Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform
7 de noviembre de 2013
Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar el sistema para una amplia gama de aplicaciones.
El objetivo general del experimento de caída es entregar macromoléculas sin vectores a células diana mediante la perturbación mecánica. Esto se logra primero colocando el tipo celular diana en suspensión con el material de entrega deseado y cargándolo en el depósito de un dispositivo microfluídico especialmente diseñado. En un segundo paso, se presuriza el dispositivo microfluídico y las células se hacen pasar a través de una serie de canales microfluídicos que comprimen las células para facilitar la perturbación transitoria de la membrana.
A continuación, se permite que las células incuben en presencia del material de entrega objetivo para facilitar el transporte difusivo del material hacia el citoplasma celular. Mientras se repara la membrana celular, se obtienen resultados que muestran una entrega eficaz de macromoléculas mediante el uso de citometría de flujo.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección y la lipofección es que es capaz de abordar tipos celulares y materiales difíciles que no pueden ser eficazmente entregados por otros métodos. Este método puede responder preguntas clave en el campo biológico, como cómo mejorar la reprogramación celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico del cáncer porque el sistema permite la manipulación de células inmunitarias para mejorar su eficacia antitumoral.
Para comenzar, fabrique o adquiera el dispositivo microfluídico, el soporte del dispositivo, los depósitos plásticos para fluidos y las juntas tóricas que se muestran aquí y que se enumeran con detalles en el protocolo de texto adjunto, luego llene parcialmente tres recipientes herméticos con etanol al 70 %. Coloque los dispositivos en el primer recipiente, los depósitos y las juntas tóricas en el segundo recipiente, y los soportes en el tercero. A continuación, complete el llenado de los recipientes con etanol al 70 %.
A continuación, coloque el recipiente que contiene los depósitos y las juntas tóricas, así como el que contiene los portamuestras, en un baño ultrasónico durante cinco a 10 minutos antes de su uso. Esto ayudará a eliminar cualquier partícula contaminante de experimentos previos, mientras que los componentes se someten a sonicación. Limpie la superficie de trabajo en una cabina de seguridad biológica con etanol al 70 %. Luego, esterilice todos los materiales necesarios, incluidos los tres recipientes y un par de pinzas, limpiándolos con etanol al 70 % y colóquelos dentro de la cabina de seguridad biológica para comenzar el ensamblaje.
Primero, coloque dos o tres toallitas de baja pelusa en el área de trabajo. Luego, retire los depósitos de plástico del recipiente de etanol con pinzas y colóquelos sobre las toallitas para facilitar la absorción y evaporación del etanol de su superficie interna. Toque suavemente los depósitos para ayudar a eliminar la solución de etanol.
Si es necesario, utilice gas presurizado para purgar completamente el depósito. Una vez que los depósitos estén secos, inserte las juntas tóricas en las ranuras correspondientes de los depósitos. Luego, use pinzas para colocar el chip con la cara hacia arriba en el soporte del dispositivo.
Asegúrese de que el chip esté colocado planamente en el soporte y ajústelo si es necesario utilizando las pinzas. Si el dispositivo no encaja adecuadamente en su soporte, existe el riesgo de que se rompa durante los pasos posteriores. A continuación, coloque suavemente los depósitos sobre el soporte y alínelos con los clips.
Asegúrese de que las juntas tóricas no se salgan de sus ranuras. Durante este proceso, presione suavemente hacia abajo sobre los depósitos hasta que hagan clic y se coloquen en su posición. Asegúrese de que ambos lados de los depósitos estén firmes y de que el chip parezca estar en la posición correcta.
No presione los depósitos con fuerza excesiva, ya que la presión podría romper los chips para células primarias o de adherencia. Siembra las líneas celulares uno o dos días antes del experimento para que no tengan más del 80 % de confluencia.
El día del experimento, inmediatamente antes de comenzar, recolecte las células y resuspenda en medio u otro tampón deseado a una concentración entre un millón y diez millones de células por mililitro. Luego, pase cuidadosamente la suspensión celular a través de una malla de filtro celular de 40 micrones para evitar que los agregados de células y matriz obstruyan el dispositivo.
Una vez filtrado, mezcle 300 microlitros de la suspensión celular con la concentración deseada del material de entrega en un tubo aparte. Para esta demostración, se añaden dos microlitros de dextrina a cinco miligramos por mililitro y dos microlitros del anticuerpo control isotópico Alexa 488 por cada 50 microlitros de suspensión celular.
A continuación, mezcle suavemente 100 microlitros de las células mediante pipeteo. Luego, utilizando puntas para carga de geles, pipetee las células y el material de entrega hacia uno de los depósitos, conecte el tubo de presión al depósito lleno y apriete con los dedos el nudo para asegurar un cierre adecuado. Ajuste entonces la presión de aire a 70 PSI en el regulador para controlar la velocidad con la que las células viajan a través del dispositivo.
