Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado

El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar de manera eficiente y efectiva proteínas quiméricas que expresan la fracción Fc humana mediante el uso de una proteína, absorbentes de membrana y un flujo de trabajo optimizado. Esto se logra primero aclarando el sobrenadante del cultivo celular con un filtro de 0,22 micrones. El segundo paso consiste en armar el sistema de flujo e iniciar la perfusión del sobrenadante del cultivo celular a través del absorbente de membrana de proteína A.

A continuación, se eluye la proteína expresada de FC humana de la membrana absorbente, concentrándose el EIT resultante mediante ultrafiltración, seguido de intercambio de tampón mediante diálisis. Los pasos finales consisten en utilizar citometría de flujo e inmunotransferencia (western blot) para determinar la calidad y cantidad de la proteína concentrada. En definitiva, los absorbentes de membrana de proteína A, junto con un flujo de trabajo optimizado, muestran una reducción del tiempo de procesamiento y un posible aumento en el rendimiento proteico en comparación con la cromatografía de afinidad tradicional con columnas empaquetadas de proteína A aro speed.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la cromatografía de afinidad en columna es que el absorbedor de membrana permite obtener rendimientos potencialmente mayores de la proteína con un tiempo de procesamiento más bajo. La selección de métodos adecuados de caracterización también puede reducir el tiempo de procesamiento. Prepare el absorbedor de membrana siguiendo las instrucciones del fabricante, asegurándose de que todas las soluciones que pasen a través de él estén a temperatura ambiente y previamente filtradas mediante un filtro de 0,22 micrones. Para comenzar, llene una jeringa de 10 mililitros con solución salina tamponada con fosfato de KO o DPBS filtrada a 0,22 micrones y elimine cualquier burbuja de aire.

Asegúrese de que el aire nunca entre en el absorbedor de membrana; pase DPBS a través de él para eliminar la solución de almacenamiento y equilibrar el absorbedor de membrana inmediatamente antes de su uso. Filtre inmediatamente el sobrenadante del cultivo celular antes de perfundirlo a través del absorbedor de membrana, utilizando una unidad de filtración estéril de vacío de 0,22 micrones para cargar el absorbedor de membrana de proteína A, aspire el sobrenadante del cultivo celular en una jeringa con bloqueo de bayoneta y elimine cualquier burbuja de aire para armar los materiales y equipos. Primero, conecte la jeringa a la entrada del absorbedor de membrana.

Conecte un tubo flexible a la salida del absorbedor de membrana si lo desea. Coloque un filtro de jeringa de 0,22 micrones entre la jeringa y el absorbedor de membrana. Utilice un matraz o botella para recoger el flujo que sale del absorbedor.

Configure la bomba de jeringa a la velocidad de flujo volumétrico deseada, pero no supere la velocidad de flujo recomendada por el fabricante. Haga pasar el sobrenadante del cultivo celular a través del absorbedor de membrana recolectando el flujo de salida. Recargue la jeringa con sobrenadante según sea necesario.

Si se desea, pruebe el flujo resultante para detectar la presencia de proteína mediante citometría de flujo, inmunotransferencia o ELISA según la preferencia del laboratorio; normalmente no es necesario volver a perfundir el flujo resultante para eluir la proteína del absorbedor de membrana. En primer lugar, lave el absorbedor de membrana con 10 mililitros de DPBS para eliminar cualquier proteína no unida. Eluya la proteína del absorbedor de membrana a la velocidad de flujo deseada.

Utilizando de 10 a 15 mililitros de tampón de elución. Reciba el EIT en un tubo que contenga tampón neutralizante al 10 % del volumen de elución. Después de eluir la proteína, regenere el absorbedor de membrana según las instrucciones del fabricante.

Llene el absorbedor de membrana con etanol al 20 % en DPBS para su almacenamiento a largo plazo a cuatro grados Celsius. Deposite todo el EIT en una unidad de filtro centrífugo con un límite de exclusión de peso molecular de 10 kilodalton.

Siga las instrucciones del fabricante para la diálisis por centrifugación. El retenido. En una unidad de diálisis de pequeño volumen con un límite de peso molecular de 10 kilodalton frente al tampón elegido, puede ser necesario añadir tampón al material dializado.

