>medio de montaje para DAB IHC</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>EMOCTCS</td><td>Medio de embeddio para el corte por criostato</td></tr><tr><td>Permanganato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>para descontaminar la solución DAB</td></tr><tr><td>Clorhidrato de dopamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>850217</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido homovanílico (HVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1252</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido perclórico (PCA) - 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71504</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Sal sódica del ácido 1-octanosulfónico (OSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8380</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Agua destilada desionizada de grado HPLC (ddH2O)</td><td>Millipore</td><td></td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>0.22 y micro; m Membrana GSTF</td><td>Millipore</td><td></td><td>para filtración</td></tr><tr><td>Corning Netwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3477</td><td>inserto de poliestireno con fondo de malla de poliéster, para IHC</td></tr><tr><td>Disruptor celular ultrasónico (Soniprep 150)</td><td>MSE</td><td>MSE.41371.274</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5414R</td><td></td></tr><tr><td>ESA MD-150 columna de fase inversa&nbsp;</td>Bomba de HPLC <td>ESA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>ISO-3100BM</td><td></td></tr><tr><td>Muestreador automático de HPLC (Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>WPS-3000TSL</td><td></td></tr><tr><td>Detector electroquímico</td><td>ESA</td><td>Coulochem III</td><td></td></tr><tr><td>Célula de protección</td><td>ESA</td><td>5020</td><td></td></tr><tr><td>Célula analítica</td><td>ESA</td><td>5011A</td><td></td></tr><tr><td>Software Chromeleon</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E400</td><td>Nikon</td><td>E400</td><td>Microscopio óptico/fluorescente</td></tr><tr><td>Jaula de ratón desechable</td><td>Ancare</td><td>N10HT</td><td></td></tr><tr><td>Microfiltro</td><td>superior Ancare</td><td>N10MBT</td><td></td></tr><tr><td>Ratones deficientes en 5-LOX</td><td>The Jackson Laboratory 004155</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ratones con deficiencia de 12/15-LOX</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002778</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de interacción gen-ambiente para desenmascarar los mecanismos de susceptibilidad en la enfermedad de parkinson

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

La actividad de la lipooxigenasa (LOX) se ha implicado en desordenes neurodegenerative tales como enfermedad de Alzheimer, pero sus efectos en patogenesia de la enfermedad de Parkinson (paladio) se entienden menos. Los modelos de interacción gen-ambiente tienen utilidad para desenmascarar el impacto de vías celulares específicas en la toxicidad que no se pueden observar utilizando solo un modelo de enfermedad genética o tóxica. Para evaluar si las isoenzimas distintas de LOX contribuyen selectivamente a la neurodegeneración relacionada con la EP, los ratones transgénicos(es decir, 5-LOX y 12/15-LOX deficientes) pueden ser desafiados con una toxina que imite la lesión celular y la muerte en el trastorno. Aquí describimos el uso de una neurotoxina, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), que produce una lesión nigrostriatal para aclarar las contribuciones distintas de las isoenzimas de LOX al neurodegeneration relacionado con el paladio. El uso de MPTP en ratón, y primate no humano, está bien establecido para recapitular el daño nigroestriatal en la EP. El grado de lesión MPTP-inducido es medido por el análisis de la CLAR de la dopamina y de sus metabilitos y el análisis semicuantitativo de la mancha blanca /negra occidental del striatum para la hidroxilasa de la tirosina (TH), la enzima tarifa-limitadora para la síntesis de la dopamina. Para evaluar los marcadores inflamatorios, que pueden demostrar sensibilidad isoenzima-selectiva de LOX, la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) y el immunohistochemistry Iba-1 se realizan en las secciones del cerebro que contienen nigra del substantia, y el análisis occidental de la mancha blanca /negra de GFAP se realiza en homogenados estriados. Este enfoque experimental puede proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones gen-ambiente subyacentes a la degeneración nigroestriatal y la EP.

Este paradigma de la exposición de la toxina puede producir un agotamiento estriado significativo y perceptible de la dopamina del 20% en mptp- contra animales salino-inyectados. Es importante tener en cuenta que diferentes lotes de MPTP pueden producir un poco más o menos lesiones; por lo tanto, para una mejor precisión, se recomienda un experimento preliminar en ratones de tipo salvaje antes de su uso en transgénicos cuando se utiliza un nuevo lote de neurotoxinas. El uso de lesiones leves a moderadas permite observar ...

Las isoenzimas de la lipooxigenasa (LOX) pueden generar los productos que pueden aumentar o disminuir la neuroinflamación y el neurodegeneration. Un estudio de la interacción gen-ambiente podría identificar efectos isoenzima-específicos de LOX. Usando el modelo 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) del daño nigrostriatal en dos líneas transgénicas isozyme-deficientes de LOX permite la comparación de la contribución de isozymes de LOX en integridad y la inflamación dopaminérgicas.

Modelos De Interacción Gen-Ambiente Para Desenmascarar Los Mecanismos De Susceptibilidad En La Enfermedad De Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

El objetivo general del siguiente experimento es comprender el papel de las enzimas isoformas de lipoxygenasa en la degeneración nigroestriatal relacionada con la enfermedad de Parkinson. Para lograrlo, se prepara cuidadosamente una neurotoxina que produce una lesión Nigro SAL. A continuación, se inyecta diariamente a ratones deficientes en locks la solución de MPTP durante cuatro días consecutivos, siete días después de la última inyección.Las muestras se recogen y utilizan para análisis bioquímicos o inmuno-histoquímicos. Los resultados muestran que 1215 cerraduras no afecta la toxicidad por MPTP en la vía nigroestriatal. Sin embargo, cinco cerraduras contribuyen al daño bajo condiciones de toxicidad.El método TS puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad de Parkinson. Sugiere cuál es el impacto de las interacciones entre genes y el ambiente en la vulnerabilidad nistri. Mediante el uso de modelos de genes y ambiente, pudimos discernir funciones selectivas ISO y obtener información sobre el interior del doble de cinco lipes.El personal debidamente capacitado debe usar equipo de protección personal adecuado durante todo el siguiente procedimiento. Comienc

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