Análisis Videomorfométrico De La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica De Las Arterias Intrapulmonares Usando Cortes Murinos De Precisión Pulmonar Slices

El objetivo general de este procedimiento es analizar la vasoconstricción pulmonar hipóxica de arterias intrapulmonares en espejo con diámetros internos de 20 a 100 micras. Esto se logra llenando primero las vías respiratorias de los pulmones con aros de bajo punto de fusión. El segundo paso es utilizar un vibrador para cortar los pulmones aislados en rodajas de 200 micras de grosor.

A continuación, el aros se retira de las secciones pulmonares mediante incubación en 37 grados centígrados, medio cálido, que se burbujea con gas normóxico. Por lo tanto, las secciones se mueven lentamente en el fluido. A continuación, se transfiere una sección pulmonar individual a un flujo a través de una cámara de superfusión, seguida de un análisis morfométrico de vídeo de la reactividad vasométrica de la arteria seccionada.

En última instancia, se evalúan los cambios en el área luminal del vaso en respuesta a diferentes tratamientos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la microscopía intravital de microvasos subpleurales, es la medición de la tensión vascular en arterias pulmonares proximales aisladas es que permite el análisis cuantitativo de la reactividad de la AV de arterias intrapulmonares con diámetros entre 20 y 100 micrómetros. La demostración del procedimiento estará a cargo de Anna Goldenberg y dos técnicos de este laboratorio.

Inmediatamente después de matar a un ratón por dislocación cervical, abra la cavidad abdominal, separe las asas intestinales y corte los grandes vasos abdominales para sangrar. A continuación, utilice unas tijeras finas para penetrar en el diafragma. Esto hace que los pulmones colapsen como resultado de la entrada de aire en la cavidad pleural.

Continúe cortando para separar el diafragma de la abertura torácica inferior. Ahora corta las costillas y la clavícula lateralmente. Para extraer la parte ventral de la caja torácica, saque el timo.

Llene una jeringa con tampón de perfusión tibio. A continuación, haga un pequeño orificio en el ventrículo izquierdo del corazón. Ajustar el flujo de salida del tampón de perfusión y perfundir la vasculatura pulmonar lentamente a través del ventrículo derecho hasta que los pulmones aparezcan blancos.

A continuación, extraiga las glándulas salivales, los músculos pequeños y el tejido conectivo de la tráquea. Desconecte la tráquea del tejido conectivo circundante e inserte un trozo de algodón de coser entre el esófago y la tráquea para una ligadura posterior. A continuación, utilice una microtijera para cortar un pequeño agujero en la parte superior de la tráquea entre dos cartílagos traqueales vecinos.

Después de llenar una jeringa a 37 grados centígrados, tibia y de bajo punto de fusión, conéctela a una cánula de plástico flexible y empuje el émbolo lentamente hasta que se elimine el aire de la cánula. Inserte la cánula en el pequeño orificio de la tráquea y fíjela con cuidado en su lugar con algodón de coser. A continuación, llene lentamente las vías respiratorias con el aros y observe los pulmones.

Al principio, el pulmón derecho comienza a expandirse, seguido por el pulmón izquierdo. Después de 30 a 40 segundos, se completa el llenado y ambos pulmones se inflan a un volumen comparable a la situación in vivo, que es de aproximadamente 1,2 a 2,0 mililitros. Dependiendo del sexo, la edad y el peso, es importante inyectar el óvulo lo suficientemente rápido para que no se solidifique tanto durante el procedimiento, pero no tan rápido como para dañar los pulmones.

Después de que los pulmones se llenen simultáneamente, saque la cánula de plástico y lige la tráquea con el algodón de coser para evitar fugas de los aros. Posteriormente, corte la tráquea por encima de la ligadura y para separar los pulmones y el corazón en bloque del tórax, transfiera los órganos a montones helados de tampón de timbre para solidificar el agros, lo que sucede en unos minutos mientras se espera. Use superpegamento para unir un trozo de corcho de champán al portamuestras del vibrador para que actúe como un respaldo inclinado para el tejido pulmonar Después de que el agros se haya solidificado, separe los lóbulos pulmonares individuales.

A continuación, superpegamento, un lóbulo al portamuestras. Para obtener secciones transversales de las pequeñas arterias intraasneras, tome el lóbulo craneal del pulmón derecho y péguelo con la superficie del hilio al soporte, usando un vibrato equipado con una hoja de afeitar nueva cortada desde la periferia, cortando el lóbulo pulmonar en rodajas de 200 micras de grosor. Para obtener secciones transversales de las arterias pre ápicas más grandes, alinee el hilio del pulmón izquierdo con el corcho de champán y pegue el lóbulo en esta orientación al soporte, luego córtelo desde la periferia para eliminar las arterias.

Transfiera las secciones de órgano a un vaso de precipitados de vidrio lleno de unos 200 mililitros a 37 grados centígrados. MEM colocó el vaso de precipitados en un gabinete de calefacción y burbujeó con gas normóxico para que las secciones pulmonares se muevan lentamente en el medio. Después de unas dos horas, las placas de aros que llenan el aire se habrán eliminado del tejido pulmonar y las secciones se habrán asentado en el fondo del vaso de precipitados.

Para el análisis morfométrico de video de las arterias intrapulmonares, transfiera una sección pulmonar al flujo a través de la cámara de superfusión, que se monta en un microscopio y se llena con 1,2 mililitros de gas normóxico. MEM. Fije la sección del pulmón en la parte inferior de la cámara con cuerdas de nailon conectadas a un anillo de platino. Comience a perfundir la cámara con medio gaseado normóxico.

