Name: Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a entregar macromoléculas sin vectores a células mediante deformación mecánica usando un dispositivo microfluídico. Este método permite la manipulación de células difíciles de transfectar para aplicaciones terapéuticas.

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Damos las gracias a T. Shatova útil para el debate sobre el diseño experimental y análisis de datos. La ayuda y la experiencia de G. Paradis, el personal de la citometría de flujo básico en el Instituto Koch, y el personal del Laboratorio de Tecnología de Microsistemas en el Instituto de Tecnología de Massachusetts Se agradecen. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, y en parte por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de Apoyo (Core) Subvenciones P30-CA14051 y MPP-09Call-Langer-60.

1. Almacenamiento <ol><li> Guarde los depósitos, soportes, juntas tóricas y los dispositivos de microfluidos en etanol al 70%. Use un recipiente (por ejemplo, frasco o vaso de precipitados) que tiene una tapa para evitar la evaporación y la contaminación por partículas de polvo o fuera. Coloque los dispositivos en un contenedor (1), embalses y juntas tóricas en un segundo recipiente (2), y los titulares en el tercer (3). </li></ol> Nota: El uso de etanol al 70% para el almacenamiento es para mantener la esterilidad. Si los únicos componentes de la solución son el etanol y el agua (es decir, sin agentes desnaturalizantes), todos los componentes del sistema deben ser totalmente compatibles y no se degradarán con el tiempo. <ol start="2"><li> Cambie solución de etanol en recipientes (2) y (3) antes de cada uso para evitar la contaminación cruzada a través de experimentos y reducir al mínimo la presencia de partículas no deseadas que pueden causar la obstrucción. </li></ol> 2. Preparación experimental <ol><li> Ponga sus recipientes (2) y (3) en un baño de ultrasonido for 5-10 min antes de cada uso. Esto ayuda a eliminar las partículas contaminantes de los experimentos anteriores. </li><li> Espacio de trabajo limpio en cabinas de seguridad con una solución de etanol al 70%. </li><li> Rocíe todos los materiales (3 contenedores y pinzas) con una solución de etanol al 70% antes de colocarlos en el interior de la cabina de bioseguridad. </li></ol> 3. Montaje <ol><li> Deposite 2-3 toallitas bajo pelusa en el área de trabajo. </li><li> Eliminar depósitos de plástico de su contenedor con unas pinzas y ponerlos en las toallitas para facilitar la evaporación de la solución de etanol a partir de superficies interiores. Golpear suavemente los depósitos en la superficie o soplar el aire a través de ellos para facilitar la eliminación de la solución de etanol. </li><li> Inserte las juntas tóricas en su ranura correspondiente de los depósitos. </li><li> Retire el soporte y las fichas de los contenedores respectivos y permitir que el etanol se evapore (~ 1-2 min). </li><li> Use pinzas para colocar el chip boca arriba deseada (es decir, los agujeros de acceso de seguridad) en el soporte. Levante el soportecon el chip a nivel de los ojos para asegurarse de que el chip está plana en el soporte y ajuste si es necesario con las pinzas. IMPORTANTE: Si el dispositivo no encaja correctamente en su soporte, existe el riesgo de que se rompa durante las etapas posteriores. </li><li> Luego, coloque suavemente los embalses en el soporte y alinearlos con los clips. Tenga cuidado de que las juntas tóricas no se salgan de sus ranuras durante este proceso. </li><li> Presione suavemente hacia abajo en los embalses hasta que encajen en su lugar. Asegúrese de que ambos lados de los embalses sean seguros y que el chip parece estar en la posición correcta. </li></ol> 4. Preparación de células <ol><li> Para células adherentes (líneas primarias o establecidas: células de la placa) 1-2 días antes del experimento de manera que sean no más de 80% de confluencia en el día del experimento. </li><li> Coloque las células en suspensión (en PBS o medio relevante) y aspirar a una concentración de funcionamiento de 1,0 x 10 6 células / ml a 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTA: No se han observado cambios significativos en el rendimiento de la entrega debido a la concentración de