Simulación de páncreas Neuroplasticidad:

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las alteraciones reactivas de las neuronas periféricas frente a diferentes microentornos pancreáticos. Esto se logra primero generando lisados completos de tejido a partir de páncreas humano normal y tejido pancreático enfermo. Como segundo paso, se aíslan células de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de ratas recién nacidas, las cuales posteriormente se tratan con los lisados de tejido aislados.

A continuación, tras incubar durante 48 horas, las células se fijan para realizar una tinción doble de inmunofluorescencia posterior. Los resultados muestran las diferencias en el patrón de ramificación de la densidad de neuritas y en la densidad glial de neuronas cultivadas en diferentes extractos de tejido. Este método puede ayudar a facilitar estudios en el campo de la neurogastroenterología, como el papel de los mediadores moleculares y de las alteraciones neuroplásticas en diversas enfermedades gastrointestinales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los diferentes atributos neurotróficos de las enfermedades pancreáticas, también puede aplicarse a otros sistemas, como los cánceres o los estados inflamatorios de todo el tracto gastrointestinal. Tuvimos por primera vez la idea de utilizar este método cuando comenzamos nuestras colaboraciones con investigadores en el campo de las enfermedades neuropáticas en el sistema pediátrico, como la enfermedad de Ong, y lo aplicamos para nuestros propósitos de homogenizar el tejido pancreático humano. Transfiera cubos de tejido pancreático de cinco por cinco por cinco milímetros directamente desde menos 80 grados Celsius al nitrógeno líquido.

Luego, coloque los bloques congelados primero en tubos de homogenización que puedan contener una bola metálica de disociación y, a continuación, en el homogenizador de tejidos, homogenice sin permitir que el tejido se descongele inmediatamente después de la disociación. Resuspenda el homogenado, de aspecto similar a un polvo sólido, en 300 a 500 microlitros de PBS 0,1 X frío con hielo. No utilice ningún tampón de lisis, ya que esto podría.

Lice los neuronas, luego centrifugue el homogeneizado a 21.130 × g a cuatro grados Celsius durante al menos 15 minutos. Recoga el sobrenadante claro, que contiene el extracto tisular, para recoger el sobrenadante de líneas celulares de líneas celulares pancreáticas humanas. Cultive las células hasta alcanzar al menos un 70 a 80 % de confluencia en medio de crecimiento normal.

Cuando estén listas, lave las células al menos tres veces con PBS de grado para cultivo celular y cultívelas en medio sin suero durante hasta 48 horas. A continuación, mida la concentración de proteína del homogenato tisular o de los sobrenadantes de la línea celular mediante el ensayo de proteína de Bradford. Luego, alícuote los extractos tisulares y los sobrenadantes de la línea celular de modo que la concentración final del extracto o sobrenadante en el medio neuronal sea de 100 microgramos por mililitro.

Y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Utilizando una rata recién nacida decapitada de P2 a P12, corte la piel y exponga la columna vertebral. Luego realice una laminectomía anterior para exponer la médula espinal.

A continuación, exponga y retire los ganglios de la raíz dorsal o DRGs. Coloque el ganglio de la raíz dorsal en MEM frío con hielo, suplementado con gentamicina y metronidazol. Continúe recolectando ganglios de la raíz dorsal, comenzando con los ganglios lumbares y avanzando hacia los ganglios cervicales superiores.

Una vez finalizado, se recopilan 52 DRG suficientes para una placa de 24 pocillos. A continuación, utilice tijeras microquirúrgicas para separar los DRG de sus raíces y nervios. Luego corte todas las proyecciones periféricas y centrales restantes.

Tras la recolección de los ganglios de la raíz dorsal, incubarlos en HBSS suplementado con colagenasa tipo dos a 37 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. Tras la incubación, triturar los ganglios de la raíz dorsal mediante jeringas de diámetro decreciente.

Tenga en cuenta que la tripsina en exceso puede destruir neuronas, pero es menos destructiva para la glía. Una vez que el medio que contiene los GRD se haya vuelto turbio, centrifugue la suspensión a 93,9 ×g durante cinco minutos. Luego deseche el medio y resuspenda.

