Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

El objetivo general de este procedimiento es determinar el efecto de un agente farmacológico o de un estado patológico sobre el tono vascular inducido por presión en arterias mesentéricas de pequeña resistencia. Esto se logra primero aislando el arco mesentérico a partir de un modelo murino. El segundo paso consiste en diseccionar las arterias de pequeña resistencia de cuarto orden.

Los siguientes pasos son la canulación, presurización e incubación de la preparación arterial. En PSS, el paso final consiste en evaluar la integridad fisiológica de la preparación arterial, lo cual se demuestra mediante el desarrollo espontáneo de tono vascular y una respuesta reversible adecuada a un vasoconstrictor y a un vasodilatador. Finalmente, puede medirse la constricción inducida por presión.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia o el diagnóstico de hipertensión, hipotensión o disfunción vascular. Debido a que esta técnica identifica los mecanismos clave subyacentes a los cambios inducidos por la presión en el tono vascular, que es un determinante clave de la resistencia vascular, la perfusión y la presión arterial. Este procedimiento será demostrado por el Dr. Jja, quien es investigador posdoctoral en nuestro laboratorio.

Comience este procedimiento cargando una cánula de vidrio en un porta-pipeta micrométrico y fijando el porta-pipeta micrométrico a una cámara de perfusión para preparar la cámara de perfusión. Enjuáguela con agua Milli Q, seguido de solución de disección durante cinco minutos cada uno. A continuación, cargue la cámara con dos mililitros de solución de disección.

A continuación, llene cuidadosamente toda la cánula y el tubo conectado sin generar burbujas. Prepare dos suturas, cada una con un nudo medio, utilizando fórceps romos bajo el microscopio de disección. Utilice fórceps de disección para colocar ambas cánulas con nudos de sutura parcialmente cerrados ligeramente alejados de la punta.

A continuación, realice una laparotomía media en una rata anestesiada desde la pelvis hasta el esternón, haciendo primero una incisión en la piel y luego una incisión en la capa muscular subyacente. Se debe tener cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales. Amarre ambos extremos por separado para prevenir la fuga de quimo y heces, con el fin de evitar la contaminación de la solución de baño extracelular.

A continuación, corte el extremo proximal del intestino cerca del poro y el extremo distal, cerca de la unión ileocecal. Luego, realice una incisión en el mesenterio en su base, cerca de la vasculatura alimentaria. A continuación, transfiera todo el lecho mesentérico del intestino delgado a un vaso de precipitados de 50 mililitros que contenga solución de disección fría con hielo e incube durante cinco minutos.

Luego, enjuáguelo con solución de disección fresca para eliminar la sangre. Ahora sujete el extremo proximal del intestino en el lado derecho sobre un recipiente recubierto de cera, extendiendo el intestino restante en una trayectoria en sentido antihorario. Sujete el segmento para extender el mesenterio y exponer los vasos sanguíneos bajo un microscopio estéreo de aumento.

Extraiga las arterias mesentéricas pequeñas de tercer y cuarto orden paralelas al intestino delgado, eliminando primero toda la grasa que las cubre cerca de la rama de segundo orden. Luego, aísle la vena y separe la arteria con un punto de bifurcación en forma de V. Tenga cuidado de no perforar el segmento seleccionado.

A continuación, aísle una sección de cuatro a cinco milímetros de la arteria que sea paralela al intestino delgado. Corte todas las ramas de quinto orden que se insertan en el intestino delgado ligeramente alejadas del origen de las ramas y conserve una porción. Estas porciones servirán como sitios de sujeción para transferir los segmentos arteriales a una cámara de perfusión y posteriormente guiar su canulación.

Luego, corte los segmentos arteriales realizando dos incisiones distales a las ramas de quinto orden en cada lado de la arteria y transfiéralos a la cámara de perfusión. Canule un extremo de los vasos en una micropipeta de vidrio sujetando la punta del segmento arterial con fórceps de disección. Deslice la sutura previamente cargada y parcialmente cerrada hacia el extremo canulado y fíjela.

