Name: Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a aislar proteínas quiméricas humanas con Fc usando adsorbentes de membrana de proteína A. Este método optimizado reduce el tiempo de procesamiento y aumenta el rendimiento en comparación con la cromatografía tradicional.

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Los autores desean dar las gracias al Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio), al Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio) y al Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital y Harvard Medical School) por su asistencia técnica experta. Los autores también desean agradecer a los estudiantes de invierno de 2011 CHE 404/BME 504 y otoño de 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular y Programa de Ingeniería Biomédica, Universidad de Ohio) por su asesoramiento técnico y discusión. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) Mayor Instrumentación de Investigación CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), Institutos Nacionales de Salud (NIH) NCI subvención 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Beca Postdoctoral F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), y NIH NCCAM subvención R01AT004628 (CJD).

1. Verificar la afinidad por la proteína A
<ol><li>Verificar que la proteína que expresa Fc (proteína de fusión recombinante o anticuerpo IgG, hasta ahora denominada "proteína") tiene una afinidad aceptable por la proteína A14-17 antes de usar el adsorbente de membrana de la proteína A, y probar la presencia de la proteína en la solución madre (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a células suspendidas de pellets). Utilice citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. para detectar la función de la proteína y/o la presencia de Fc, en función de la preferencia del laboratorio. Idealmente, cuantificar la proteína en el sobrenadante de cultivo celular (paso 6) para evitar exceder la capacidad del adsorbente de membrana de la proteína A. Proceda si se detecta la proteína.</li>
</ol>2. Preparar la proteína A adsorbente de membrana y sobrenadante de cultivo celular
<ol><li>Siga las instrucciones del fabricante para preparar el adsorbente de membrana. Nunca deje que el aire entre en el adsorbente de membrana. Todas las soluciones perfundidas a través del adsorbente de membrana deben estar a temperatura ambiente y prefiltradas utilizando un filtro de 0,22 μm. Llene una jeringa de 10 ml con solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco filtrada por 0,22 μm o tampón de burbujas de aire de elección y descarga. Perfundir DPBS para eliminar la solución de almacenamiento y equilibrar el adsorbente de membrana inmediatamente antes de su uso.</li>
	<li>Filtre el sobrenadante de cultivo celular inmediatamente antes de la perfusión a través del adsorbente de membrana, utilizando una unidad de filtración estéril de 0,22 μm impulsada por vacío.</li>
</ol>3. Cargue el adsorbente de membrana de la proteína A
<ol><li>Aspirar el sobrenadante de cultivo celular en una jeringa Luer Lock (30 ml o más) y descargar cualquier burbuja de aire.</li>
	<li>Montar materiales y equipos como se muestra en la Figura 1. Conecte la jeringa a la entrada del adsorbente de membrana. Conecte un tubo flexible a la salida del adsorbente de membrana. Si lo desea, coloque un filtro de jeringa de 0,22 μm entre la jeringa y el adsorbente de membrana. Use un matraz o botella para atrapar el flujo (también conocido como filtrado), del adsorbente.</li>
	<li>Ajuste la bomba de la jeringa a la velocidad de flujo volumétrica deseada, pero no exceda la tasa de flujo recomendada por el fabricante(por ejemplo, 10 ml / min). Perfundir el sobrenadante de cultivo celular a través del adsorbente de membrana, recogiendo el flujo a través de un castor u otro recipiente. Vuelva a cargar la jeringa con los sobrenadantes necesarios.</li>
	<li>Si lo desea, pruebe el flujo a través de la presencia de proteína utilizando citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio. Por lo general, no es necesario volver a dispersar el flujo a través de.</li>
</ol>4. Proteína Elute del adsorbente de membrana
<ol><li>Lave el adsorbente de membrana con 10 ml de DPBS para eliminar cualquier proteína no ligada.</li>
	<li>Proteína elute del adsorbente de membrana al caudal deseado(por ejemplo, 1 ml/min) utilizando 10-15 ml de tampón de elución(por ejemplo, tampón de elución a base de aminas (pH 2.8)). Atrapar eluido en un tubo que contenga tampón neutralizante(por ejemplo, 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volumen de elución (1,0-1,5 ml).</li>