células. </li><li> Mezclar las células y el material de entrega deseado en un tubo separado para obtener la concentración de material deseado para el experimento. IMPORTANTE: Debido a que el método de entrega descrito se basa en la difusión para facilitar la entrega, una concentración de material de más alto producirá la entrega superior. Si es posible, se recomienda utilizar una solución 1 M de material deseado para los ensayos iniciales. Esta concentración puede entonces ser titulada en futuros experimentos, según sea necesario. La concentración más baja reportada utilizado con este dispositivo es 10 nM 21. </li></ol> 5. Operación <ol><li> Mezcla de pipetas de células y el material de entrega en un depósito (diseño actual tiene una capacidad máxima de 150 l). NOTA: La mayoría de los diseños de dispositivos son totalmente reversibles, por tanto, la dirección del flujo a través de los canales, no importa. Las muestras pueden ser cargados en cualquiera de los dos depósitos. </li&gt; <li> Conecte el tubo de presión para el depósito lleno y apriete la tuerca para garantizar el cierre (apretado el dedo suele ser suficiente). </li><li> Ajustar la presión al nivel deseado en el regulador. Esto controla la velocidad a la que las células viajan a través del dispositivo. Tenga en cuenta que el flujo de células no se inicia hasta que se pulse el botón. </li></ol> NOTA: En el trabajo anterior, nitrógeno o aire comprimido han trabajado igualmente bien como gas portador. <ol start="4"><li> Elevar dispositivo a nivel de los ojos y orientarla de modo que el líquido en el depósito es fácilmente visible. NOTA: Seguimiento de la columna de líquido para apagar el sistema antes de vaciar el depósito. </li><li> Pulse el botón para presurizar el depósito y comenzar el flujo de células. </li><li> Cuando el nivel de líquido es de aproximadamente 2 mm de la parte inferior del depósito, gire rápidamente el regulador a 0 psi para detener el flujo. IMPORTANTE: Si uno no logra detener el flujo antes de vaciar el depósito, se corre el riesgo de expulsar la muestra de la CollectioN depósito. También tenga en cuenta que si la columna de fluido no se está moviendo a un ritmo apreciable, o ha disminuido sustancialmente en relación a su caudal inicial (por ejemplo, 3 veces más lento), el dispositivo montado probablemente obstruido y necesita ser intercambiado. La operación de un dispositivo obstruido puede conducir a una mayor muerte celular. </li><li> Recoger las células tratadas desde el depósito correspondiente y colocarlos en el tubo de recogida / plato deseado. IMPORTANTE: No diluir las células recogidas en cualquier búfer en esta etapa ya que las células porated continuarán con la captación de material para un máximo de 10 min 20. Después de esta ventana ha pasado, diluir las células en los medios de comunicación / tampón deseada. </li><li> Para recoger las células tratadas más o tratar condiciones experimentales alternativos, repita los pasos 5.1 a 5.7, según sea necesario. Recordemos que las fichas son reversibles, por lo tanto, las muestras se pueden montar en cualquiera de los depósitos. Asegúrese de cambiar fichas según sea necesario si se obstruyen. Deseche dispositivos tapados. </li></ol> 6. Desmontaje <ol><li&gt; Desconecte con cuidado los depósitos del titular principal pulsando un lado las armas de clip. </li><li> Coloca cada pieza en el recipiente de almacenamiento adecuado (que se detallan en la sección 1). </li><li> Coloque los chips usados ​​en un contenedor separado para su eliminación. </li></ol>

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</ol>

Los autores Armon Sharei, Robert Langer, y Klavs F. Jensen son accionistas de SQZ Biotecnologías Empresa que produce los dispositivos de microfluidos utilizados en este artículo.

Pueden necesitar ser optimizado en función del tipo de células y material de suministro del sistema se aplica a ciertos aspectos del procedimiento experimental descrito (es decir, factores distintos de diseño de chips y la velocidad de funcionamiento). La discusión que sigue trata sobre algunos de los factores más comunes a tener en cuenta en el diseño de experimentos. Para mejorar la señal de entrega de compuestos marcados con fluorescencia, se necesita para hacer frente a las fuen...

