Nanopartículas de PLGA formadas por emulsión simple o doble con vitamina E-TPGS

El objetivo general de este procedimiento es formar nanopartículas poliméricas de tamaño ajustable. Esto se logra primero disolviendo el polímero en un disolvente orgánico y añadiendo el fármaco o el agente encapsulante fluorescente. El segundo paso consiste en emulsionar el polímero con una fase acuosa que contiene el agente emulsionante, y luego permitir que las partículas se endurezcan en un volumen acuoso mayor a medida que el disolvente se evapora.

A continuación, las partículas se lavan, recolectan mediante centrifugación y liofilizan para su almacenamiento a largo plazo. El paso final consiste en caracterizar el tamaño de las nanopartículas y la morfología de la superficie mediante microscopía electrónica de barrido o imágenes de SEM. En última instancia, se utiliza SEM para demostrar que el tamaño de las nanopartículas puede controlarse variando la concentración del emulsionante.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de una variedad de enfermedades humanas, ya que las partículas pueden personalizarse para encapsular y liberar una amplia gama de agentes terapéuticos con acción prolongada. En el tejido diana. La demostración visual de este método es fundamental.

Los pasos de emulsificación son difíciles de aprender porque aspectos sutiles de cómo se forma la emulsión pueden tener un impacto significativo en las propiedades de las partículas. Para comenzar la preparación de nanopartículas, coloque aproximadamente 100 miligramos de ácido poliláctico co glicólico, también conocido como PLGA, en un tubo de ensayo de 13 por 100 milímetros. Luego, utilizando una pipeta serológica de vidrio, transfiera un mililitro de acetato de etilo a la muestra, cubra la parte superior del tubo con papel de aluminio y luego selle firmemente el papel con parafilm.

Asegúrese de envolver firmemente el parafilm a lo largo del borde superior del vial y el borde inferior del papel de aluminio para evitar la evaporación del disolvente. Marque el nivel del disolvente en el tubo de ensayo y deje que el polímero se disuelva durante la noche. Al día siguiente, agregue disolvente adicional si se produce alguna evaporación.

Prepare el siguiente equipo y materiales en una campana extractora cerca del ultrasonido. Vortexee dos pipetas pastorales de vidrio pequeñas con bulbos de goma y una placa agitadora magnética. Además, coloque un vaso de precipitados grande lleno de agua con hielo sobre un soporte debajo del ultrasonido.

A continuación, agregue 45 mililitros de TPGS de vitamina E al 0,3% peso por volumen a un vaso de precipitados de vidrio de 200 mililitros y luego ajuste la velocidad de agitación a 360 RPM. Luego, agregue dos mililitros del TPGS de vitamina E al 0,3% peso por volumen a un tubo de ensayo de vidrio de 13 por 100 milímetros. Con el fin de mezclar agentes hidrófobos, agregue el encapsulante directamente a la solución polimérica, teniendo cuidado de evitar las paredes del tubo de ensayo y vortexee el tubo hasta que el encapsulante se disperse homogéneamente.

Para agentes hidrófilos, emulsifique el encapsulante con la solución polimérica. Añada hasta 50 microlitros de fármaco en tampón sobre la superficie de la solución polimérica. Somete la mezcla a ultrasonidos sobre hielo durante aproximadamente 10 segundos o hasta que la solución sea opaca y homogénea.

A continuación, agite en vórtex el tubo de ensayo que contiene la vitamina E-T-P-G-S a velocidad alta mientras sostiene el tubo de ensayo en posición vertical. Mantenga la pipeta de vidrio a uno o dos centímetros por encima de la parte superior del tubo en vórtex y agregue lentamente la solución polimérica gota a gota sobre la superficie del vórtex. Tenga cuidado de que la pipeta no toque las paredes del tubo después de haber añadido toda la solución polimérica.

Continúe agitando la solución en vórtex. Ahora forme una emulsión durante 15 segundos. Transfiera inmediatamente el polímero emulsionado al ultrasonido.

Mantenga el tubo de ensayo sumergido en agua con hielo y someta la emulsión a sonicación en tres pulsos de diez segundos cada uno. Mueva la emulsión hacia arriba y hacia abajo del cabezal para asegurar una sonicación uniforme y evite tocar las paredes o el fondo del tubo de ensayo con el cabezal. Haga una pausa de cinco a diez segundos entre cada sonicación de diez segundos para permitir que la solución se enfríe antes de continuar.

Luego, agregue uno a dos mililitros de la solución agitada de vitamina E-T-P-G-S al 0,3 % a la emulsión. Esto diluirá el polímero emulsionado, facilitando su vertido; vierta la emulsión en la solución agitada. Lave cualquier solución restante del tubo de ensayo introduciéndola en la solución agitada.