Utilice un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 10 x para explorar la sección pulmonar en busca de arterias seccionadas transversalmente con diámetros internos entre 20 y 100 micras. Una vez que se localiza un vaso candidato razonable, utilice el objetivo de 20 x para tomar una fotografía de un vaso pre asner o, como se muestra aquí, el objetivo de 40 x para tomar una imagen de una arteria intra asner para medir el diámetro interior del vaso. Antes de comenzar el experimento, configure el software para tomar imágenes de la arteria seccionada transversalmente cada minuto durante todo el experimento.

Después de disparar la fotografía, continúe la perfusión de la cámara con medio gast normóxico durante 10 minutos. A continuación, bañar la sección pulmonar en U 466 19 durante 10 minutos sin flujo para analizar la contractilidad de la arteria utilizando solo vasos cuyas áreas luminales se redujeron en al menos un 30% con el U 466 19. Lave el medicamento con medio gasóxico normóxico durante 10 minutos.

A continuación, dilatar la arteria mediante la aplicación de res durante 10 minutos sin que el flujo sea bajo. Nuevamente, retire el medicamento con un lavado de 10 minutos con medio gaseado normóxico a un flujo de seis mililitros por minuto, seguido de 10 minutos a un flujo de 0,7 mililitros por minuto. A continuación, incube el corte de pulmón con medio gaseado hipóxico alto durante 40 minutos.

También haga fluir la mezcla de gases hipóxicos en el espacio de aire de la cámara de perfusión a través de un juego adicional de tubos. Retire el medio hipóxico con un lavado de 20 minutos con medio gaseado normóxico y cambie el flujo de gas hipóxico a normóxico en el espacio aéreo de la cámara para verificar la viabilidad del recipiente. Al final del experimento, aplique U 466 19 en la cámara de perfusión e incube durante 20 minutos sin flujo para inducir vasoconstricción.

Repita estos pasos con una sección pulmonar fresca para medir la reactividad vaso de otro vaso. Comience el análisis cargando las imágenes de las arterias seccionadas transversalmente en un programa de análisis de imágenes. A continuación, utilice un cursor para delinear el área luminal del recipiente.

El secado de manos es necesario ya que evita artefactos debidos, por ejemplo, a las células sanguíneas adheridas a la pared vascular. Continúe analizando las imágenes transversales de manera similar. Cada imagen debe analizarse cuando una condición en el flujo a través de la cámara de incubación se cambia a otra, pero analizar todas las demás imágenes es suficiente cuando las condiciones no cambian.

La vasoconstricción pulmonar hipóxica es observable en estas imágenes de contraste de fase de una arteria pre ASIN seccionada transversalmente, que corre muy cerca de un bronquio seccionado transversalmente. Las imágenes se toman en puntos de tiempo indicados por círculos en el gráfico al comienzo de la medición, al final de la medición con U 466 19 al final de la exposición a los AR después de 30 o 40 minutos en medio gaseado hipóxico después del lavado con medio gaseado normóxico, y después de la aplicación final de U 466 19, la reactividad del vaso se registra como cambios relativos del área luminal de la sección transversal arteria contra el tiempo. El área al comienzo del experimento se define como 100% y la vasoconstricción se da como valores relativos al área inicial.

En este caso, la exposición a la hipoxia induce una reducción del 60% del área luminal para una presentación más clara de la respuesta hipóxica. Aquí no se muestra la fase inicial del experimento en la que se probó la reactividad vasal, y el valor obtenido inmediatamente antes de la exposición a oxígeno reducido se establece en 100%El otro tipo de vasos examinados en estos estudios son las arterias intra ASIN, que se encuentran en los fuelles de los tabiques alveolares. En este conjunto de experimentos, se analiza el impacto de sidal, un abridor no selectivo de los canales de potasio sensibles a TP mitocondrial A sobre la vasoconstricción pulmonar hipóxica de pequeñas arterias intraasner.

Las rodajas se incuban en medio hipóxico. En ausencia o presencia de 50 micromolares sidales, se realizan incubaciones de control en medio gastóxico normóxico para una presentación más clara de la respuesta a normoxia o hipoxia o hipoxia más sidal. Los valores obtenidos inmediatamente antes de la exposición al medio gástrico normóxico o hipóxico se establecen como 100%La arteria expuesta a la glándula pineal no presenta una disminución del área, al igual que la arteria incubada en medio hipóxico sin aditivos.

En medio normóxico, no se detectan cambios en el área luminal. Los registros de pequeñas arterias intra ASIN expuestas a medio gástrico hipóxico con o sin 50 micromolares sidales se presentan como medias más o menos SEM. En este gráfico se muestran los datos relativos en relación con el valor al inicio de la incubación hipóxica.

No se detecta ninguna reactividad vaso. En los cortes pulmonares expuestos a gástagos hipóxicos, el medio que contiene vasoconstricción pineal inducida por U 466 19 no se ve afectado por el fármaco. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar la precisión del espejo, cortar cortes de pulmón y cómo usarlos para la medición cuantitativa de la reactividad de VA de pequeñas arterias intra asina con diámetros entre 20 y 40 micrómetros, que se encuentran en Gases de los tabiques alveolares, y de arterias pre Atenea más grandes con diámetros entre 40 y 100 micrómetros, que corren adyacentes a Bronchi y Bronchioli.