Name: Nanopartículas de PLGA formadas por emulsión simple o doble con vitamina E-TPGS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende a formar nanopartículas de PLGA con tamaño ajustable mediante emulsión simple o doble usando vitamina E-TPGS como emulsificante. Este método permite controlar el diámetro de 220 nm a 1,98 µm para aplicaciones de liberación de fármacos.

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Los autores no tienen agradecimientos.

1. Preparación de nanopartículas
Todos los pasos que involucran solvente o polímero disuelto/emulsionado deben realizarse en una campana de gases químicos.
<ol>
	<li>Pesar 100 mg (+/- 5 mg) de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) y colocar en un tubo de ensayo de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Transfiera 1 ml de disolvente (acetato de etilo (EtAc) o diclorometano (DCM)) a la muestra con una pipeta serológica de vidrio.</li>
	<li>Cubra la parte superior del tubo con un pequeño trozo de papel de aluminio y coloque el papel de aluminio de forma segura, asegurándose de envolver el Parafilm firmemente en el borde superior del vial, así como en el borde inferior del papel de aluminio.</li>
	<li>Marque el nivel del solvente en el exterior del tubo de ensayo. Deje que el polímero se disuelva durante la noche, agregando solvente adicional al día siguiente si se produce evaporación. 
	Nota: El polímero también se puede disolver el día de la preparación de la nanopartícula, si es necesario. Siga los pasos 1.1-1.3, luego vórtice en alto hasta que todo el polímero se disuelva por completo (~ 10 min).</li>
	<li>Prepare una zona de trabajo en la campana extractora con los siguientes equipos/materiales junto al ultrasonido: un vórtice, dos pipetas Pasteur pequeñas de vidrio con bombillas de goma y una placa de agitación magnética. Coloque un vaso grande lleno de agua helada en un soporte debajo del ultrasonido.</li>
	<li>Añadir 45 ml de Vitamina E-TPGS al 0,3% p/v en un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml con barra de agitación magnética y ajustar la velocidad de agitación a 360 rpm.</li>
	<li>Añadir 2 ml de Vitamina E-TPGS al 0,3% p/v a un tubo de ensayo de vidrio de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Agregar medicamento: 
	Para agentes hidrofóbicos: agregue encapsulante directamente a la solución polimérica (teniendo cuidado de evitar las paredes del tubo de ensayo) y vórtice el tubo hasta que el encapsulante se disperse homogéne><amente.
	Para agentes hidrófilos: emulsionar el encapsulante con la solución polimérica antes de continuar. Agregue hasta 50 μl de fármaco en agua o tampón a la superficie de la solución polimérica. Ultrasonidos breves para emulsionar el fármaco con el polímero (normalmente 10 segundos, o según sea necesario para conseguir una solución homogénea y opaca). Este paso de sonicación debe realizarse sobre hielo.</li>
	<li>Coloque el polímero/encapsulante de tubo abierto cerca del vórtice. Mientras sostiene el tubo de ensayo que contiene vitamina E-TPGS verticalmente y en un vórtice alto, use una pipeta Pasteur de vidrio para agregar la solución de polímero/encapsulante gota a gota. Tenga cuidado de evitar los lados del tubo y deje caer la solución de polímero directamente sobre la superficie del emulsionante de vórtice. Después de que se haya agregado todo 1 ml de solución polimérica a la vitamina E-TPGS, continúe agitando la solución en vórtice (ahora una emulsión) durante 15 segundos adicionales.</li>
	<li>Transfiera inmediatamente el polímero emulsionado al ultrasonido. Mantenga el tubo de ensayo sumergido en agua helada y sonique la emulsión en tres ráfagas de 10 segundos (40% de amplitud para un sonicador de 700 W, tamaño de la punta de la sonda de 1/8 de pulgada). Mueva la emulsión hacia arriba y hacia abajo de la sonda para garantizar una sonicación uniforme, teniendo cuidado de evitar tocar la sonda con los lados o el fondo del tubo de ensayo. Haga una pausa entre cada sonicación de diez segundos para permitir que la solución se enfríe antes de continuar.</li>
	<li>Añada 1-2 ml de vitamina E-TPGS al 0,3% de la solución de agitación a la emulsión con una pipeta Pasteur de vidrio, que diluye el polímero emulsionado para que se vierta más fácilmente. Vacíe la emulsión en la solución de agitación. Repita este paso para lavar cualquier resto de solución del tubo de ensayo en la solución de agitación.</li>
	<li>Deje que las nanopartículas se endurezcan mientras revuelve durante tres horas. Si el encapsulante es sensible a la luz, el vaso de precipitados puede envolverse en papel de aluminio, dejando la parte superior abierta para facilitar la evaporación del disolvente.</li>
</ol>
2. Colección de nanopartículas
<ol>
	<li>Divida las nanopartículas endurecidas en dos tubos de centrífuga Oak Ridge (volumen nominal de 30 ml) y equilibre hasta 0,1 g.</li>
	<li>Centrifugar nanopartículas en un rotor de ángulo fijo durante 15 minutos a 17.000 x g. Los tiempos de centrifugación más largos darán como resultado la recolección de una mayor fracción de nanopartículas más pequeñas.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la bolita de nanopartículas (se puede verter o pipetear agua). Añadir 15 ml de diH2O y utilizar un sonicador y/o un vortexer en baño de agua para resuspender completamente las nanopartículas.</li>
	<li>Combine el contenido de los dos tubos de centrífuga en uno y repita los pasos 2.1-2.3 2 veces más, para un total de tres lavados en 30 ml de diH2O cada vez. El volumen de líquido de la última resuspensión de pellets debe ser de 4-5 ml. 