La presión debe optimizarse según la combinación específica de células y chip microfluídico utilizada en cada experimento. Una vez que todo esté preparado, eleve el dispositivo a la altura de los ojos y oriente el dispositivo de manera que el líquido en el depósito sea fácilmente visible. Luego, presione la válvula de botón para presurizar el depósito e iniciar el flujo celular.
Observe la velocidad a la que fluye el fluido desde el depósito. Si el flujo se reduce considerablemente en comparación con su velocidad inicial, es probable que el dispositivo montado esté obstruido y necesite ser reemplazado. El aumento del esfuerzo cortante causado por la obstrucción provocará una muerte celular mayor de lo normal.
Cuando el nivel del líquido esté aproximadamente a dos milímetros del fondo del reservorio, gire rápidamente el regulador a cero PSI para detener el flujo. Es importante detener el flujo de aire antes de que el reservorio se vacíe, ya que de lo contrario la muestra podría expulsarse del reservorio de recolección. Luego, recoja las células tratadas del reservorio de salida y colóquelas en un tubo de microcentrífuga.
A temperatura ambiente, las células clasificadas continuarán incorporando material durante hasta 10 minutos. Después de 10 minutos, siembre las células con medio adicional o continúe utilizando las células según las necesidades del experimento. Repita estos pasos para recolectar tantas células tratadas como sean necesarias e intercambie los chips según sea necesario si se obstruyen, descartando los dispositivos obstruidos C para cada muestra subsiguiente.
Cambie la dirección del flujo para minimizar los efectos de obstrucción. Una vez finalizada la recolección de células, desconecte suavemente los depósitos del soporte principal apartando las palancas del clip. Luego coloque cada pieza que vaya a reutilizarse en el recipiente de almacenamiento adecuado y llénelos con etanol al 70% fresco.
Finalmente, coloque todos los chips usados en un recipiente aparte para su eliminación adecuada. Se midieron la eficiencia de entrega y la viabilidad celular de las células HeLa. Tras una serie de experimentos, se probaron tres chips microfluídicos diferentes a una gama de velocidades de hasta 600 milímetros por segundo.
Estas pruebas mostraron que velocidades de flujo más altas mejoraron la entrega de dextrina marcada con fluorescencia de tres kilodaltonos a las células en cada uno de los chips evaluados. Además, velocidades más altas también provocaron una disminución de aproximadamente el 20 % en la viabilidad celular en los dispositivos probados. Esta cantidad de muerte celular es relativamente baja y a menudo es mucho mayor en dispositivos inadecuadamente diseñados.
La absorción de dextrina conjugada con azul Pacífico en la población de células control mostrada a la izquierda es el resultado de efectos limitados de unión superficial y endocíticos. Dado que las células están expuestas al material de entrega durante el mismo período de tiempo que las células tratadas. A la derecha se encuentra la población de células vivas que pasan a través del dispositivo microfluídico mientras están expuestas a la misma concentración de dextrina que las células control.
Las células en la región sombreada se consideran no entregadas, y las células a la derecha de la línea se definen como entregadas. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de una hora si se realiza correctamente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la vida post optometría, con el fin de responder preguntas adicionales, como la eficiencia de entrega y la funcionalidad del material, tras su desarrollo.
Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa exploraran la programación celular en células primarias adultas mediante la administración directa de proteínas. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y operar el sistema de autoexprimido para su aplicación deseada.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para la entrega libre de vectores de macromoléculas en células diana mediante deformación mecánica rápida. El protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico para facilitar este proceso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Microfluídica
- Técnicas de entrega intracelular
Antecedentes
- La perturbación mecánica ofrece un enfoque novedoso para la entrega de materiales en las células.
- Este método puede dirigirse a tipos celulares difíciles que son complicados de transfectar.
- Tiene aplicaciones potenciales en la terapia contra el cáncer y la manipulación de células inmunitarias.
- La citometría de flujo se utiliza para evaluar la eficacia de la entrega.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la entrega intracelular eficiente de macromoléculas.
- Mejorar la comprensión de las técnicas de reprogramación celular.
- Incrementar la eficacia terapéutica de las células inmunitarias contra los tumores.
Métodos Utilizados
- Fabricación y esterilización de un dispositivo microfluídico.
- Preparación de suspensiones celulares y materiales de entrega.
- Presurización del dispositivo microfluídico para inducir la deformación celular.
- Análisis mediante citometría de flujo para evaluar el éxito de la entrega.
Resultados Principales
- Se logró la entrega exitosa de macromoléculas en células diana.
- La citometría de flujo confirmó la absorción intracelular eficaz.
- El método demostró ventajas frente a las técnicas tradicionales de entrega.