Si la precipitación de proteínas es una preocupación, resuelva las proteínas purificadas y los estándares de FC en el gel de elección mediante electroforesis SDS bajo condiciones reductoras o no reductoras según se desee. Utilice un gel mini en lugar de un gel mini para minimizar el tiempo de corrida; cargue múltiples cantidades de muestra de proteína purificada, incluyendo muestras diluidas con DPBS para asegurar que las señales de las bandas de proteína purificada se encuentren dentro del rango lineal de señal de los estándares de FC. En el análisis de imágenes tras la separación en gel, transfiera las proteínas desde el gel a una membrana de fluoruro de poliolefina en un sistema de buffer discontinuo utilizando una transferencia semiseca siguiendo las instrucciones del fabricante; el tiempo de transferencia suele ser de cinco a 10 minutos.

Coloree el gel con Kumasi después de la transferencia para verificar la eficiencia de transferencia. Realice la inmunodetección con anti-FC o anti-IgG conjugado a fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante utilizando una detección de proteínas asistida por vacío. El tiempo de inmunodetección suele ser inferior a una hora.

Desarrolle el inmunotransferido utilizando el sustrato y el método de elección. Cuantifique la proteína purificada mediante análisis de imagen. Realice una regresión lineal sobre las señales de las bandas provenientes de los estándares de FC.

Si R al cuadrado es mayor que 0,90, utilice la ecuación de la recta para calcular la cantidad de proteína a partir de la señal de la banda, teniendo en cuenta la dilución de la muestra si es necesario. Dado que la cuantificación de la proteína se realiza en función de fc, ajuste el valor según las diferencias de peso molecular entre la proteína y fc. Si R al cuadrado es menor que 0,90, repita el procedimiento acelerado de inmunotransferencia.

Finalmente, valide la proteína mediante ensayos funcionales o métodos para detectar FC mediante citometría de flujo. Se utilizó inmunotransferencia o citometría de flujo EISA para comprobar la presencia de GAL uno HFC funcional en el sobrenadante de cultivo celular inicial, como indica el histograma azul; el medio fresco de cultivo celular, que se muestra aquí en rojo, sirvió como control negativo. Superpuesto a este histograma en verde se encuentra el flujo directo, lo que indica que el absorbedor de membrana capturó y retuvo eficazmente GAL uno HFC. GAL uno HFC se eluyó del absorbedor de membrana en incrementos de un mililitro a un mililitro por minuto, utilizando un tampón ácido basado en aminas, y las fracciones eluidas se neutralizaron. Posteriormente, se analizaron estas fracciones para detectar la presencia de GAL uno HFC funcional mediante citometría de flujo. La señal de GAL uno HFC aumentó secuencialmente desde la elución uno, aproximadamente igual al control negativo, hasta un máximo en EEU tres, y luego disminuyó hasta un nivel casi constante en las eluciones nueve y diez.

El EEU 10 final no alcanzó la equivalencia con la señal del control negativo debido a cierta retención del adsorbente de GL uno HFC. La cuantificación y caracterización de GL uno HFC purificado se realizó mediante un procedimiento de inmunotransferencia realizado de forma acelerada mediante transferencia semisequía y inmunotransferencia asistida por vacío. Al comparar la señal de GA uno HFC con patrones de cuantificación de HFC, se determinaron tanto la cantidad como la calidad del material purificado.

Las señales de GAL uno HFC y de GAL uno HFC degradado estaban dentro del rango de los estándares. Las intensidades de señal de las bandas estándar de HFC se relacionaron linealmente con la cantidad de HFC presente. La concentración de GAL uno HFC purificado, basada en HFC, se determinó en 450 microgramos por mililitro mediante procesamiento de imágenes.

Ajuste según el peso molecular de G una HFC. La concentración del material purificado fue de 720 microgramos por mililitro. En contraste, se cargó demasiada GAL purificada una HFC en las bandas seis y siete del blot de western mostrado aquí, lo que generó señales que saturaron o excedieron el rango de los estándares de HFC, impidiendo así la cuantificación.

Una alternativa al inmunotransferencia es la tinción de geles Kumasi, que puede servir como una verificación rápida de control de calidad y/o como método de cuantificación. Tenga en cuenta que una banda de aproximadamente 10 kilodaltonos, además de bandas de aproximadamente 25 y 40 kilodaltonos, estuvo presente en la muestra de GAL uno HFC degradada. Esta banda corresponde a GAL uno HFC degradado que no fue reactivo con el anticuerpo de detección utilizado en las inmunotransferencias.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar proteínas quiméricas humanas que expresan FC utilizando absorbentes de membrana y cómo caracterizar esas proteínas en tan solo cuatro horas.