	En este punto se puede añadir una relación en peso de trehalosa:polímero de 1:2 como crioprotector (congelar una pequeña alícuota de nanopartículas sin trehalosa para la obtención de imágenes SEM). Los cristales de hielo que se forman durante el proceso de congelación pueden dañar la superficie de la partícula e inducir la agregación, y se ha demostrado que la inclusión de trehalosa mejora la resuspensión uniforme y completa de las nanopartículas de PLGA13.</li>
	<li>Transfiera las nanopartículas a un tubo de centrífuga prepesado de 5 ml y congele a -80 °C durante un mínimo de 30 minutos.</li>
	<li>Muévase rápidamente para no dejar que el contenido congelado se derrita, destape el tubo y cubra la parte superior asegurando el tejido de laboratorio a través de la parte superior con una banda elástica. ** Si se produce algún derretimiento, vuelva a congelar antes de colocar en el liofilizador.</li>
	<li>Liofilizar 72 horas para un volumen de 5 ml. Almacene las partículas liofilizadas en un tubo envuelto en Parafilm a -80 °C.</li>
</ol>
3. Dimensionamiento y morfología de la superficie
Microscopía electrónica de barrido
<ol>
	<li>Las muestras para SEM deben prepararse el día de la toma de imágenes. Coloque una tira de cinta de carbón de doble cara en un trozo de SEM. Se puede usar un marcador permanente para etiquetar la parte metálica del talón para referencia posterior.</li>
	<li>Utilice una espátula de metal para recoger una pequeña cantidad de nanopartículas liofilizadas y extiéndalas suavemente por la superficie de la cinta. Cepille la superficie del trozo con un pañuelo de laboratorio o use aire comprimido para eliminar las nanopartículas sueltas.</li>
	<li>Cubra la muestra con paladio de oro durante 30-120 segundos. Un tiempo de pulverización catódica más largo producirá una superficie más lisa para la obtención de imágenes, aunque esto puede resultar en la pérdida de detalles finos de la superficie.</li>
	<li>Los parámetros típicos para visualizar partículas son una distancia de trabajo de 5-15 mm, una intensidad del haz de 5-12 kV y un tamaño de punto de 1-3. Las intensidades de haz más altas pueden resultar en un calentamiento regional de la muestra, lo que alterará la morfología de la superficie de las partículas. Las micropartículas se observan con un aumento de 100X y las nanopartículas se distinguen con un aumento de 3.000X.</li>
	<li>La muestra ideal consistirá en una capa uniforme de partículas a lo largo de la superficie plana del talón. Ocasionalmente, las estructuras secundarias (incluidas escamas o esferas) pueden resultar de la liofilización. Enfocarse en el borde de una escamas, donde la escama se encuentra con la cinta, o en la parte superior de una esfera ayudará a localizar partículas que se pueden visualizar fácilmente con SEM. Recoja al menos tres imágenes por lote para obtener una muestra representativa del tamaño y la morfología de las partículas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las partículas de PLGA se preparan comúnmente mediante emulsión simple o doble, un método que brinda la capacidad de personalizar las características de las partículas, como el tamaño, el encapsulante y las propiedades de la superficie7. Estas propiedades y otras dependen de muchas variables, incluido el tipo de solvente, las proporciones de alimentación, el método de emulsificación y el tipo de emulsionante. Sin embargo, en nuestra experiencia, es posible que un solo experimentador produzca partículas con propiedades consistentes. Usando el mismo protocolo, un experimentador bien entrenado produjo siete lotes separados de nanopartículas con los siguientes diámetros medios: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 y 364 nm±110. El promedio de los lotes del experimentador bien entrenado produce un diámetro medio de 340 nm±25 y una desviación estándar media dentro del lote de 110 nm±8. Un segundo experimentador, entrenado por el primero, utilizó el mismo protocolo para producir nanopartículas con un diámetro promedio de 328 nm±138. Sin embargo, un tercer experimentador, que había estado fabricando nanopartículas de forma independiente durante varios meses, siguió el mismo protocolo para producir nanopartículas con un diámetro promedio de 220 nm±70. Por lo tanto, es posible hacer partículas con un rango esperado de diámetros, pero esto depende de la replicación exacta de una técnica experimental sutil. La agrupación de lotes puede permitir la producción de grandes cantidades de nanopartículas con propiedades áridas idénticas. Por ejemplo, cuando modificamos la superficie de las nanopartículas para un estudio in vitro o in vivo , se preparan, lavan, recolectan, mezclan en un solo tubo y luego se dividen múltiples lotes de 200 mg (hasta 6) para la modificación de la superficie. Esto asegura que el tamaño de las nanopartículas, la carga del fármaco, la carga y la fracción de los sitios de superficie disponibles para la modificación sean comparables entre dos grupos de tratamiento. En otro ejemplo, si la variable de interés es la eficacia del fármaco con diferentes agentes que se cargan en diferentes lotes de nanopartículas, es importante medir y controlar la variabilidad en la carga del fármaco. Es fundamental que se midan las propiedades de las partículas para cada lote de partículas producidas, y que se diseñen y repliquen experimentos para controlar la variabilidad de un lote a otro.