- Se destacaron aplicaciones potenciales en el tratamiento del cáncer.
Conclusiones
- Este método mecánico de entrega es una alternativa prometedora para tipos celulares difíciles.
- Abre nuevas vías de investigación en la manipulación celular y la terapia.
- Se necesitan estudios adicionales para optimizar la técnica en diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración intracelular libre de vectores sigue siendo un cuello de botella crítico en el desarrollo terapéutico, particularmente para células inmunitarias primarias y tipos celulares difíciles de transfectar. Esta plataforma de compresión microfluídica permite la administración directa al citosol de macromoléculas y nanomateriales sin necesidad de modificaciones químicas ni tampones especializados, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas. Al mejorar la eficiencia de administración en sistemas complejos, el método fortalece la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento y disminuye los riesgos en las vías de traslación para aplicaciones de inmunoterapia y medicina regenerativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de hipótesis terapéuticas en células inmunitarias primarias y modelos de reprogramación.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible y libre de tampones para la entrega de factores de transcripción, anticuerpos o ácidos nucleicos para evaluar la interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Apoya las decisiones de continuar o descartar al confirmar la entrega intracelular de moléculas efectoras antes de los ensayos funcionales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en citometría de flujo de la eficiencia de entrega en diferentes tipos celulares y concentraciones de material.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras mediante tasas de cizallamiento controladas y geometría del dispositivo, minimizando la variabilidad en ensayos de alto rendimiento.
- Preparación para ensayos: Proporciona porcentajes de entrega y métricas de viabilidad que permiten la clasificación de compuestos o materiales en flujos de trabajo de identificación de candidatos promisorios.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta la modulación de células inmunitarias a escala de descubrimiento con la evaluación preclínica de una eficacia antitumoral mejorada.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Confirma la entrega citosólica de proteínas inmunomoduladoras, reduciendo la dependencia de sistemas de expresión endógenos.
- Sistemas Relevantes para la Enfermedad: Permite pruebas en linfocitos T primarios, células dendríticas y células madre relevantes para la inmunoterapia contra el cáncer y la medicina regenerativa.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis en biología temprana, la generación de muestras listas para ensayos destinadas a cribado y la validación mecanicista antes de los estudios in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la validación de dianas mediante la entrega de componentes CRISPR, ARNip o anticuerpos para confirmar la participación de vías en la activación inmunitaria o el destino celular.
- Cribado: Entrega bibliotecas de nanomateriales o péptidos a células inmunitarias para su absorción y cribado funcional bajo condiciones de cizalladura estandarizadas.
- Análisis: Proporciona porcentajes cuantitativos de eficiencia de entrega y viabilidad derivados de citometría de flujo como puntos finales para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Permite pruebas preclínicas de células inmunitarias modificadas con cargas entregadas para evaluar la actividad de eliminación de tumores en modelos de co-cultivo.
- Reutilización Empresarial: El diseño de la plataforma permite su reutilización en diferentes tipos celulares y cargas mediante únicamente la optimización de presión y chip, lo que favorece su implementación escalable en descubrimiento y desarrollo de procesos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce los falsos negativos en la validación de objetivos al lograr la entrega en células primarias y no divididas donde fallan los métodos virales o basados en lípidos.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de conjugación del cargamento, tampones especializados o producción viral, lo que simplifica el flujo de trabajo y reduce el costo por condición.
- Valor estratégico: Aumenta la confianza en candidatos inmunomoduladores en etapas tempranas al confirmar la entrega intracelular antes de realizar estudios en animales intensivos en recursos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de biológicos dependientes de la entrega, como moléculas biespecíficas de citoquinas o terapias con factores de transcripción, basándose en las concentraciones citosólicas alcanzables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de dispositivos microfluídicos, preparación de suspensiones celulares y regulación de presión para evitar obstrucciones o muerte excesiva inducida por cizallamiento.
- Depende del acceso a chips microfluídicos, reguladores de presión, sistemas de reservorio y citometría de flujo para la lectura; compatible con los procedimientos estándar en cabinas de seguridad biológica.
- Necesita la estandarización de la concentración celular (1–10 millones/mL), filtración previa mediante filtros de 40 µm y tiempo de incubación (≤10 min tras la entrega) para garantizar la reproducibilidad entre usuarios y sitios.
- Requiere optimización de la presión (por ejemplo, 70 PSI) y de la velocidad de flujo según el tipo celular y el diseño del chip, a fin de equilibrar la eficiencia de entrega y la viabilidad, con una pérdida de viabilidad típicamente <20% bajo condiciones optimizadas.
- Limitado por la posible obstrucción debido a agregados o restos celulares, lo que exige filtración de las células y reemplazo regular del chip; el rendimiento varía según el tamaño celular, la rigidez de la membrana y el peso molecular del material cargado.