	<li>Alternativamente, la proteína elute en un ml se incrementa en tubos que contienen 100 μl de tampón de neutralización, utilizando un volumen total de 10-15 ml de tampón de elución. Utilice el método de caracterización preferido para probar cada fracción para la presencia de proteína.</li>
	<li>Regenerar el adsorbente de membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Perfundir 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm o tampón de su elección, luego 10 ml de NaOH de 0,22 μm filtrados a 50 mM en 1 N NaCl, y finalmente 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm. Llene el adsorbente de membrana con etanol al 20% en DPBS para su almacenamiento a largo plazo a 4 ºC.</li>
</ol>5. Concéntrese y descongele la proteína
<ol><li>Depositar todos los eluos (o fracciones de elución que contengan proteínas según lo determinado en el paso 4.3) en una unidad de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kDa. Siga las instrucciones del fabricante para la centrifugación.</li>
	<li>Dializar el retentado en una unidad de diálisis de pequeño volumen (corte de peso molecular de 10 kDa) contra el tampón de elección, siguiendo las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario agregar un tampón al material dializado si la precipitación de proteínas es una preocupación. Si se desea, el material dializado se puede refrigerar hasta que se pueda realizar el paso 6, pero no se recomienda el almacenamiento a largo plazo sin conservantes.</li>
</ol>6. Cuantificar y caracterizar el producto purificado en un procedimiento de western blotting acelerado
<ol><li>Resolver los estándares de proteínas purificadas y Fc en el gel de elección por SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras como se desee18-20. Utilice un mini gel en lugar de gel midi para minimizar el tiempo de ejecución.<ol>
<li>Si aún no se conoce, determine el rango de estándares Fc en qué banda la señal varía linealmente con respecto a la cantidad de carga(por ejemplo, 0,1-1 mg). Use el mismo gel, condiciones de funcionamiento, condiciones de transferencia y reactivos que se utilizarán para cuantificar y caracterizar la proteína purificada.</li>
			<li>Cargue múltiples cantidades de muestras de proteína purificada, incluidas las muestras diluidas con DPBS, para asegurarse de que las señales de banda de proteína purificada estén dentro del rango de señal lineal de los estándares Fc en el análisis de imágenes.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Transfiera proteínas del gel a una membrana de fluoruro de polivinidideno (PVDF) en un sistema tampón discontinuo utilizando un blottersemidry 13,siguiendo las instrucciones del fabricante del blotter. El tiempo de transferencia es típicamente de 5-10 min. Si se desea, Coomassie manchar el gel después de la transferencia para verificar la eficiencia de la transferencia21.</li>
	<li>Realizar inmunoblotting con anti-Fc o anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano de caballo (HRP), basado en la preferencia de laboratorio, utilizando un sistema de detección de proteínas asistidas por vacío. El tiempo de immunoblotting es típicamente menos de 1 hora.</li>
	<li>Desarrollar immunoblot utilizando el sustrato y el método de elección(por ejemplo, sustrato AP y quimioluminiscencia mejorada).</li>
	<li>Cuantifique la proteína purificada por análisis de imagen. Realice una regresión lineal en las señales de banda de los estándares Fc. SiR2>0,90, utilice la ecuación de la línea para calcular la cantidad de proteínas a partir de sus señales de banda. Tenga en cuenta la dilución de la muestra si es necesario. Dado que la cuantificación de la proteína se realiza sobre la base de Fc, ajuste el valor para las diferencias de peso molecular entre la proteína y Fc. SiR2<0,90, repita el paso 6 en su totalidad.</li>
	<li>Validar la proteína utilizando ensayos funcionales o métodos para detectar Fc a través de citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio.</li>
	<li>Diluya la proteína a la concentración deseada y/o agregue los conservantes o estabilizadores deseados a la solución de proteína purificada antes de alícuota para su almacenamiento a largo plazo, congelado o de otro tipo.</li>
</ol>

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</ol>

No hay nada que revelar.

El protocolo descrito en este documento fue desarrollado para aislar y caracterizar rápidamente una proteína quimérica de fusión que expresa fc humano (Gal-1hFc), sin comprometer significativamente la recuperación del producto o inflar el costo. Los componentes clave del flujo de trabajo optimizado son un adsorbente de membrana de proteína A para el aislamiento, y la transferencia de semisel y el inmunoblotting asistido por vacío para la caracterización por western blotting.
La disminución dra...

