Aplysia Preparación De Ganglios Para Análisis Electrofisiológicos Y Moleculares De Neuronas Individuales
January 13th, 2014
El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la expresión génica y los cambios electrofisiológicos en neuronas identificadas individualmente. Esto se logra primero identificando cuidadosamente las neuronas de interés del ganglio de plejia, siguiendo el tratamiento con proteasa y desenvainando el ganglio para exponer las neuronas. El segundo paso es registrar las propiedades electrofisiológicas de las neuronas identificadas.
A continuación, aísle las neuronas individuales siguiendo las mediciones electrofisiológicas y, a continuación, aísle los ARN de estas neuronas para la amplificación lineal. El paso final es caracterizar la expresión génica mediante PCR cuantitativa. En última instancia, analizar los datos electrofisiológicos y de expresión génica de los tratamientos y controles para identificar cambios específicos.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de órganos, tejidos o ganglios, es que proporciona análisis a nivel de una sola neurona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia cognitiva, como cómo cambia el esfuerzo de los genes en neuronas individuales durante el envejecimiento o en respuesta a diferentes reactivos farmacológicos. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando quisimos investigar cómo el envejecimiento afecta el funcionamiento de las neuronas individuales y los circuitos para aislar los ganglios abdominales.
Primero, anestesiar al animal inyectando una solución de cloruro de magnesio de 380 milimolares y esperar de cinco a 10 minutos. A continuación, identifique los ganglios abdominales en función de su posición en el sistema nervioso central. A continuación, extraiga los ganglios mediante operación quirúrgica y almacene inmediatamente en el agua de mar artificial para el tratamiento con proteasas.
Incubar los ganglios abdominales en una placa de Petri con 0,1% de proteasa diluida en un SW a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Tenga en cuenta que la cantidad de proteasa utilizada debe estandarizarse con la edad y el peso de los animales para eliminar la vaina ganglionar. Después del tratamiento enzimático, fije el ganglio a la base de silicona del cigarro colocada en la parte superior de un cilindro de vidrio de policarbonato, perfundícelo con un SW a 150 microlitros por minuto a 18 grados centígrados.
Para aumentar la visibilidad de las neuronas identificadas, el cilindro de vidrio de policarbonato se puede iluminar fácilmente desde la parte inferior utilizando un microscopio estereoscópico binocular con aumentos de 20 x y 40 x. A continuación, retire con cuidado la vaina del ganglio con pinzas y microtijeras en este procedimiento. Primero, identifica la neurona de interés.
A continuación, empale la neurona con un solo microelectrodo afilado intracelular lleno de una solución de cloruro de potasio de tres molares. Aplique el fármaco de elección en la cámara celular pipeteando suavemente o inyectando directamente en las neuronas. A continuación, registre la actividad neuronal mediante un sistema de registro intracelular.
Los datos de registro se procesan con un software de electrofisiología como Axo graph para aislar neuronas individuales. Después de los experimentos electrofisiológicos, detenga la perfusión A SW. Posteriormente, lavar el ganglio con etanol al 100% para petrificar las neuronas.
A continuación, extraiga las neuronas individuales con un par de pinzas finas y transfiéralas a un pequeño tubo de einor que contenga 500 microlitros de hielo frío. Reactivo de extracción de ARN. Las neuronas individuales aisladas se pueden almacenar en un reactivo de extracción de ARN a menos 80 grados Celsius para análisis futuros para aislar ARN de neuronas individuales utilizando el protocolo TRIOL estándar para el aislamiento de ARN.
Agregue brevemente un 20% de volumen por volumen de cloroformo al triol y mezcle bien brevemente. Vórtice A continuación, coloque los tubos en un rotador durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Haga girar la mezcla de cloroformo Triol a 12.000 veces la gravedad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, recoge la fase acuosa y transfiérela a un tubo nuevo para precipitar el ARN. Añadir solución de acetato de sodio a una concentración final de 0,3 molar, 100 nanogramos por mililitro del azul de glico precipitante y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa. Después de eso, mezcle bien la muestra e incube a menos 80 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, haga girar la muestra a 12.000 veces la gravedad durante 20 minutos. A cuatro grados centígrados, se verá una pequeña bolita azul en la parte inferior del tubo. Después de eso, retire el sobrenadante y lave el pellet con 850 microlitros de etanol helado al 75% a 12.000 veces la gravedad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, retire el sobrenadante con cuidado y seque al aire el pellet de ARN durante siete a 10 minutos. Asegúrese de que el ARN no se deje secar durante mucho tiempo como si se secara en exceso. El pellet de ARN hace que la solubilización sea muy difícil.
Antes de prepararse para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real, sintetice ARN A a partir de neuronas individuales y amplíelo utilizando un sistema de amplificación de ARN lineal comercial. A continuación, genere CDNA utilizando un microgramo de ARN A en 20 microlitros de una reacción de transcripción inversa. A continuación, diluya el CDNA en agua libre de nucleasas.
Después de eso, agregue ocho microlitros de la mezcla maestra QPCR que contiene dos microlitros de H2O cinco, microlitros de dos x mezcla maestra de verde cibernético y un microlitro de cebador directo e inverso de 10 micromolares a dos microlitros de CDNA diluido. A continuación, pipetear el CDNA y la mezcla maestra. Luego cierre los tubos y selle la placa.