La emulsión completa de las fases orgánica y acuosa es fundamental para formar partículas pequeñas. El poli (alcohol vinílico) (PVA) es quizás el emulsionante más utilizado. Nosotros y otros hemos utilizado una variedad de agentes emulsionantes y estabilizadores, incluida la vitamina E-TPGS9, PVA14, spans15 y poloxámeros16 (para una discusión exhaustiva de la amplia gama de agentes utilizados para la producción de partículas de PLGA, consulte la revisión de Wischke et al.17). El polímero correctamente emulsionado aparecerá como una solución homogénea, de color blanco lechoso / opaco. Una emulsión pobre (o "rota") mostrará heterogeneidad o granularidad macroscópica, e incluso puede separarse en dos capas visualmente distintas en el tubo. Esto generalmente indica una falla en la formación de nanopartículas. La emulsión puede romperse después del paso 1.9 si no se transfiere inmediatamente al ultrasonido. Si esto ocurre, vuelva a agitar hasta que sea homogéneo e inmediatamente proceda al sonicador. La separación no debe producirse después de la etapa de sonicación (1.10). Una vez que las partículas se han dispersado en un volumen acuoso mayor (paso 1.11), la solución debe ser uniformemente opaca a ligeramente translúcida. La calidad translúcida aumentará a medida que disminuya el tamaño de las partículas, y se puede observar un tono azul para nanopartículas muy pequeñas. Es posible que este tono no se observe si las partículas encapsulan un medicamento. Si la emulsión no se dispersa uniformemente en el gran volumen acuoso o parece granular, el experimento no debe continuar. Es normal observar alguna variación en la apariencia del pellet de partículas, así como en su cohesión. Algunos gránulos pueden resuspenderse tras un vórtice leve, mientras que otros pueden requerir varios minutos de sonicación al baño de agua. La resuspensión no debe durar más de 5 minutos. Las partículas liofilizadas pueden tomar una variedad de texturas, desde el algodón hasta el flujo libre.
Una de las muchas ventajas del PLGA como material de nanopartículas es la capacidad de optimizar el proceso de fabricación para crear el tamaño de partícula deseado para la aplicación prevista. Las nanopartículas más grandes encapsularán una fracción más alta de fármaco hidrofóbico (en relación con el peso del polímero) que las nanopartículas pequeñas, sin embargo, la cinética de liberación del fármaco también puede verse afectada18-20. El tamaño de las nanopartículas tiene un efecto directo sobre los mecanismos de internalización de partículas por parte de las células, así como su distribución en el tejido, lo que puede resultar en diferencias dramáticas en la efectividad de la administración. Por ejemplo, el sistema de fagocitos mononucleares marcará y eliminará agentes en circulación sistémica que sean mayores de 1 μm. Las nanopartículas pequeñas pueden ser de interés para la infusión directa en el cerebro, donde las nanopartículas más grandes quedarían atrapadas en la matriz extracelular apretada; La administración de nanopartículas pequeñas también podría facilitar la orientación pasiva de los tumores a través del efecto de permeación y retención mejorado. La eficacia de la encapsulación del fármaco varía ampliamente, dependiendo de las propiedades del fármaco específico, el tamaño de la partícula y el emulsionante (es decir, su solubilidad en agua frente a disolvente). La emulsión simple frente a la doble también afectará la carga del fármaco y el tamaño de las nanopartículas. La encapsulación de agentes hidrófobos a través de una sola emulsión puede ayudar en la producción de nanopartículas ultrapequeñas, en comparación con el método de doble emulsión. Dirigimos al lector a otros recursos para una amplia discusión de este tema23-28. Por último, existen métodos alternativos de emulsificación, incluida la homogeneización de alta velocidad, y estos otros enfoques pueden proporcionar ventajas para tipos específicos de medicamentos o aplicaciones de administración de medicamentos29.