El aislamiento de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de inmunoglobulina G (IgG) Fc de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares diluidas se puede lograr utilizando cromatografía de afinidad de proteínas A. En los laboratorios de ciencia básica e ingeniería y en la industria, las columnas empaquetadas con agarosa recubierta de proteína A porosa, vidrio o perlas poliméricas se utilizan más comúnmente para la cromatografía de afinidad, a pesar de los altos costos financieros y los largos tiempos de procesamiento1-3. Es muy apreciado que la cromatografía de afinidad representa el mayor gasto y cuello de botella de procesamiento tanto en entornos de laboratorio como industriales2,4. Como resultado, se han desarrollado numerosas mejoras para disminuir el costo y el tiempo de procesamiento sin sacrificar la recuperación general del producto del tren de proceso1,2,5-7. Particularmente prometedor para el aislamiento de anticuerpos y otras proteínas que expresan Fc es la cromatografía de afinidad utilizando un adsorbente de membrana de proteína A2,5,7-10. Mientras que la captura de Fc en cromatografía de columna está limitada por difusión (esdecir, la proteína que expresa Fc debe difundirse dentro y a través de los poros internos para alcanzar la mayoría de la proteína A) con alta caída de presión a través de la columna, el transporte de masa en los adsorbers de membrana es impulsado por la convección a granel, lo que resulta en la evitación de las limitaciones de difusión8,9,11,12. Además, la caída de presión a través del adsorbente de membrana es baja, lo que permite tasas de flujo de perfusión más rápidas en comparación con las columnas empaquetadas con perlas8,9,11,12. Por lo tanto, para el aislamiento a escala de laboratorio, se predice que la cromatografía de membrana reducirá el tiempo de aislamiento en varias horas y aumentará la captura del producto en comparación con la cromatografía de columna. Además, se han propuesto modelos matemáticos para la adsorción de IgG en adsorbentes de membrana8,9,11,12,permitiendo así a los usuarios finales predecir el rendimiento en el laboratorio.
Otro cuello de botella en los laboratorios de ciencia básica e ingeniería es la caracterización de la proteína que expresa Fc. Sin embargo, la selección de métodos apropiados para completar los ensayos de caracterización, como las manchas occidentales, puede reducir en gran medida el tiempo dedicado a las pruebas de productos. Por ejemplo, la transferencia de semisido en un sistema tampón discontinuo puede lograr la transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana de polivinilo difluoridina (PVDF) en cuestión de minutos, en lugar de 1-2 horas en la transferencia del tanque (húmedo) en un sistema tampón continuo13.
Un protocolo rápido, barato, y eficaz para aislar y para caracterizar una proteína quimérica de la fusión que expresa un fragmento del Fc de IgG humano se describe adjunto. La mayoría de los equipos están fácilmente disponibles en los laboratorios estándar de ciencias biomédicas básicas, biología, química y (bio)ingeniería química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Aunque se generaron resultados representativos a partir del aislamiento y caracterización de una proteína de fusión quimérica Murina Galectina-1/Humana Fc (Gal-1hFc), el protocolo simplificado se puede aplicar al aislamiento de otras moléculas que poseen un fragmento Fc, como anticuerpos, fragmentos Fc ellos mismos, u otras proteínas de fusión Fc. Nuestras mejoras disminuyeron drásticamente el tiempo de procesamiento (tan solo 4 horas, pero más típicamente ~ 9 horas, en comparación con más de 20 horas de trabajo) mientras lograba una recuperación del producto similar o mejorada en comparación con los métodos estándar.