Posteriormente, conecte una jeringa de 10 mililitros cargada con solución de disección a la llave de paso conectada a esta cánula. Eleve suavemente la jeringa. La fuerza gravitacional sobre la solución eliminará la sangre intravascular del extremo abierto del vaso.

Después de eliminar la sangre intrarterial, cierre la llave de paso. Ahora ate el extremo distal de los vasos a una segunda cánula de vidrio acercando cuidadosamente la otra cánula lo más posible al extremo sin atar del segmento arterial. Deslice la sutura previa cargada y parcialmente cerrada hasta el extremo canulado y asegúrela.

Se debe tener cuidado de no tirar ni jalar los segmentos arteriales y asegurarse de que las llaves de paso unidas a ambas cánulas estén cerradas. Transfiera la cámara de perfusión al portaobjetos del microscopio invertido equipado con grabación de video en vivo. Luego, conecte la llave de paso de la cánula atada al extremo proximal del segmento arterial a un dispositivo servocontrolado de regulación de presión.

Asegúrese de que la llave de paso conectada a la otra cánula permanezca cerrada para mantener una presión intraluminal estable. A continuación, conecte el tubo de vacío al tubo de perfusión y el puerto de succión al puerto de perfusión de la cámara. Comience a perfundir el vaso con PSS tibio a través del calentador de solución en línea único a una velocidad de dos mililitros por minuto.

Utilizando una bomba peristáltica, encienda el vacío y ajuste la temperatura del PSS en la cámara a aproximadamente 37 grados Celsius. Aumente lentamente la presión intraluminal desde 20 hasta 100 milímetros de mercurio. Revise el vaso en busca de fugas utilizando el ajuste de presión automático del regulador de presión.

Después de eso, evalúe el segmento arterial en busca de curvas mientras mantiene la presión en 100 milímetros de mercurio. Utilizando la palanca de tornillo, mueva la cánula para enderezar el segmento arterial y no estire en exceso los segmentos arteriales. Luego reduzca la presión a 70 milímetros de mercurio para imitar la presión in vivo en el arco mesentérico y permita que el segmento arterial se estabilice y desarrolle tono miogénico.

En este procedimiento, observe la arteria con un objetivo de 10 x bajo un microscopio equipado con una cámara de video monocromática. Acople el dispositivo de la cámara. Mida el diámetro luminal utilizando un capturador de cuadros de video y un sistema de detección de bordes en tiempo real.

Luego registre el diámetro del vaso y supervise el desarrollo del tono miogénico. Después, reduzca la presión a 20 milímetros de mercurio y permita que el diámetro se estabilice. A continuación, aumente la presión intraluminal en pasos incrementales, como 20, 40, 60, 80 y 100, y permita que la arteria alcance un diámetro estable a cada presión.

A continuación, repita la respuesta al paso de presión en PSS sin calcio que contiene 0,39 milimolares de EGTA y 0,1 milimolares de nitroprusiato de sodio, tal como indica el registro. El diámetro de las arterias mesentéricas pequeñas de ratas disminuye espontáneamente cuando se presurizan a 70 milímetros de mercurio. La adición de 1 micromolar de acetilcolina aumentó el diámetro hasta alcanzar un valor cercano al diámetro inicial. La adición de 1 micromolar de fenilefrina al baño de tejidos redujo el diámetro arterial, y esta figura muestra que la incubación de las arterias mesentéricas pequeñas en PSS sin calcio incrementa el diámetro arterial. El diámetro de un único segmento arterial presurizado en diversos perfusados se muestra en esta tabla.

Aquí se registra continuamente el diámetro arterial mientras se aumenta progresivamente la presión intraluminal en presencia de PSS y PSS sin calcio. Aquí se muestran las curvas del diámetro arterial alcanzado en cada paso de presión y el gráfico de barras del tono miógeno alcanzado en cada paso de presión. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar el comportamiento miógeno de arterias resistentes pequeñas.

Tras aplicar esta técnica, se pueden realizar procedimientos adicionales como la disrupción endotelial y la permeación arterial. Ambos procedimientos pueden responder preguntas adicionales sobre el papel del endotelio y del calcio en la regulación del tono vascular de las arterias de pequeña resistencia.