Análisis Videomorfométrico De La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica De Las Arterias Intrapulmonares Usando Cortes Murinos De Precisión Pulmonar Slices

El objetivo general de este procedimiento es analizar la vasoconstricción pulmonar hipóxica de arterias pulmonares intraacinares con diámetros internos de 20 a 100 micrones. Esto se logra primero llenando las vías aéreas de los pulmones con parafina de bajo punto de fusión. El segundo paso consiste en utilizar un vibrátomo para cortar los pulmones aislados en rebanadas de 200 micrones de grosor.

A continuación, el aros se elimina de las secciones de pulmón mediante incubación en medio tibio a 37 grados Celsius, que se burbujea con gas normóxico. De este modo, las secciones se mueven lentamente en el líquido. Luego, una sección individual de pulmón se transfiere a una cámara de superfusión de flujo continuo, seguida de un análisis morfométrico en video de la vasorreactividad de la arteria en corte transversal.

Finalmente, se evalúan los cambios en el área luminal del vaso en respuesta a diferentes tratamientos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la microscopía intravital de microvasos subpleurales, es que la medición de la tensión vascular en arterias pulmonares proximales aisladas permite el análisis cuantitativo de la reactividad de las arterias pulmonares con diámetros entre 20 y 100 micrómetros. El procedimiento será demostrado por Anna Goldenberg y dos técnicos de este laboratorio.

Inmediatamente después de sacrificar un ratón mediante dislocación cervical, abra la cavidad abdominal, desplace los bucles intestinales hacia un lado y corte los grandes vasos abdominales para sangrarlo. A continuación, use tijeras finas para penetrar el diafragma. Esto provoca el colapso de los pulmones debido a la entrada de aire en la cavidad pleural.

Continúe cortando para separar el diafragma de la abertura torácica inferior. Ahora corte las costillas y la clavícula lateralmente. Para retirar la parte ventral de la caja torácica, extraiga el timo.

Llene una jeringa con tampón de perfusión tibio. A continuación, corte un pequeño orificio en el ventrículo izquierdo del corazón. Ajuste el flujo de salida del tampón de perfusión y perfunda lentamente la vasculatura pulmonar a través del ventrículo derecho hasta que los pulmones aparezcan blancos.

A continuación, retire las glándulas salivales, los músculos pequeños y el tejido conectivo de la tráquea. Desconecte la tráquea del tejido conectivo circundante e inserte un trozo de hilo de coser entre el esófago y la tráquea para la ligadura posterior. Luego, use una tijera microquirúrgica para hacer un pequeño orificio en la parte superior de la tráquea entre dos cartílagos traqueales adyacentes.

Después de llenar una jeringa con agros de bajo punto de fusión a 37 grados Celsius, cálido, conéctela a una cánula plástica flexible y empuje lentamente el émbolo hasta que se elimine el aire de la cánula. Introduzca la cánula en el pequeño orificio de la tráquea y fíjela cuidadosamente en su lugar con hilo de coser. A continuación, llene lentamente las vías respiratorias con el aros y observe los pulmones.

Primero, el pulmón derecho comienza a expandirse, seguido por el pulmón izquierdo. Después de 30 a 40 segundos, se completa el llenado y ambos pulmones se inflan hasta un volumen comparable a la situación in vivo, que es aproximadamente de 1,2 a 2,0 mililitros. Dependiendo del sexo, la edad y el peso, es importante inyectar la rosa de huevo lo suficientemente rápido para que no se solidifique durante el procedimiento, pero no tan rápido como para dañar los pulmones.

Una vez que los pulmones estén completamente llenos, retire la cánula de plástico y ligue la tráquea con hilo de coser para evitar la fuga del aros. A continuación, corte la tráquea por encima de la ligadura y separe los pulmones y el corazón en bloque del tórax; transfiera los órganos a tampón Ringer frío con hielo para solidificar el agros, lo cual ocurre en pocos minutos mientras espera. Utilice pegamento instantáneo para fijar un trozo de corcho de champán al soporte de la muestra del vibrátomo, a modo de respaldo para el tejido pulmonar. Una vez que el agros haya solidificado, separe los lóbulos pulmonares individuales.

A continuación, pegue un lóbulo al portaobjetos con pegamento instantáneo. Para obtener secciones transversales de las pequeñas arterias intraasner, tome el lóbulo craneal del pulmón derecho y péguelo con la superficie del hilio hacia el portaobjetos utilizando un vibrátomo equipado con una cuchilla de afeitar nueva, cortando el lóbulo pulmonar en rebanadas de 200 micrones de grosor desde la periferia. Para obtener secciones transversales de las arterias preaser más grandes, alinee el hilio del pulmón izquierdo con el corcho de una botella de champán y pegue el lóbulo en esta orientación al portaobjetos, luego córtelo desde la periferia para la eliminación de los aros.

Transfiera las secciones de órganos a un vaso de vidrio que contenga aproximadamente 200 mililitros de MEM a 37 grados Celsius. Coloque el vaso en un armario calefactor y burbujee con gas normóxico para que las secciones pulmonares se muevan lentamente en el medio. Después de aproximadamente dos horas, las placas de aros que llenan el aire habrán sido eliminadas del tejido pulmonar y las secciones habrán sedimentado en el fondo del vaso.

Para el análisis morfométrico mediante video de las arterias intrapulmonares, transfiera una sección pulmonar a la cámara de superfusión de flujo continuo, que está montada sobre un microscopio y contiene 1,2 mililitros de MEM oxigenado en condiciones normóxicas. Fije la sección pulmonar en el fondo de la cámara con hilos de nailon conectados a un anillo de platino. Comience a perfundir la cámara con medio oxigenado en condiciones normóxicas.