El método de emulsión única presenta una oportunidad para la variación de una amplia gama de variables de formulación, cada una de las cuales es capaz de alterar las propiedades de las nanopartículas. Por ejemplo, el uso de diclorometano (DCM) como disolvente generalmente producirá nanopartículas más grandes con una distribución de tamaño más amplia. Dado que el acetato de etilo (EtAc) es miscible en agua, la tensión superficial de la gota de polímero en la emulsión primaria disminuye, produciendo nanopartículas más pequeñas. El mismo volumen de EtAc puede sustituirse por DCM. Se pueden usar solventes alternativos o mezclas de solventes para optimizar la encapsulación del fármaco y las propiedades de las partículas. Otros parámetros de formulación también son capaces de alterar el tamaño de las partículas: por ejemplo, el aumento del volumen de disolvente, la relación disolvente:polímero, la intensidad de la sonicación o la velocidad/duración de la centrifugación darán lugar a una disminución del tamaño de las partículas recogidas. Es posible dimensionar partículas fraccionadas realizando centrifugación secuencial (por ejemplo, una centrifugación rápida y de baja velocidad para eliminar primero las partículas más grandes, seguida de un centrifugado más largo para recoger partículas ultrapequeñas) o filtrando.
Aquí, describimos los parámetros de formulación que permiten la preparación de partículas de PLGA con diámetros promedio que van desde 220 nm a 1,98 μm. Estos métodos para producir partículas compuestas de PLGA se pueden utilizar para optimizar el diseño de partículas (tamaño, encapsulante y propiedades de la superficie) para futuras aplicaciones de administración de fármacos in vitro o in vivo.

Los polímeros se han convertido en vehículos de administración de fármacos cada vez más populares en las últimas décadas para aplicaciones que van desde la terapia dirigida a tumores1 hasta la modulación del sistema inmunitario2. Los fármacos encapsulados o conjugados con polímeros suelen ser más eficaces que sus homólogos administrados libremente, ya que los fármacos asociados a polímeros están protegidos de la degradación. Esta protección se traduce en una vida media biológica más larga y una eficacia potencialmente mejorada con efectos secundarios sistémicos reducidos3-5.
Ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) exhibe muchas de las propiedades ideales de un sistema de administración a nanoescala, proporcionando una liberación a largo plazo del agente encapsulado y degradándose en los productos biocompatibles del ácido láctico y glicólico . Las moléculas pequeñas, las proteínas y los ácidos nucleicos que están encapsulados en PLGA han demostrado una mayor actividad en una variedad de aplicaciones de enfermedades8. Es importante destacar que la plataforma de material facilita la personalización sencilla de características como el tamaño, la carga y la visualización de la superficie de los ligandos para dirigir las partículas a tejidos específicos o con fines de obtención de imágenes. Debido a que el PLGA ya se utiliza en humanos en forma de suturas biodegradables (por ejemplo, Purasorb, Purac Biomaterials y Vicryl, Ethicon Inc.), el potencial de traducción clínica es alto.
La emulsión aceite-agua (simple) o agua-aceite-agua (doble) es un método mediante el cual se puede utilizar el PLGA para encapsular fármacos hidrófobos e hidrofílicos en forma micro o nano escala. Brevemente, el PLGA se disuelve en una fase orgánica (aceite) que se emulsiona con un tensioactivo o estabilizador (agua). Los fármacos hidrofóbicos se añaden directamente a la fase oleosa, mientras que los fármacos hidrofílicos (agua) pueden emulsionarse primero con la solución polimérica antes de la formación de partículas. Las ráfagas de sonicación de alta intensidad facilitan la formación de pequeñas gotas de polímero. La emulsión resultante se añade a una fase acuosa más grande y se agita durante varias horas, lo que permite que el disolvente se evapore. Las nanopartículas endurecidas se recogen y se lavan por centrifugación (Figura 1).
Aquí, describimos una técnica para hacer nanopartículas de PLGA utilizando emulsión simple y doble, con acetato de etilo (EtAc) como solvente y vitamina E-D-α-Tocoferol succinato de polietilenglicol (TPGS) como agente emulsionante. El uso de vitamina E-TPGS ofrece varias ventajas posibles sobre otros tipos de agentes estabilizadores (por ejemplo, poli(alcohol vinílico), PVA), incluida la mejora de la emulsificación y la eficiencia de encapsulación. Otros grupos han reportado ventajas de la vitamina E-TPGS, incluida la inhibición de P-gp, una proteína de eflujo transmembrana, que comúnmente se sobreexpresa en las células cancerosas y se sabe que contribuye a la resistencia a los medicamentos al transportar los medicamentos fuera de las células objetivo. Además, demostramos cómo caracterizar y dimensionar las partículas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y proporcionamos más orientación sobre la modificación del tamaño mediante la alteración del protocolo.