<table><tbody><tr><td>Adsorbente de membrana de proteína A (Sartobind Protein A 2 ml)&nbsp;</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>93PRAP06HB-12--A Filtro</td><td></td></tr><tr><td>centrífugo Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td>Utilice un volumen de 15 ml si es necesario</td></tr><tr><td>Unidad de filtro de vacío estéril, 0,22 y micro; m, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringas con puntas Luer Lock</td><td>BD 301604</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 ml Jeringas con puntas Luer Lock</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de laboratorio Tygon (1/16 pulgadas x 1/8 pulgadas x 50 pies)</td><td>Cole Parmer</td><td>WU-95903-16</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI (10K MWCO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>69576</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. bandeja de recolección de anticuerpos</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDABTR</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. soporte de transferencia de pocillo único</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBH01</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de elución</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultrapuro</td><td>Fisher Scientific</td><td>819623 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+/Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Humano Fc</td><td>Bethyl Laboratorios de Investigación</td><td>P80-104</td><td></td></tr><tr><td>Antihumano Fc-APC</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109136170</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano Fc-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5018</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato de fosfatasa alcalina</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de citometría de flujo (5 ml de poliestireno o polipropileno)</td><td>BD</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-2226</td><td>También es aceptable una bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Gel de proteínas sistema de electroforesis</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>552BR094876</td><td>Cualquier sistema de electroforesis en gel es aceptable, pero los sistemas de mini gel funcionan más rápido</td></tr><tr><td>Secante semiseco</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>690BR006163</td><td>Cualquier sistema de transferencia es aceptable, pero los sistemas de transferencia discontinuos realizan la transferencia electroforética más rápida</td></tr><tr><td>Sistema de detección de proteínas asistido por vacío SNAP i.d.</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBASE</td><td>Un modelo actualizado ha reemplazado a este instrumento específico, pero cualquiera de los dos debería funcionar igual de bien</td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de proteínas quiméricas humanas que expresan fc usando adsorbentes de membrana de proteína a y un flujo de trabajo optimizado

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

La purificación a escala de laboratorio a escala industrial de biomoléculas de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares lisadas se puede lograr mediante cromatografía de afinidad. Mientras que la cromatografía de afinidad utilizando perlas de agarosa de proteína A porosa empaquetadas en columnas es posiblemente el método más común de aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de Fc de IgG, puede ser un proceso lento y costoso. Las limitaciones de tiempo y financieras son especialmente desalentadoras en pequeños laboratorios de ciencias básicas que deben recuperar cientos de microgramos a cantidades de miligramos de proteína de soluciones diluidas, pero carecen de acceso a sistemas de administración de líquidos de alta presión y / o personal con experiencia en bioseparaciones. Además, la cuantificación y caracterización del producto también puede alargar excesivamente el tiempo de procesamiento durante varios días de trabajo e inflar los gastos (consumibles, salarios, etc.). Por lo tanto, se necesita un protocolo rápido, económico pero efectivo para el aislamiento a escala de laboratorio y la caracterización de anticuerpos y otras proteínas que poseen un fragmento de Fc. Con este fin, hemos ideado un protocolo que puede ser completado por personal técnico de experiencia limitada en menos de 9 horas (aproximadamente un día de trabajo) y tan rápido como 4 horas, en comparación con los métodos tradicionales que exigen más de 20 horas de trabajo. La mayoría del equipo requerido está fácilmente disponible en los laboratorios estándar de ciencia biomédica, bioquímica e ingeniería (bio)química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Para demostrar este protocolo, los resultados representativos se presentan en los cuales el galectin-1 murine quimérico fundido al Fc humano (Gal-1hFc) del sobrenadante del cultivo celular fue aislado usando un adsorber de la membrana de la proteína A. Gal-1hFc purificado fue cuantificado usando un procedimiento occidental apresurado del análisis que borraba y caracterizado usando cytometry de flujo. El flujo de trabajo optimizado puede modificarse para otras proteínas que expresan Fc, como los anticuerpos, y/o alterarse para incorporar métodos alternativos de cuantificación y caracterización.

El protocolo simplificado para el aislamiento y la caracterización de las proteínas que expresan Fc se utiliza rutinariamente para procesar la galectina murina quimérica-1 fusionada a Fc humano (Gal-1hFc) a partir de sobrenadantes de cultivo celular diluidos. El diagrama de flujo de la figura 2 ilustra el flujo de trabajo y la hora de cada paso del protocolo. Para un lote típico de 300 ml de sobrenadante, el tiempo total de procesamiento es de aproximadamente 9 horas cuando se realiza la prueba opcional ...

En comparación con la cromatografía de afinidad tradicional utilizando columnas empaquetadas de cuentas de agarosa de proteína A, los adsorbentes de membrana de proteína A pueden acelerar significativamente el aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y otras proteínas que expresan fragmentos de Fc. Los métodos apropiados de análisis y cuantificación pueden acelerar aún más el procesamiento de proteínas, lo que permite que el aislamiento / caracterización se complete en un día de trabajo, en lugar de más de 20 horas de trabajo.

Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar de manera eficiente y efectiva proteínas quiméricas que expresan la fracción Fc humana mediante el uso de una proteína, absorbentes de membrana y un flujo de trabajo optimizado. Esto se logra primero aclarando el sobrenadante del cultivo celular con un filtro de 0,22 micrones. El segundo paso consiste en armar el sistema de flujo e iniciar la perfusión del sobrenadante del cultivo celular a través del absorbente de membrana de proteína A.A continuación, se eluye la proteína expresada de FC humana de la membrana absorbente, concentrándose el EIT resultante mediante ultrafiltración, seguido de intercambio de tampón mediante diálisis. Los pasos finales consisten en utilizar citometría de flujo e inmunotransferencia (western blot) para determinar la calidad y cantidad de la proteína concentrada. En definitiva, los absorbentes de membrana de proteína A, junto con un flujo de trabajo optimizado, muestran una reducción del tiempo de procesamiento y un posible aumento en el rendimiento proteico en comparación con la cromatografía de afinidad tradicional con columnas empaquetadas de proteína A aro speed.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la cromatografía de afinidad en columna es que el absorbedor de membrana permite obtener rendimientos potencialmente mayores de la proteína con un tiempo de procesamiento más bajo. La selección de métodos adecuados de caracterización también puede reducir el tiempo de procesamiento. Prepare el absorbedor de membrana siguiendo las instrucciones del fabricante, asegurándose de que todas las soluciones que pasen a través de él estén a temperatura ambiente y previamente filtradas mediante un filtro de 0,22 micrones. Para comenzar, llene una jeringa de 10 mililitros con solución salina tamponada con fosfato de KO o DPBS filtrada a 0,22 micrones y elimine cualquier burbuja de aire.Asegúrese de que el aire nunca entre en el absorbedor de membrana; pase DPBS a través de él para eliminar la solución de almacenamiento y equilibrar el absorbedor de membrana inmediatamente antes de su uso. Filtre inmediatamente el sobrenadante del cultivo celular antes de perfundirlo a través del absorbedor de membrana, utilizando una unidad de filtración estéril de vacío de 0,22 micrones para cargar el absorbedor de membrana de proteína A, aspire el sobrenadante del cultivo celular en una jeringa con bloqueo de bayoneta y elimine cualquier burbuja de aire para armar los materiales y equipos. Primero, conecte la jeringa a la entrada del absorbedor de membrana.Conecte un tubo flexible a la salida del absorbedor de membrana si lo desea. Coloque un filtro de jeringa de 0,22 micrones entre la jeringa y el absorbedor de membrana. Utilice un matraz o botella para recoger el flujo que sale del absorbedor.Configure la bomba de jeringa a la velocidad de flujo volumétrico deseada, pero no supere la velocidad de flujo recomendada por el fabricante. Haga pasar el sobrenadante del cultivo celular a través del absorbedor de membrana recolectando el flujo de salida. Recargue la jeringa con sobrenadante según sea necesario.Si se desea, pruebe el flujo resultante para detectar la presencia de proteína mediante citometría de flujo, inmunotransferencia o ELISA según la preferencia del laboratorio; normalmente no es necesario volver a perfundir el flujo resultante para eluir la proteína del absorbedor de membrana. En primer lugar, lave el absorbedor de membrana con 10 mililitros de DPBS para eliminar cualquier proteína no unida. Eluya la proteína del absorbedor de membrana a la velocidad de flujo deseada.Utilizando de 10 a 15 mililitros de tampón de elución. Reciba el EIT en un tubo que contenga tampón neutralizante al 10 % del volumen de elución. Después de eluir la proteína, regenere el absorbedor de membrana según las instrucciones del fabricante.Llene el absorbedor de membrana con etanol al 20 % en DPBS para su almacenamiento a largo plazo a cuatro grados Celsius. Deposite todo el EIT en una unidad de filtro centrífugo con un límite de exclusión de peso molecular de 10 kilodalton.Siga las instrucciones del fabricante para la diálisis por centrifugación. El retenido. En una unidad de diálisis de pequeño volumen con un límite de peso molecular de 10 kilodalton frente al tampón elegido, puede ser necesario añadir tampón al material dializado.Si la precipitación de proteínas es una preocupación, resuelva las proteínas purificadas y los estándares de FC en el gel de elección mediante electroforesis SDS bajo condiciones reductoras o no reductoras según se desee. Utilice un gel mini en lugar de un gel mini para minimizar el tiempo de corrida; cargue múltiples cantidades de muestra