La entrega de macromoléculas a la citoplasma de la célula es un paso crítico en aplicaciones terapéuticas y de investigación. Nanopartículas mediada por la entrega, por ejemplo, ha demostrado su potencial en la terapia génica de 1,2, mientras que la entrega de proteínas es un medio prometedor para afectar la función celular en tanto clínicos y de laboratorio 3 4 ajustes. Otros materiales, tales como fármacos de moléculas pequeñas, puntos cuánticos, o nanopartículas de oro, son de interés en aplicaciones que van desde la terapéutica del cáncer 5,6 a 7,8 etiquetado intracelular, y una sola molécula de seguimiento 9. La membrana celular es en gran medida impermeable a macromoléculas. Muchas de las técnicas existentes utilizan nanopartículas poliméricas, liposomas 10,11 12, o modificaciones químicas 13 para facilitar la ruptura de la membrana o la entrega de endocitosis. En estos métodos, la eficiencia en la entrega y la viabilidad celular son a menudo depende de la estructura de the molécula diana y el tipo de célula. Estos métodos pueden ser eficaces en la entrega de los materiales estructuralmente uniformes, tales como ácidos nucleicos, pero a menudo son poco adecuado para la entrega de más estructuralmente diversos materiales, tales como las proteínas y los nanomateriales 14,15 7. Por otra parte, el mecanismo de interrupción endosoma que la mayoría de estos métodos se basan en es a menudo ineficaz, por lo tanto, dejando mucho material atrapado en estructuras vesiculares 16. Por último, los métodos que a menudo se desarrollan para su uso con las líneas celulares establecidas no se traducen bien a las células primarias. Métodos poración de membrana, tales como la electroporación 17,18 y sonoporación 19, son una alternativa atractiva en algunas aplicaciones, sin embargo, se sabe que causan la viabilidad celular baja y puede ser limitado por la carga del material de entrega esperados. Deformación mecánica rápida de las células, un enfoque de microfluidos para la entrega, tiene recientemente demonstrATED sus ventajas sobre las técnicas actuales en el contexto de la reprogramación celular 20 y la entrega nanomaterial 21. Este método se basa en la rotura mecánica o la membrana celular para facilitar la entrega citosólica de los materiales presentes en el tampón circundante. El sistema ha demostrado que permite el potencial para desafiar previamente tipos de células (por ejemplo, células inmunes primarias y las células madre) y materiales (por ejemplo, anticuerpos y nanotubos de carbono). En este documento, se describe el procedimiento general para utilizar estos dispositivos para la entrega intracelular de macromoléculas diana. El procedimiento es generalizable a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega, sin embargo, se recomienda que uno Realizar una pequeña optimización de las condiciones, como se detalla en nuestras pautas de diseño de informes anteriores 20, para cualquier aplicación que no reportados previamente. Hasta la fecha, el sistema ha sido utilizado con éxito para la entrega de ARN, ADN, las nanopartículas de oro, puntos cuánticos, nanotubos de carbono, proteínass, y polímeros de dextrano 20,21.

<table><tbody><tr><td>Soporte del dispositivo & Depósito de plástico</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Holder</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Analyzer</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Máquina de citometría de flujo utilizada en el Instituto Koch Instalaciones centrales</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Cell Squeeze</td><td></td></tr><tr><td>O-Rings</td><td>McMaster</td><td>9452K311</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de presión para operar dispositivo</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Sistema de</td><td></td></tr><tr><td>presión Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td></td> de ultrasonidos</tr></tbody></table>

exprimir la célula como un robusto, microfluidic intracelular delivery platform

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Esta tecnología ha demostrado su potencial en el tratamiento de las solicitudes previamente difíciles, como son, la entrega de las células primarias inmunes, la reprogramación celular, nanotubos de carbono, y la entrega de puntos cuánticos. Esta plataforma de microfluidos libre de vectores se basa en la rotura mecánica de la membrana celular para facilitar la entrega citosólica del material objetivo. En este documento, se describe el método detallado de uso de estos dispositivos de microfluidos, incluyendo, conjunto de dispositivo, preparación de células, y la operación del sistema. Este enfoque requiere la entrega de un breve optimización del tipo de dispositivo y condiciones de funcionamiento de las aplicaciones antes publicados. Las instrucciones que se proporcionan son generalizables a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega ya que este sistema no requiere tampones especializados o pasos modificación química / de conjugación. Este trabajo también proporcionans de recomendaciones sobre cómo mejorar el rendimiento del dispositivo y localizar averías problemas potenciales relacionados con la obstrucción, la eficiencia de entrega de baja, y la viabilidad celular.