<table><tbody><tr><td>Ácido poli(láctico-co-glicólico) &amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Viscosidad inherente: 0,55-0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Acetato de etilo (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de metileno (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPGS de vitamina E</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico</td><td></td><td></td><td>Hidrolizado al 87-89 %, 30.000-70.000 Da</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseccionador sónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Modelo 705</td><td>700 W (ultrasonido)</td></tr><tr><td>Punta del ultrasonido</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitador multiposición</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartículas de plga formadas por emulsión simple o doble con vitamina e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

El ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) es un miembro biocompatible de la familia de polímeros biodegradables de poliéster alifático. El PLGA ha sido durante mucho tiempo una opción popular para las aplicaciones de administración de fármacos, especialmente porque ya está aprobado por la FDA para su uso en humanos en forma de suturas reabsorbibles. Los fármacos hidrófobos e hidrofílicos se encapsulan en partículas de PLGA mediante emulsión simple o doble. Brevemente, el fármaco se disuelve con polímero o se emulsiona con polímero en una fase orgánica que luego se emulsiona con la fase acuosa. Una vez que el solvente se ha evaporado, las partículas se lavan y se recogen mediante centrifugación para la liofilización y el almacenamiento a largo plazo. El PLGA se degrada lentamente a través de la hidrólisis en ambientes acuosos, y los agentes encapsulados se liberan durante un período de semanas a meses. Aunque el PLGA es un material que posee muchas ventajas para la administración de fármacos, la formación reproducible de nanopartículas puede ser un desafío; Se introduce una variabilidad considerable mediante el uso de diferentes equipos, lotes de reactivos y un método preciso de emulsificación. En este trabajo se describe con gran detalle la formación y caracterización de micropartículas y nanopartículas formadas por emulsión simple o doble utilizando el agente emulsionante vitamina E-TPGS. La morfología y el tamaño de las partículas se determinan con microscopía electrónica de barrido (SEM). Proporcionamos imágenes SEM representativas para nanopartículas producidas con diferentes concentraciones de emulsionantes, así como ejemplos de artefactos de imagen y emulsificaciones fallidas. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar emulsionantes alternativos (por ejemplo, poli(alcohol vinílico), PVA) o disolventes (por ejemplo, diclorometano, DCM).

En las Figuras 2a y 2b se muestran imágenes representativas de micro y nanopartículas de PLGA preparadas mediante este protocolo. Las partículas aparecerán como esferas individuales y no fusionadas, con una morfología de superficie lisa y una amplia gama de tamaños distribuidos a lo largo de la muestra.
Para determinar el diámetro promedio de cada lote, se realizan mediciones directamente a partir de las imágenes de MEB utilizando la función «medir» en ImageJ. Se deben tomar al menos 150 mediciones del diámetro de partículas seleccionadas aleatoriamente del campo de visión para obtener una distribución de tamaños representativa. El tamaño promedio de un lote de partículas depende de los parámetros de formulación. Por ejemplo, en Figura 2a, se formaron micropartículas (diámetro promedio de 730 nm±370) con 1 ml de disolvente por 100 mg de PLGA, utilizando 0,05 % de Vitamina E-TPGS en la fase emulsionante, mientras que en Figura 2b, se formaron nanopartículas (diámetro promedio de 340 nm±70) con 4 ml de disolvente por 200 mg de PLGA, encapsulando el fármaco hidrófobo camptotecina y utilizando 0,3 % de Vitamina E-TPGS en la fase emulsionante (los parámetros completos de formulación se describen en el pie de figura). En términos generales, una mayor concentración de emulsionante producirá partículas más pequeñas, pudiéndose obtener diámetros promedio entre 220 y 2.000 nm al variar la concentración del emulsionante entre 0,3 y 0,01 % (Figura 3).
Nuestros rendimientos varían entre 74 y 98 % (22 lotes de nanopartículas con distintos disolventes, emulsionantes y condiciones de emulsificación, preparados por un único experimentador). Pueden observarse mejores rendimientos en lotes más grandes (&gt;150 nm), ya que las nanopartículas pequeñas se pierden fácilmente durante la centrifugación y el lavado, especialmente cuando el sobrenadante se vierte fuera del precipitado. Una pipetación cuidadosa del líquido puede ayudar a evitar este problema. Velocidades más altas y/o tiempos de centrifugación más largos también pueden mejorar el rendimiento, tanto al mejorar la recolección de la fracción ultrapequeña de nanopartículas como al compactar mejor el precipitado, de modo que se pierda menos en el paso de lavado. El protocolo descrito aquí se centra en la producción de partículas utilizando TPGS como agente emulsionante y EtAc como disolvente; sin embargo, son posibles disolventes y/o agentes emulsionantes alternativos. En general, observamos que el EtAc produce nanopartículas más pequeñas y de tamaño más uniforme que el DCM (por ejemplo, diámetros de 540 nm±190 frente a 2.160 nm±1.530 para EtAc y DCM, respectivamente, 100 mg/ml de PLGA en disolvente, emulsionado en 2 ml de TPGS al 0,1 %), presumiblemente porque el EtAc es miscible en agua, mientras que el DCM no lo es. El PVA es un agente emulsionante ampliamente utilizado por nuestro grupo y otros. Hemos observado variabilidad en las nanopartículas preparadas a partir de diferentes lotes de PVA disponible comercialmente. Por lo tanto, es recomendable utilizar, siempre que sea posible, el mismo lote de PVA para mejorar la reproducibilidad. En nuestra experiencia, el PVA es un emulsionante más eficaz a concentraciones mucho más altas que el TPGS (por ejemplo, diámetro de 140 nm±48, 100 mg/ml de PLGA en DCM, emulsionado en 2 ml de PVA al 5 %).