de proteína purificada, incluyendo muestras diluidas con DPBS para asegurar que las señales de las bandas de proteína purificada se encuentren dentro del rango lineal de señal de los estándares de FC. En el análisis de imágenes tras la separación en gel, transfiera las proteínas desde el gel a una membrana de fluoruro de poliolefina en un sistema de buffer discontinuo utilizando una transferencia semiseca siguiendo las instrucciones del fabricante; el tiempo de transferencia suele ser de cinco a 10 minutos.Coloree el gel con Kumasi después de la transferencia para verificar la eficiencia de transferencia. Realice la inmunodetección con anti-FC o anti-IgG conjugado a fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante utilizando una detección de proteínas asistida por vacío. El tiempo de inmunodetección suele ser inferior a una hora.Desarrolle el inmunotransferido utilizando el sustrato y el método de elección. Cuantifique la proteína purificada mediante análisis de imagen. Realice una regresión lineal sobre las señales de las bandas provenientes de los estándares de FC.Si R al cuadrado es mayor que 0,90, utilice la ecuación de la recta para calcular la cantidad de proteína a partir de la señal de la banda, teniendo en cuenta la dilución de la muestra si es necesario. Dado que la cuantificación de la proteína se realiza en función de fc, ajuste el valor según las diferencias de peso molecular entre la proteína y fc. Si R al cuadrado es menor que 0,90, repita el procedimiento acelerado de inmunotransferencia.Finalmente, valide la proteína mediante ensayos funcionales o métodos para detectar FC mediante citometría de flujo. Se utilizó inmunotransferencia o citometría de flujo EISA para comprobar la presencia de GAL uno HFC funcional en el sobrenadante de cultivo celular inicial, como indica el histograma azul; el medio fresco de cultivo celular, que se muestra aquí en rojo, sirvió como control negativo. Superpuesto a este histograma en verde se encuentra el flujo directo, lo que indica que el absorbedor de membrana capturó y retuvo eficazmente GAL uno HFC. GAL uno HFC se eluyó del absorbedor de membrana en incrementos de un mililitro a un mililitro por minuto, utilizando un tampón ácido basado en aminas, y las fracciones eluidas se neutralizaron. Posteriormente, se analizaron estas fracciones para detectar la presencia de GAL uno HFC funcional mediante citometría de flujo. La señal de GAL uno HFC aumentó secuencialmente desde la elución uno, aproximadamente igual al control negativo, hasta un máximo en EEU tres, y luego disminuyó hasta un nivel casi constante en las eluciones nueve y diez.El EEU 10 final no alcanzó la equivalencia con la señal del control negativo debido a cierta retención del adsorbente de GL uno HFC. La cuantificación y caracterización de GL uno HFC purificado se realizó mediante un procedimiento de inmunotransferencia realizado de forma acelerada mediante transferencia semisequía y inmunotransferencia asistida por vacío. Al comparar la señal de GA uno HFC con patrones de cuantificación de HFC, se determinaron tanto la cantidad como la calidad del material purificado.Las señales de GAL uno HFC y de GAL uno HFC degradado estaban dentro del rango de los estándares. Las intensidades de señal de las bandas estándar de HFC se relacionaron linealmente con la cantidad de HFC presente. La concentración de GAL uno HFC purificado, basada en HFC, se determinó en 450 microgramos por mililitro mediante procesamiento de imágenes.Ajuste según el peso molecular de G una HFC. La concentración del material purificado fue de 720 microgramos por mililitro. En contraste, se cargó demasiada GAL purificada una HFC en las bandas seis y siete del blot de western mostrado aquí, lo que generó señales que saturaron o excedieron el rango de los estándares de HFC, impidiendo así la cuantificación.Una alternativa al inmunotransferencia es la tinción de geles Kumasi, que puede servir como una verificación rápida de control de calidad y/o como método de cuantificación. Tenga en cuenta que una banda de aproximadamente 10 kilodaltonos, además de bandas de aproximadamente 25 y 40 kilodaltonos, estuvo presente en la muestra de GAL uno HFC degradada. Esta banda corresponde a GAL uno HFC degradado que no fue reactivo con el anticuerpo de detección utilizado en las inmunotransferencias.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar proteínas quiméricas humanas que expresan FC utilizando absorbentes de membrana y cómo caracterizar esas proteínas en tan solo cuatro horas.

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Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado

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