Mezcle el contenido golpeando suavemente y girando hacia abajo a 1, 500 RPM durante 30 segundos antes de configurar la máquina QPCR. Esta caricatura muestra la grabación simultánea de la neurona L 7 y R 15 de los ganglios abdominales. Y aquí están las grabaciones intracelulares representativas de L seven y R 15.
Con la flecha que indica el tiempo de una aplicación de CH, se podrían continuar estas mediciones durante ocho a 10 horas. Esta figura muestra que se analizaron los cambios inducidos por un CH en el potencial de acción de las formas de onda R 15 AP antes, durante y después de una exposición al CH. Aquí está el análisis QPCR de la expresión de CREB uno en ganglios abdominales y neuronas identificadas individuales.
Este gráfico muestra la cuantificación absoluta de CREB en los ganglios abdominales jóvenes y adultos de plegia. Y este gráfico muestra la cuantificación absoluta de la transcripción de CEB en las neuronas individuales identificadas del plejio adulto. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro, seis horas y la amplificación del aislamiento de ARN y la QPCR se pueden completar en tres días si se realiza correctamente.
Mientras asiste a este procedimiento, es importante recordar estandarizar el tratamiento con proteasa y la extirpación de la vaina ganglionar para preservar la actividad neuronal. Además, tome precauciones al trabajar con ARN, como usar guantes en todo momento. Utilice ARN, tubos de goteo libres y agua, y trate el espacio de trabajo con reactivos de eliminación de ARN.
Esta técnica también ayudará a los investigadores en el campo de la neurociencia a explorar las bases fisiológicas y moleculares del comportamiento en otros organismos modelo de invertebrados como Tritón, Heli y Limba.
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Visión general
Este artículo describe una metodología para estudiar la expresión génica y las propiedades electrofisiológicas en neuronas identificadas individuales del caracol marino Aplysia californica. El enfoque implica una cuidadosa identificación de neuronas, registros electrofisiológicos y posterior aislamiento de ARN para el análisis de la expresión génica.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Electrofisiología
- Biología molecular
Antecedentes
- Aplysia californica es un organismo modelo bien establecido en neurobiología.
- El estudio se centra en la base celular y molecular del comportamiento.
- Entender la función neuronal es crucial para obtener información sobre el funcionamiento del sistema nervioso.
- Los análisis electrofisiológicos y moleculares proporcionan una visión integral de la actividad neuronal.
Propósito del estudio
- Explorar la expresión génica en neuronas identificadas.
- Registrar y analizar cambios electrofisiológicos en estas neuronas.
- Identificar cambios específicos en las propiedades neuronales después de los tratamientos.
Métodos utilizados
- Identificación de neuronas del ganglio de Aplysia.
- Tratamiento con proteasa y descamación del ganglio para exponer las neuronas.
- Registros electrofisiológicos de neuronas identificadas.
- Aislamiento de neuronas individuales y extracción de ARN para análisis.
Principales resultados
- Identificación y registro exitoso de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas.
- Aislamiento de ARN de neuronas individuales para el análisis de la expresión génica.
- Caracterización de la expresión génica mediante PCR cuantitativa.
- Identificación de cambios específicos en las propiedades neuronales.
Conclusiones
- La metodología permite un análisis detallado de la función neuronal.
- Los conocimientos adquiridos pueden contribuir a la comprensión del sistema nervioso.
- Estudios futuros pueden basarse en este enfoque para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Single-neuron electrophysiological and molecular profiling in Aplysia enables precise interrogation of neural circuit mechanisms underlying behavior. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at the earliest stages of neurobiology-driven drug discovery. The method's ability to link functional and gene expression data at the single-cell level informs portfolio decisions for neurodegeneration and aging research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of gene expression changes in individual neurons following pharmacological or aging interventions.
- Supports mechanistic de-risking by correlating electrophysiological phenotypes with molecular signatures.
- Facilitates functional target validation through simultaneous recording and transcript analysis in identified neurons.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuron-level systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative electrophysiological and gene expression outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on both neuronal activity and gene regulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular and physiological readouts to disease-relevant neuronal subtypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking functional and molecular endpoints.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying neuron-specific responses to interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation in neurobiology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene function and pathway involvement in single neurons.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables direct comparison of electrophysiological and gene expression data across conditions.
- Translational Research: Connects single-neuron molecular changes to broader behavioral phenotypes when supported by model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for single-cell neurobiology across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Standardizes neuron-level analyses for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying neuron-specific intervention effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiology assets based on robust single-cell data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, single-cell isolation, and molecular analysis.
- Demands specialized instrumentation for intracellular recording and quantitative PCR.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of protease treatment and neuron identification protocols.
- Adaptation to other invertebrate or vertebrate models may require protocol optimization.
- RNA integrity and contamination control are critical for reliable downstream analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Preparation of Abdominal Ganglia
2:54
Electrophysiological Measurements and Isolation of Single Identified Neurons
4:09
RNA Isolation from Single Neurons and Gene Expression Analysis by Quantitative Real Time PCR
7:01
Results: Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons of Aplysia Ganglia
8:08
Conclusion