Utilice un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 10 x para examinar la sección pulmonar en busca de arterias seccionadas transversalmente con diámetros internos entre 20 y 100 micrones. Una vez localizado un vaso candidato adecuado, utilice el objetivo de 20 x para tomar una imagen de una arteria preasner o, como se muestra aquí, el objetivo de 40 x para tomar una imagen de una arteria intraasner para medir el diámetro interno del vaso. Antes de comenzar el experimento, configure el software para que tome imágenes de la arteria seccionada transversalmente cada minuto durante todo el experimento.

Después de activar la fotografía, continúe la perfusión de la cámara con medio gaseoso normóxico durante 10 minutos. Luego, sumerja la sección pulmonar en U 466 19 durante 10 minutos sin flujo, para analizar la contractilidad de la arteria utilizando únicamente vasos cuyas áreas luminas se redujeron en al menos un 30 % con U 466 19. Lave el fármaco con medio gaseoso normóxico durante 10 minutos.

Luego, dilate la arteria mediante la aplicación de res durante 10 minutos sin flujo bajo. Nuevamente, retire el fármaco con un lavado de 10 minutos con medio oxigenado normal a un flujo de seis mililitros por minuto, seguido de 10 minutos a un flujo de 0,7 mililitros por minuto. A continuación, incube la sección de pulmón con medio gaseificado hipóxico alto durante 40 minutos.

Además, haga fluir la mezcla de gas hipóxico al espacio aéreo de la cámara de perfusión mediante un conjunto adicional de tubos. Retire el medio hipóxico mediante un lavado de 20 minutos con medio gaseado en condiciones normóxicas y cambie del flujo de gas hipóxico al flujo de gas normóxico en el espacio aéreo de la cámara para verificar la viabilidad del vaso. Al final del experimento, agregue U 466 19 a la cámara de perfusión e incube durante 20 minutos sin flujo para inducir la vasoconstricción.

Repita estos pasos con una sección fresca de pulmón para medir la reactividad vascular de otro vaso. Comience el análisis cargando las imágenes de las arterias seccionadas transversalmente en un programa de análisis de imágenes. Luego, utilice un cursor para delinear el área luminal del vaso.

El secado de la mano es necesario para evitar artefactos debidos, por ejemplo, a células sanguíneas adheridas a la pared vascular. Continúe analizando las imágenes transversales de manera similar. Se debe analizar cada imagen cuando una condición en el flujo a través de la cámara de incubación cambia a otra, pero es suficiente analizar cada dos imágenes cuando las condiciones no están cambiando.

La vasoconstricción pulmonar hipóxica es observable en estas imágenes de contraste de fase de una arteria pre ASIN seccionada transversalmente, que discurre en estrecha proximidad a un bronquio seccionado transversalmente. Las imágenes se tomaron en los momentos indicados por círculos en la gráfica: al comienzo de la medición, al final de la med游戏副本ión con U 466 19, tras la exposición a RAs después de 30 o 40 minutos en medio con atmósfera hipóxica, tras el lavado con medio con atmósfera normóxica y tras la aplicación final de U 466 19. La reactividad vascular se registra como cambios relativos del área luminal de la arteria seccionada transversalmente en función del tiempo. El área al comienzo del experimento se define como 100 %, y la vasoconstricción se expresa como valores relativos al área inicial.

En este caso, la exposición a la hipoxia induce una reducción del 60 % del área luminal para una presentación más clara de la respuesta hipóxica. No se muestra aquí la fase inicial del experimento en la que se evaluó la reactividad vascular, y el valor obtenido inmediatamente antes de la exposición al oxígeno reducido se establece en un 100 %. El otro tipo de vasos examinados en estos estudios son las arterias intra ASIN, que se localizan en las uniones de los septos alveolares. En este conjunto de experimentos, se analiza el impacto de sidal, un abridor no selectivo de los canales mitocondriales de potasio sensibles a ATP, sobre la vasoconstricción pulmonar hipóxica de pequeñas arterias intra asner con este propósito.

Los cortes se incuban en medio hipóxico. En ausencia o presencia de 50 micromolar de sidal, se realizan controles de incubación en medio gaseoso normóxico para una presentación más clara de la respuesta a normoxia, hipoxia o hipoxia más sidal. Los valores obtenidos inmediatamente antes de la exposición al medio gaseoso normóxico o hipóxico se establecen como 100 %. La arteria expuesta a pineal no muestra una disminución en el área, a diferencia de la arteria incubada en medio hipóxico sin aditivos.

En medio normóxico, no se detectan cambios en el área luminal. Las grabaciones de pequeñas arterias intra ASIN expuestas al medio gástrico hipóxico con o sin 50 micromolar de sidal se presentan como medias más o menos SEM. En esta gráfica, se muestran los datos relativos con respecto al valor al inicio de la incubación hipóxica.

No se detecta reactividad vascular. En los cortes de pulmón expuestos a gas hipóxico, la contracción vascular inducida por U 466 19 en el medio no se ve afectada por el fármaco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes finos de pulmón con precisión, y de cómo utilizarlos para la medición cuantitativa de la reactividad vascular de pequeñas arterias intraalveolares con diámetros entre 20 y 40 micrómetros, localizadas en la pared de los septos alveolares, y de arterias prealveolares más grandes con diámetros entre 40 y 100 micrómetros, que discurren adyacentes a los bronquios y bronquiolos.