Médula ósea derivada de macrófagos Producción
22 de noviembre de 2013
Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.
El objetivo general de este procedimiento es generar macrófagos a partir de orina y cultivos celulares derivados de la médula ósea. Esto se logra primero extrayendo la médula ósea de las patas traseras de los ratones. En el segundo paso, se extraen los macrófagos residentes en la médula ósea y, a continuación, las células de la médula ósea se cultivan aún más en condiciones de diferenciación de macrófagos.
Luego, cuando las células de la médula ósea se han diferenciado en macrófagos, se pueden recolectar para su análisis experimental. En última instancia, la microscopía confocal se puede utilizar para demostrar la localización de LPS bacterianos dentro de macrófagos derivados de la médula ósea, y compartimentos ácidos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el cultivo de macrófagos, líneas celulares, es que se puede obtener un gran número, por lo que se pueden obtener macrófagos primarios.
La demostración visual del método es fundamental, ya que los pasos de autoproducción son difíciles de aprender y requieren práctica, y para lograr el éxito, desinfecte la piel de un ratón sacrificado con etanol al 70%. Haz una incisión en la parte superior de cada pata trasera y tira de la piel hacia el pie para exponer el músculo. A continuación, corte las patas traseras y utilice tijeras y pinzas estériles.
Para quitar la piel, coloque las patas en una placa de Petri estéril de 35 milímetros que contenga cinco mililitros de hielo estéril. PBS frío. Retire la piel y el músculo adherido a los huesos y luego transfiera los huesos a una nueva placa de Petri estéril que contenga cinco mililitros de hielo.
PBS frío y estéril. Lave los huesos dos veces con cinco mililitros más de PBS y luego transfiéralos a un mortero estéril que contenga cinco mililitros de hielo. PBS frío y estéril.
Ahora corta la tibia del fémur en la articulación y usa un mortero para aplastar suavemente los huesos. Recoja el sobrenadante en tubos helados de 15 mililitros tres veces. A continuación, filtre la suspensión de tejido a través de un colador de células de nailon de 70 micras.
Para eliminar los fragmentos sólidos, gire el filtrado y deseche suavemente el sobrenadante. Disociamos el pellet con tampón de lisis de glóbulos rojos, agregando 20 mililitros de DMEM completo helado después de 30 segundos para detener la reacción después de centrifugar las células, suspendemos el pellet en 20 mililitros de 37 grados centígrados, completamos DMEM y luego dividimos la suspensión celular entre dos placas de Petri de 100 milímetros. Incubar los platos durante cuatro horas a 37 grados centígrados y luego recoger los sobrenadantes en tubos de 50 mililitros a temperatura ambiente.
Después de centrifugar los sobrenadantes, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM completo suplementado con el sobrenadante de células L 9 29 previamente preparado, y luego filtre las células a través de un colador de células de nailon de 40 micras. Agregue el filtrado a 140 mililitros de DMEM completo y L 9 29 medios celulares y, a continuación, distribuya 10 mililitros de la suspensión celular por placa en 15 placas de Petri de 100 milímetros. Después de incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono a 10 mililitros de DMEM completo más L 9 29 sobrenadante e incubar las células durante cuatro días adicionales.
Monitoreando el crecimiento celular periódicamente con un microscopio invertido para recolectar los macrófagos derivados de la médula ósea, primero aspirar y descartar el sobrenadante. A continuación, lave las placas de Petri dos veces con DMEM completo. A continuación, agregue cinco mililitros de DMEM completo de 37 grados Celsius y use un policía de goma para separar suavemente las células, recolectar los macrófagos derivados de la médula ósea en tubos de 50 mililitros y luego girar las células.
Resus suspendiendo los pellets en 20 mililitros de DMEM completo. Por último, cuente las celdas por exclusión de azul triam. Con este método, se puede obtener un gran número de macrófagos en solo unos días después de aislar y colocar las células redondas de la médula ósea no adherentes menos los macrófagos residentes en la médula ósea, como se acaba de demostrar.
Estas células precursoras representativas de BMDM se incubaron con G-M-C-S-F. Después de tres días, las células comenzaron a adherirse y diferenciarse en macrófagos. Después de siete días, se observó una monocapa confluente de macrófagos derivados de la médula ósea.
El análisis de citometría de flujo para F, cuatro, 80 y H-L-A-D-R reveló que los macrófagos derivados de la médula ósea expresaban ambos marcadores, lo que confirma la diferenciación de las células de la médula ósea en macrófagos. Evaluar las capacidades ácidas de PHA de los macrófagos derivados de la médula ósea. La capacidad de las células para internalizar las velocidades del látex se monitoreó como se esperaba.
Se determinó que el número de perlas por célula aumentaba con el tiempo para evaluar su potencial endocítico. Los macrófagos derivados de la médula ósea también se cocultivaron con Coxiella. Se observó que el LPS del ojo de Burnett en rojo estaba localizado en un compartimento que albergaba la proteína de membrana asociada al lisosomal uno en azul, pero no la catepsina D en verde, lo que demuestra que el LPS estaba presente en los endosomas tardíos, que no pueden fusionarse con los lisosomas como se esperaba que fueran los macrófagos derivados de la médula ósea.