Caracterizar nanopartículas mediante SEM puede ser complicado debido a las diferencias en el equipo y el proceso de obtención de imágenes. Por lo tanto, es importante distinguir las características morfológicas que indican problemas en la formación de partículas frente a los artefactos que se introducen involuntariamente durante la obtención de imágenes. A veces se observan en las imágenes de SEM fenómenos de fusión (Figuras 4a y 4b), abolladuras (Figura 4c) o grietas (Figura 4f) en las partículas. Estos artefactos a veces indican partículas mal formadas (por ejemplo, en la Figura 4a, la concentración del emulsionante era demasiado alta para formar partículas discretas), pero también podrían deberse a artefactos introducidos por el método de caracterización (por ejemplo, en la Figura 4b, la muestra se calentó durante el recubrimiento por pulverización, y en la Figura 4c, el calentamiento local provocado por el haz del SEM alteró la morfología superficial de las partículas durante la obtención de imágenes). Para evitar artefactos en las imágenes, debe minimizarse el tiempo de recubrimiento por pulverización y mantenerse baja la potencia del haz. Se observan morfologías más suaves con tiempos de pulverización más largos; sin embargo, esto puede inducir la fusión de partículas. Tiempos de pulverización demasiado cortos pueden dificultar la obtención de imágenes, ya que las partículas se cargarán y se moverán durante la captura de la imagen. Capturar las imágenes rápidamente ayudará a evitar una exposición prolongada al haz y la distorsión de las imágenes (Figuras 4d y 4e). Exposiciones elevadas del haz también pueden provocar la expansión y la fisuración de la superficie de la nanopartícula (Figura 4f). Si los artefactos morfológicos no pueden minimizarse modificando los parámetros de caracterización, es posible que representen problemas reales con las propias nanopartículas. Durante el proceso de fabricación, la fusión puede deberse a un sobrecalentamiento provocado por una potencia excesiva de ultrasonido, una evaporación incompleta del disolvente, una resuspensión incompleta durante la fase de lavado o una liofilización fallida.
<img alt="Proceso de separación de aceite y agua; sonicación, evaporación, recogida; diagrama de liofilización." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Esquema de fabricación de nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Estructura de nanopartículas (SEM) y distribución de tamaños (μm, nm), gráfico de análisis comparativo." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) y distribuciones de tamaño correspondientes de micropartículas y nanopartículas de PLGA producidas mediante el método de emulsión simple. En (A), las partículas se formaron emulsionando 100 mg de PLGA disueltos en 1 ml de acetato de etilo en 2 ml de Vitamina E-TPGS al 0,05%, y se endurecieron en 45 ml de Vitamina E-TPGS al 0,01%. La distribución de tamaño correspondiente se muestra en (C). En (B), las partículas se formaron emulsionando 200 mg de PLGA y 40 mg de camptotecina disueltos en 4 ml de acetato de etilo en 4 ml de Vitamina E-TPGS al 0,3%, y se endurecieron en 90 ml de Vitamina E-TPGS al 0,3%. La distribución de tamaño correspondiente se muestra en (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor</a>.
<img alt="Análisis del tamaño de partículas; el gráfico de barras y las imágenes de MEB muestran el efecto del porcentaje de TPGS en el tamaño de las microesferas." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. El tamaño de las partículas depende de la concentración del emulsionante. Un aumento en la concentración de Vitamina E-TPGS dio lugar a nanopartículas más pequeñas. Se muestran los diámetros promedio y las imágenes correspondientes de MEB de partículas preparadas emulsionando 100 mg de PLGA disueltos en 1 ml de acetato de etilo en (A) 0,01 %, (B) 0,05 %, (C) 0,1 % o (D) 0,3 % de Vitamina E-TPGS y endurecidas en 45 ml de 0,3 % de Vitamina E-TPGS. Las barras de error representan la desviación estándar de 200 mediciones de diámetro realizadas a partir de 2 imágenes de un lote único. La barra de escala representa 5 μm (A-C) y 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.
<img alt="Micrografía de MEB que muestra la morfología de las partículas y su agregación. Análisis de la microestructura del polvo." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Artefactos de morfología superficial observados mediante MEB. En (A), se observó una fusión intensa y estructuras tipo lámina en toda la muestra. La concentración de Vitamina E-TPGS era demasiado alta (1 %) para formar partículas discretas. En (B), algunas regiones de la muestra estaban fusionadas, sin embargo, existían grandes agrupaciones de nanopartículas discretas, especialmente en las zonas donde había huecos en el recubrimiento por pulverización catódica. Consideramos que estos artefactos de fusión se deben al calentamiento durante el proceso de recubrimiento por pulverización. En (C), las partículas inicialmente parecían lisas, pero una exposición prolongada de la muestra al haz del MEB provocó hoyuelos y arrugas. (D) muestra una imagen de baja resolución obtenida con una exposición mínima de la muestra al haz del MEB; las partículas aparecen lisas y con morfología redondeada. En (E), la misma muestra se expuso durante un período más largo, y se observó una distorsión evidente de su morfología original. En (F), una exposición prolongada al haz con un alto voltaje (12 kV) provocó calentamiento y fisuración de las partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.

