Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

El objetivo general del experimento de caída es entregar macromoléculas libres de vectores a las células objetivo mediante disrupción mecánica. Esto se logra colocando primero el tipo de celda objetivo en suspensión con el material de suministro deseado y cargándolo en el depósito de un dispositivo microfluídico especialmente diseñado. Como segundo paso, el dispositivo microfluídico se presuriza y las células son impulsadas a través de una serie de canales microfluídicos que comprimen las células para facilitar la disrupción transitoria de la membrana.

A continuación, se permite que las células incuben en presencia del material de entrega objetivo para facilitar el transporte difusivo del material al citoplasma celular. Mientras se repara la membrana celular. Se obtienen resultados que muestran la administración efectiva de macromoléculas mediante el uso de citometría de flujo.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la ación y la lipoperfección, es que es capaz de abordar tipos de células y materiales desafiantes que no se pueden administrar de manera efectiva con otros métodos. Este método puede responder a preguntas clave en el campo biológico, como por ejemplo cómo mejorar la reprogramación celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico del cáncer, ya que el sistema permite la manipulación de las células inmunitarias para mejorar su eficacia antitumoral.

Para comenzar, fabrique o compre el dispositivo microfluídico, el soporte del dispositivo, los depósitos de fluido de plástico y las juntas tóricas que se muestran aquí y se enumeran con detalles en el protocolo de texto adjunto, luego llene tres recipientes sellables hasta la mitad con etanol al 70%. Coloque los dispositivos en el primer contenedor, los depósitos y las juntas tóricas en el segundo contenedor y los soportes en el tercero. A continuación, llene el resto de los recipientes con etanol al 70%.

A continuación, el recipiente que contiene los depósitos y las juntas tóricas, así como el que contiene los soportes, en un baño de ultrasonidos durante cinco a 10 minutos antes de su uso. Esto ayudará a eliminar cualquier partícula contaminante de experimentos anteriores mientras el componente sonicate limpia el espacio de trabajo en un gabinete de bioseguridad con etanol al 70%. A continuación, esterilice todos los materiales necesarios, incluidos los tres recipientes y un par de pinzas, limpiándolos con etanol al 70% y colóquelos dentro del armario de bioseguridad para comenzar el montaje.

Primero, coloque dos o tres toallitas con poca pelusa en el área de trabajo. A continuación, retire los depósitos de plástico del recipiente de etanol con unas pinzas y colóquelos sobre las toallitas para facilitar la absorción y evaporación del etanol de su superficie interior. Golpee suavemente los depósitos para ayudar en la eliminación de la solución de etanol.

Si es necesario, use gas presurizado para purgar completamente el depósito. Una vez que los depósitos se hayan secado, inserte las juntas tóricas en las ranuras apropiadas de los depósitos. A continuación, utilice unas pinzas para colocar el chip boca arriba en el soporte del dispositivo.

Asegúrese de que el chip esté plano en el soporte y ajústelo si es necesario con las pinzas. Si el dispositivo no encaja correctamente en su soporte, existe el riesgo de que se rompa durante los pasos posteriores. A continuación, coloque suavemente los depósitos en el soporte y alinéelos con los clips.

Asegúrese de que las juntas tóricas no se caigan de sus ranuras. Durante este proceso, presione suavemente los depósitos hasta que encajen en su lugar. Asegúrese de que ambos lados de los depósitos estén seguros y que el chip parezca estar en la posición correcta.

No presione los depósitos con fuerza excesiva. Ya que la presión podría romper los chips para la primaria o la adherencia. Líneas celulares, coloque las células uno o dos días antes del experimento para que no tengan más del 80% de confluentes.

El día del experimento. Inmediatamente antes del experimento, recoja las células y resus, suspenda en un medio u otro tampón deseado a una velocidad de entre uno y 10 millones de células por mililitro. Luego, pase con cuidado la suspensión celular a través de una malla de filtro celular de 40 micras para evitar que los grupos de células y la matriz obstruyan el dispositivo.