Las interacciones entre patógenos bacterianos se analizaron más a fondo a través de su infección por el ojo de Wiley TMA. Como era de esperar, las bacterias en rojo no se localizaron en el compartimento que alberga KPS y D, que aparece de nuevo en verde. En este inmunotransferencia representativa, se evaluaron las vías de transducción de señales de macrófagos derivados de la médula ósea, lo que demostró que los macrófagos derivados de la médula ósea, al igual que el tejido, regulan al alza los niveles de quinasa P 38 alfa mapeada fosforilada en respuesta a la estimulación de Esia coli LPS.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología celular, como qué compartimento intracelular se microlocaliza.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un método para diferenciar macrófagos a partir de médula ósea de ratón. El procedimiento implica extraer la médula ósea y cultivarla bajo condiciones específicas para generar macrófagos primarios destinados al análisis experimental.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Microbiología
Antecedentes
- Los macrófagos desempeñan un papel crucial en el sistema inmunológico.
- Los avances recientes han mejorado la comprensión de las interacciones entre macrófagos y microbios.
- Los métodos para generar macrófagos primarios son esenciales para la investigación.
- Este estudio se centra en un enfoque novedoso para obtener macrófagos a partir de médula ósea de ratón.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para diferenciar macrófagos a partir de médula ósea de ratón.
- Facilitar el estudio de las funciones e interacciones de los macrófagos.
- Proporcionar una técnica que produzca un gran número de macrófagos primarios.
Métodos Utilizados
- Extracción de médula ósea de las patas traseras de ratón.
- Eliminación de macrófagos residentes de la médula ósea.
- Cultivo de células de la médula ósea en condiciones que inducen la diferenciación a macrófagos.
- Uso de microscopía confocal para analizar la localización de LPS bacteriano en macrófagos.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa de células de la médula ósea en macrófagos.
- Demostración de la localización del LPS bacteriano en macrófagos.
- Obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios en comparación con los métodos tradicionales.
- Mejor comprensión del comportamiento de los macrófagos en respuesta a estímulos microbianos.
Conclusiones
- El método proporciona una manera eficaz de generar macrófagos primarios.
- Este enfoque puede aplicarse a diversos análisis experimentales.
- Estudios futuros pueden aprovechar estos macrófagos para explorar las respuestas inmunitarias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de macrófagos primarios a partir de médula ósea permite modelar de manera fisiológicamente relevante las interacciones entre el huésped y el patógeno, así como las respuestas inmunitarias. Este método apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento, al proporcionar acceso escalable a células inmunitarias relevantes para la enfermedad. El enfoque mejora la confianza predictiva en los modelos preclínicos al reducir la dependencia de líneas celulares inmortalizadas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de vías mediadas por macrófagos en modelos de enfermedades infecciosas y de inflamación.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de macrófagos primarios para estudios consistentes de interacción con dianas.
- Valor científico: Facilita la validación funcional de dianas inmunomoduladoras mediante ensayos de fagocitosis y citoquinas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poblaciones estandarizadas de macrófagos para ensayos de cribado de compuestos reproducibles en inmunología.
- Valor operativo: Permite la preparación de alto rendimiento de células diferenciadas para lograr reproducibilidad de ensayos entre diferentes sitios.
- Valor científico: Facilita lecturas cuantitativas, como la localización de LPS y la captación de microesferas, para cribado mecanicista.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela el comportamiento de los macrófagos humanos en estudios preclínicos de persistencia bacteriana y supervivencia intracelular.
- Valor operativo: Permite modelos de infección longitudinales utilizando patógenos como Coxiella para evaluar candidatos terapéuticos.
- Valor científico: Permite lecturas alineadas con biomarcadores, tales como la activación de p38 MAPK fosforilada en respuesta al LPS.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, proporcionando una fuente escalable de células inmunitarias primarias para cribados mecanicistas y fenotípicos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis en interacciones huésped-patógeno mediante experimentos controlados de co-cultivo de macrófagos y patógenos.
- Selección: Proporciona macrófagos listos para ensayos con resultados cuantificables como la cinética de internalización y la activación de señales.
- Análisis: Permite el uso de microscopía confocal y citometría de flujo para análisis de alto contenido del fenotipo y la función de los macrófagos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica mediante modelos de células inmunitarias relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado y escalable para generar macrófagos primarios en diversos proyectos de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la validez predictiva de los modelos de inmunología y enfermedades infecciosas mediante el uso de células primarias.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad y mejora la reproducibilidad en ensayos basados en macrófagos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir los riesgos de los mecanismos diana en sistemas fisiológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos inmunomoduladores y antiinfecciosos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de recolección de tejidos aséptica y cultivo primario de células.
- Depende del acceso al sobrenadante de células L929 o al M-CSF para la diferenciación de macrófagos.
- Necesita protocolos estandarizados para la extracción de médula ósea y la cuantificación de macrófagos entre diferentes equipos.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a fuentes de médula ósea humana u de otras especies.
- Limitado por la necesidad de condiciones estériles y pasos de diferenciación cronometrados para asegurar la pureza y el rendimiento de macrófagos.