Describimos la producción y caracterización de nanopartículas y micropartículas compuestas de ácido poli(láctico-co-glicólico) utilizando vitamina E-TPGS como emulsionante. Variando los parámetros de la formulación, como la concentración de emulsionante, es posible producir nanopartículas con diámetros medios que oscilan entre 220 nm y 1,98 μm.

Nanopartículas de PLGA formadas por emulsión simple o doble con vitamina E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

El objetivo general de este procedimiento es formar nanopartículas poliméricas de tamaño ajustable. Esto se logra primero disolviendo el polímero en un disolvente orgánico y añadiendo el fármaco o el agente encapsulante fluorescente. El segundo paso consiste en emulsionar el polímero con una fase acuosa que contiene el agente emulsionante, y luego permitir que las partículas se endurezcan en un volumen acuoso mayor a medida que el disolvente se evapora.A continuación, las partículas se lavan, recolectan mediante centrifugación y liofilizan para su almacenamiento a largo plazo. El paso final consiste en caracterizar el tamaño de las nanopartículas y la morfología de la superficie mediante microscopía electrónica de barrido o imágenes de SEM. En última instancia, se utiliza SEM para demostrar que el tamaño de las nanopartículas puede controlarse variando la concentración del emulsionante.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de una variedad de enfermedades humanas, ya que las partículas pueden personalizarse para encapsular y liberar una amplia gama de agentes terapéuticos con acción prolongada. En el tejido diana. La demostración visual de este método es fundamental.Los pasos de emulsificación son difíciles de aprender porque aspectos sutiles de cómo se forma la emulsión pueden tener un impacto significativo en las propiedades de las partículas. Para comenzar la preparación de nanopartículas, coloque aproximadamente 100 miligramos de ácido poliláctico co glicólico, también conocido como PLGA, en un tubo de ensayo de 13 por 100 milímetros. Luego, utilizando una pipeta serológica de vidrio, transfiera un mililitro de acetato de etilo a la muestra, cubra la parte superior del tubo con papel de aluminio y luego selle firmemente el papel con parafilm.Asegúrese de envolver firmemente el parafilm a lo largo del borde superior del vial y el borde inferior del papel de aluminio para evitar la evaporación del disolvente. Marque el nivel del disolvente en el tubo de ensayo y deje que el polímero se disuelva durante la noche. Al día siguiente, agregue disolvente adicional si se produce alguna evaporación.Prepare el siguiente equipo y materiales en una campana extractora cerca del ultrasonido. Vortexee dos pipetas pastorales de vidrio pequeñas con bulbos de goma y una placa agitadora magnética. Además, coloque un vaso de precipitados grande lleno de agua con hielo sobre un soporte debajo del ultrasonido.A continuación, agregue 45 mililitros de TPGS de vitamina E al 0,3% peso por volumen a un vaso de precipitados de vidrio de 200 mililitros y luego ajuste la velocidad de agitación a 360 RPM. Luego, agregue dos mililitros del TPGS de vitamina E al 0,3% peso por volumen a un tubo de ensayo de vidrio de 13 por 100 milímetros. Con el fin de mezclar agentes hidrófobos, agregue el encapsulante directamente a la solución polimérica, teniendo cuidado de evitar las paredes del tubo de ensayo y vortexee el tubo hasta que el encapsulante se disperse homogéneamente.Para agentes hidrófilos, emulsifique el encapsulante con la solución polimérica. Añada hasta 50 microlitros de fármaco en tampón sobre la superficie de la solución polimérica. Somete la mezcla a ultrasonidos sobre hielo durante aproximadamente 10 segundos o hasta que la solución sea opaca y homogénea.A continuación, agite en vórtex el tubo de ensayo que contiene la vitamina E-T-P-G-S a velocidad alta mientras sostiene el tubo de ensayo en posición vertical. Mantenga la pipeta de vidrio a uno o dos centímetros por encima de la parte superior del tubo en vórtex y agregue lentamente la solución polimérica gota a gota sobre la superficie del vórtex. Tenga cuidado de que la pipeta no toque las paredes del tubo después de haber añadido toda la solución polimérica.Continúe agitando la solución en vórtex. Ahora forme una emulsión durante 15 segundos. Transfiera inmediatamente el polímero emulsionado al ultrasonido.Mantenga el tubo de ensayo sumergido en agua con hielo y someta la emulsión a sonicación en tres pulsos de diez segundos cada uno. Mueva la emulsión hacia arriba y hacia abajo del cabezal para asegurar una sonicación uniforme y evite tocar las paredes o el fondo del tubo de ensayo con el cabezal. Haga una pausa de cinco a diez segundos entre cada sonicación de diez segundos para permitir que la solución se enfríe antes de continuar.Luego, agregue uno a dos mililitros de la solución agitada de vitamina E-T-P-G-S al 0,3 % a la emulsión. Esto diluirá el polímero emulsionado, facilitando su vertido; vierta la emulsión en la