Una vez colado, mezcle 300 microlitros de la suspensión celular con la concentración deseada de material de entrega en un tubo separado. Para esta demostración, dos microlitros de dextrina a cinco miligramos por mililitro y dos microlitros de Alexa. Se añaden 4 88 anticuerpos de control de isótopos por cada 50 microlitros de suspensión celular.

A continuación, mezcle suavemente 100 microlitros de las células pipeteando. Luego, usando puntas de carga de gel, pipetee las celdas y el material de entrega en cualquiera de los depósitos, conecte el tubo de presión al depósito lleno y apriete el nudo con los dedos para garantizar el techo adecuado. Luego ajuste la presión de aire a 70 PSI en el regulador para controlar la velocidad a la que las celdas viajan a través del dispositivo.

La presión debe optimizarse para la combinación específica de celda y chip microfluídico utilizada en cada experimento. Con todo preparado, eleve el dispositivo a la altura de los ojos y oriéntelo para que el líquido en el depósito sea fácilmente visible. Luego presione la válvula de botón para presurizar el depósito y comenzar el flujo de la celda.

Observe la velocidad a la que fluye el fluido desde el depósito. Si el fluido se ralentiza sustancialmente en relación con su caudal inicial, es probable que el dispositivo montado esté obstruido y deba cambiarse. El aumento del cizallamiento causado por el bloqueo causará una muerte celular mayor de lo normal.

Cuando el nivel del líquido esté aproximadamente a dos milímetros del fondo del depósito, gire rápidamente el regulador a cero PSI para detener el flujo. Es importante detener el flujo de aire antes de que se vacíe el depósito, o la muestra puede ser expulsada del depósito de recolección. A continuación, recoja las células tratadas del depósito de salida y colóquelas en un tubo de microcentrífuga.

A temperatura ambiente, las celdas clasificadas continuarán absorbiendo material durante un máximo de 10 minutos. Después de 10 minutos, coloque las células en una placa con medios adicionales o continúe usando las células de acuerdo con las necesidades experimentales. Repita estos pasos para recolectar tantas células tratadas como sean necesarias e intercambie los chips según sea necesario si se obstruyen y deseche los dispositivos obstruidos por C para cada muestra subsiguiente.

Cambie la dirección del flujo para minimizar los efectos de obstrucción. Cuando termine de recolectar celdas, desconecte suavemente los depósitos del soporte principal empujando a un lado los brazos del clip. A continuación, coloque cada pieza a reutilizar en el recipiente de almacenamiento adecuado y llénelas con etanol fresco al 70%.

Finalmente, coloque todas las fichas usadas en un recipiente separado para su eliminación adecuada. Se midió la eficiencia de entrega y la viabilidad celular de las células hela. Después de una serie de experimentos, se probaron tres chips microfluídicos diferentes en un rango de velocidades de hasta 600 milímetros por segundo.

Estas pruebas mostraron que el aumento de la velocidad de flujo mejoró la entrega de dextrina conjugada fluorescentemente de tres kilodalton en las células para cada uno de los chips probados. Además, el aumento de la velocidad también hizo que la viabilidad de la célula disminuyera en aproximadamente un 20% en los dispositivos probados. Esta cantidad de muerte celular es relativamente baja y, a menudo, es mucho mayor en dispositivos diseñados incorrectamente.

La absorción de dextrina conjugada con azul del Pacífico en la población de células de control que se muestra a la izquierda es el resultado de efectos endocíticos y de unión a la superficie limitados. Ya que las células están expuestas al material de administración durante la misma cantidad de tiempo que las células tratadas. A la derecha está la población de células vivas que pasan a través del dispositivo microfluídico mientras están expuestas a la misma concentración de dextrina que las células de control.

Las celdas de la región sombreada se consideran no entregadas y las celdas a la derecha de la línea se definen como entregadas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de una hora si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, la vida postoptometría con el fin de responder preguntas adicionales como la eficiencia de la entrega y la funcionalidad del material después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa exploraran la programación celular en células primarias adultas utilizando la administración directa de proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar y operar el sistema de autocompresión para la aplicación deseada.