Suspenda las células en medio neuro basal para prepararlas para el cultivo. Utilice un hemocitómetro para estimar el número total de neuronas y glía. Luego siembre las células en cubreobjetos pre-recubiertos de 13 milímetros.

En una placa de 24 pocillos, el recubrimiento utilizado depende de los objetivos experimentales. A continuación, agregue el medio neurobasal a los pocillos y deje que las células se adhieran a los mismos durante la noche. Al día siguiente, descongele el medio suplementado con extracto de tejido o el medio suplementado con sobrenadante de la línea celular.

A continuación, aspire el medio de siembra de los GSR y realice un lavado opcional, muy suave, con PBS. Luego, pipetee lentamente el tejido, el medio suplementado con extracto o el medio suplementado con sobrenadante de la línea celular sobre las células para obtener 100 microgramos por mililitro. Ahora, deje crecer las células durante 48 horas a 37 grados Celsius en el medio suministrado con extracto de tejido o sobrenadante de la línea celular tras 48 horas.

Aspire el medio y fije con paraformaldehído al 4 % para tinción inmunológica. Para la tinción inmunofluorescente doble, utilice marcadores específicos para neuronas y marcadores específicos para glía para la geometría morfológica. Utilice un microscopio óptico invertido equipado con una cámara CCD en combinación con software automatizado para medir la densidad de neuritas utilizando un aumento de 200 x.

Mida la densidad de neuritas en cultivos neuronales superponiendo una cuadrícula de 50 por 50 micrones y contando la densidad de fibras por cuadrado, medida en las fibras que se intersectan. Repita este análisis en cuatro regiones diferentes con el crecimiento más denso, en cuatro o cinco microfotografías representativas de cada cubreobjetos. Mida el número medio de ramificaciones por neurona, la longitud media de las ramas y el tamaño perineuronal a partir de 30 neuronas aisladas seleccionadas al azar de cada cubreobjetos, marcando las neuritas y el pericarion. Se muestran aquí neuronas del ganglio dorsal de la raíz (DRG) cultivadas con un extracto tisular de páncreas normal.

En contraste, las neuronas del ganglio dorsal cultivadas con extractos de tejido de pancreatitis crónica o cáncer de páncreas exhiben una mayor densidad de neuritas. Aquí se muestran neuronas del plexo mientérico cultivadas con diversos extractos de tejido pancreático humano.

Las neuronas del plexo mientérico cultivadas en extractos de páncreas con pancreatitis crónica o cáncer de páncreas desarrollan neuronas más largas y presentan un patrón de ramificación más complejo que aquellas cultivadas en extractos de páncreas normal. Cuando las neuronas del ganglio dorsal de la raíz se cultivaron con el sobrenadante de células de cáncer de páncreas, también se observó un aumento en la densidad nerviosa, similar a lo observado con los extractos de tejido. Sin embargo, este aumento fue reversible cuando se agotaron o bloquearon factores neurotróficos seleccionados, como nuestra teína o el factor de crecimiento nervioso.

Las células Ggl también responden de manera diferente a distintos extractos de tejido pancreático, extractos de pancreatitis crónica o de cáncer de páncreas, que potencian el crecimiento glial y el recuento de células gliales en cultivos derivados de ganglios de la raíz dorsal. Aunque el efecto fue más pronunciado con los extractos de cáncer de páncreas que con los de pancreatitis crónica una vez dominada la técnica, esta puede realizarse en cuatro a cinco horas si se lleva a cabo adecuadamente tras su desarrollo.

Este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurogastroenterología exploraran los mecanismos de la neuroplasticidad en diversas enfermedades gastrointestinales, incluyendo trastornos gastrointestinales inflamatorios y malignos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas periféricas para estudiar la neuroplasticidad pancreática en el páncreas y cómo implementar ese sistema, así como otras alteraciones neuronales y otros ensayos de neuroplasticidad, en trastornos gastrointestinales.