solución agitada. Lave cualquier solución restante del tubo de ensayo introduciéndola en la solución agitada.Deje endurecer las nanopartículas agitando durante tres horas. Si el encapsulante es sensible a la luz, envuelva el vaso de precipitados con papel de aluminio y deje la parte superior abierta para facilitar la evaporación del disolvente. Para recoger las nanopartículas, comience dividiendo la mezcla en dos tubos cónicos de centrífuga de Oak Ridge con un volumen nominal de 30 mililitros y equilíbrelas entre sí dentro de 0,1 gramos. Luego, centrifugue las nanopartículas en un rotor de ángulo fijo durante 15 minutos a 17.000.RC f. Tiempos más largos de centrifugación darán como resultado la recolección de una fracción mayor de nanopartículas más pequeñas. Deseche el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet de nanopartículas.Agregue cinco mililitros de agua destilada y utilice un baño de agua, un agitador y un vórtex para suspender completamente las nanopartículas. Combine el contenido de los dos tubos centrífugos en uno solo y agregue 20 mililitros de agua destilada para obtener un volumen total de 30 mililitros. Luego repita los pasos de centrifugación y lavado otras dos veces, para un total de tres lavados.El volumen de fluido de la última suspensión del pellet debe ser de cuatro a cinco mililitros. Congele una pequeña alícuota de nanopartículas libres de telos para su imagenología mediante SEM, dejando el resto. Añada una relación ponderal de uno a dos de TLO respecto al polímero como crioprotector para lograr una suspensión completa y uniforme de las nanopartículas de PLGA.Esto evitará la formación de cristales de hielo, los cuales podrían dañar la superficie de las partículas e inducir la agregación. Transfiera las nanopartículas a un tubo de centrífuga de cinco mililitros previamente pesado y luego congele a menos 80 grados Celsius durante al menos 30 minutos. A continuación, retire la tapa del tubo y cubra la abertura asegurando un trozo de papel de laboratorio sobre la parte superior con una banda elástica.Mueva rápidamente para que el contenido no se derrita si ocurre alguna fusión. Vuelva a congelar antes de colocar en el liofilizador, luego liofilice la muestra de cinco mililitros durante 72 horas. A continuación, reemplace la tapa y envuelva el tubo para almacenar las partículas liofilizadas a menos 80 grados Celsius.El día de la obtención de imágenes, coloque una tira de cinta de carbono doble cara sobre un soporte para SEM. Etiquete la parte metálica del soporte con un marcador permanente para referencia posterior. Utilice una espátula metálica para recoger una pequeña cantidad de nanopartículas liofilizadas y extiéndalas suavemente sobre la superficie de la cinta.Cepille la superficie del soporte con un tejido de laboratorio o utilice aire comprimido para eliminar las nanopartículas sueltas. Visualice las partículas utilizando una distancia de trabajo de cinco a 15 milímetros del haz, una intensidad de cinco a 12 kilovoltios y un tamaño de punto de uno a tres; intensidades de haz más altas pueden provocar un calentamiento regional de la muestra, lo que alterará la morfología superficial de las partículas. Las micropartículas se observan con un aumento de 100 veces y las nanopartículas serán distinguibles a 3000 veces.Aumente el enfoque en la parte superior de una esfera para localizar partículas que puedan visualizarse fácilmente con MEB; recolecte al menos tres imágenes por lote para obtener una muestra representativa del tamaño y la morfología de las partículas. Mediante este método, las partículas pueden formarse mediante una sola emulsión, apareciendo como esferas individuales no fusionadas con una morfología de superficie lisa y una amplia distribución de tamaños a lo largo de la muestra. Las micropartículas mostradas aquí tienen un diámetro promedio de 730 nanómetros.Se muestran aquí nanopartículas creadas mediante una sola emulsión que encapsulan el fármaco hidrófobo campin. Estas partículas resultaron aún más pequeñas, con un diámetro promedio de 340 nanómetros. Concentraciones más altas de emulsionante produjeron partículas más pequeñas, con diámetros promedio que disminuyeron de 2000 a 200 nanómetros.A medida que la concentración del emulsionante aumentó de 0,01 a 0,3 %, como muestran las imágenes de MEB aquí presentadas. Sin embargo, cuando la concentración de vitamina E-T-P-G-S fue demasiado alta, no se formaron partículas discretas; al usar 1 % de vitamina E-T-P-G-S, se observó una fusión intensa y estructuras tipo lámina presentes en toda la estructura. Verdadero. Una vez que se ha aprendido cómo fabricar nanopartículas de PLG mediante emulsificación, se pueden realizar otros métodos, como la modificación de superficie, para diseñar nanopartículas que interactúen con tipos celulares específicos o regiones del cuerpo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar partículas con tamaño reproducible y ajustable mediante emulsificación.

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