Deje endurecer las nanopartículas agitando durante tres horas. Si el encapsulante es sensible a la luz, envuelva el vaso de precipitados con papel de aluminio y deje la parte superior abierta para facilitar la evaporación del disolvente. Para recoger las nanopartículas, comience dividiendo la mezcla en dos tubos cónicos de centrífuga de Oak Ridge con un volumen nominal de 30 mililitros y equilíbrelas entre sí dentro de 0,1 gramos. Luego, centrifugue las nanopartículas en un rotor de ángulo fijo durante 15 minutos a 17.000.

RC f. Tiempos más largos de centrifugación darán como resultado la recolección de una fracción mayor de nanopartículas más pequeñas. Deseche el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet de nanopartículas.

Agregue cinco mililitros de agua destilada y utilice un baño de agua, un agitador y un vórtex para suspender completamente las nanopartículas. Combine el contenido de los dos tubos centrífugos en uno solo y agregue 20 mililitros de agua destilada para obtener un volumen total de 30 mililitros. Luego repita los pasos de centrifugación y lavado otras dos veces, para un total de tres lavados.

El volumen de fluido de la última suspensión del pellet debe ser de cuatro a cinco mililitros. Congele una pequeña alícuota de nanopartículas libres de telos para su imagenología mediante SEM, dejando el resto. Añada una relación ponderal de uno a dos de TLO respecto al polímero como crioprotector para lograr una suspensión completa y uniforme de las nanopartículas de PLGA.

Esto evitará la formación de cristales de hielo, los cuales podrían dañar la superficie de las partículas e inducir la agregación. Transfiera las nanopartículas a un tubo de centrífuga de cinco mililitros previamente pesado y luego congele a menos 80 grados Celsius durante al menos 30 minutos. A continuación, retire la tapa del tubo y cubra la abertura asegurando un trozo de papel de laboratorio sobre la parte superior con una banda elástica.

Mueva rápidamente para que el contenido no se derrita si ocurre alguna fusión. Vuelva a congelar antes de colocar en el liofilizador, luego liofilice la muestra de cinco mililitros durante 72 horas. A continuación, reemplace la tapa y envuelva el tubo para almacenar las partículas liofilizadas a menos 80 grados Celsius.

El día de la obtención de imágenes, coloque una tira de cinta de carbono doble cara sobre un soporte para SEM. Etiquete la parte metálica del soporte con un marcador permanente para referencia posterior. Utilice una espátula metálica para recoger una pequeña cantidad de nanopartículas liofilizadas y extiéndalas suavemente sobre la superficie de la cinta.

Cepille la superficie del soporte con un tejido de laboratorio o utilice aire comprimido para eliminar las nanopartículas sueltas. Visualice las partículas utilizando una distancia de trabajo de cinco a 15 milímetros del haz, una intensidad de cinco a 12 kilovoltios y un tamaño de punto de uno a tres; intensidades de haz más altas pueden provocar un calentamiento regional de la muestra, lo que alterará la morfología superficial de las partículas. Las micropartículas se observan con un aumento de 100 veces y las nanopartículas serán distinguibles a 3000 veces.

Aumente el enfoque en la parte superior de una esfera para localizar partículas que puedan visualizarse fácilmente con MEB; recolecte al menos tres imágenes por lote para obtener una muestra representativa del tamaño y la morfología de las partículas. Mediante este método, las partículas pueden formarse mediante una sola emulsión, apareciendo como esferas individuales no fusionadas con una morfología de superficie lisa y una amplia distribución de tamaños a lo largo de la muestra. Las micropartículas mostradas aquí tienen un diámetro promedio de 730 nanómetros.

Se muestran aquí nanopartículas creadas mediante una sola emulsión que encapsulan el fármaco hidrófobo campin. Estas partículas resultaron aún más pequeñas, con un diámetro promedio de 340 nanómetros. Concentraciones más altas de emulsionante produjeron partículas más pequeñas, con diámetros promedio que disminuyeron de 2000 a 200 nanómetros.

A medida que la concentración del emulsionante aumentó de 0,01 a 0,3 %, como muestran las imágenes de MEB aquí presentadas. Sin embargo, cuando la concentración de vitamina E-T-P-G-S fue demasiado alta, no se formaron partículas discretas; al usar 1 % de vitamina E-T-P-G-S, se observó una fusión intensa y estructuras tipo lámina presentes en toda la estructura. Verdadero. Una vez que se ha aprendido cómo fabricar nanopartículas de PLG mediante emulsificación, se pueden realizar otros métodos, como la modificación de superficie, para diseñar nanopartículas que interactúen con tipos celulares específicos o regiones del cuerpo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar partículas con tamaño reproducible y ajustable mediante emulsificación.