La figura 1 contiene un esquema descriptivo del sistema de suministro de microfluidos. Figuras 2a-b ilustran resultados típicos de tratamiento de las células HeLa con diferentes diseños de dispositivos en la presencia de fluorescencia conjugado 3 kDa de dextrano 20. Si el procedimiento se sigue correctamente, el rendimiento del sistema será sensible al tipo de dispositivo y la velocidad de operación. Por lo tanto, se debe optimizar estas condiciones para una aplicación dada a...

Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar el sistema para una amplia gama de aplicaciones.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

El objetivo general del experimento de caída es entregar macromoléculas sin vectores a células diana mediante la perturbación mecánica. Esto se logra primero colocando el tipo celular diana en suspensión con el material de entrega deseado y cargándolo en el depósito de un dispositivo microfluídico especialmente diseñado. En un segundo paso, se presuriza el dispositivo microfluídico y las células se hacen pasar a través de una serie de canales microfluídicos que comprimen las células para facilitar la perturbación transitoria de la membrana.A continuación, se permite que las células incuben en presencia del material de entrega objetivo para facilitar el transporte difusivo del material hacia el citoplasma celular. Mientras se repara la membrana celular, se obtienen resultados que muestran una entrega eficaz de macromoléculas mediante el uso de citometría de flujo.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección y la lipofección es que es capaz de abordar tipos celulares y materiales difíciles que no pueden ser eficazmente entregados por otros métodos. Este método puede responder preguntas clave en el campo biológico, como cómo mejorar la reprogra

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Un sistema de microfluidos novela ha sido desarrollado utilizando el fenómeno de bombeo y un pasivo controlado por el usuario de sistemas de fluidos de entrega. Este sistema de microfluidos tiene el potencial para ser utilizado en una amplia variedad de aplicaciones biológicas debido a su bajo costo facilidad de uso, precisión volumétrica, de alta velocidad, repetibilidad y la automatización.

De alta velocidad basada en las gotas de entrega del sistema de bombeo pasiva en dispositivos de microfluidos

La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.

Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Se fabricó un chip microfluídico para producir pares de puntos dorados para la generación de burbujas en tándem e islas recubiertas de fibronectina para el patrón unicelular cercano. El campo de flujo resultante se caracterizó mediante velocimetría de imágenes de partículas y se empleó para estudiar varios efectos biológicos, incluida la poración de la membrana celular, la deformación de la membrana y la respuesta al calcio intracelular.

Un sistema de microfluidos con modelar superficie de Investigación de la burbuja de cavitación (s) Interacción -Cell y los Bioefectos resultante en el nivel de celda única

Este protocolo describe el montaje y la operación de un dispositivo acoustofluidic de bajo costo para la entrega molecular rápida a las células vía el sonoporation inducido por los agentes del contraste del ultrasonido.

Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células

El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento

Este protocolo describe la edición miniaturizada del genoma CRISPR–Cas9 del receptor TCRα/β en células T humanas primarias utilizando 'DMF-ection', una plataforma de electroporación microfluídica digital (DMF). El método permite la edición genética paralela y de baja entrada y alta viabilidad y es además adaptable para la entrega de ARNm en esferoides 3D multicelulares.

Una plataforma digital de electroporación microfluídica para edición genómica CRISPR de baja entrada y transfección de ARNm en células T en suspensión y modelos de células 3D

Aprende a entregar macromoléculas sin vectores a células mediante deformación mecánica usando un dispositivo microfluídico. Este método permite la manipulación de células difíciles de transfectar para aplicaciones terapéuticas.

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