Name: Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a utilizar el ensayo de dos híbridos en levadura para identificar interacciones entre el receptor PXR y el antagonista ketoconazol. Este método permite descubrir mutaciones que confieren resistencia al fármaco.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Otorga CA127231 y el Premio Fundación Damon Runyon Investigador Clínico (IC 1502) (para SM). Nos gustaría dar las gracias al profesor Zdenek Dvorak desde Palacky Universidad de Olomouc, República Checa por sus útiles conocimientos sobre la discusión portabilidad de esta técnica para su institución y estandarización del protocolo.

1. Construcción de PXR y SRC-1 Las fusiones en vectores de levadura <ol><li> La amplificación por PCR de humano PXR LBD (107-434 aminoácidos) y SRC-1 humano de longitud completa (aminoácidos 1 a 1401). <ol><li> Utilice pSG5-hPXR plásmido 8 como plantilla PXR LBD, utilizar plásmido pCMX-SRC1 como SRC-1 plantillas. </li><li> Descongele la PCR Supermix, plantillas de ADN y cebadores (ver Materiales), mantenerlos en hielo. </li><li> Añadir 0,25 g / l de ADN plantilla 1 l, 10 mM de pares de cebadores 2 l cada uno, PCR Supermix 45 l y agregar H 2 O para traer volumen total de 50 l. </li><li> Conjunto de PCR en un ciclo de 94 ° C durante 2 min, 20 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 2 min, luego un ciclo de 72 ° C durante 10 min para la extensión. Compruebe los productos de PCR mediante la ejecución de un 1% en gel de agarosa. </li></ol></li><li> Productos de PCR en vectores de clonación Y2H. <ol><li> Purificar los productos de PCR de 1% en gel de agarosa. Resumen PXR, LBD, la PCR, y Y2H vector de pSH2-1 conBamHI y SalI; digieren SRC-1 PCR y Y2H vector pGADNOT con NotΙ y SalΙ. Para ello, agregue 1 g de ADN, 3 l de 10x tampón de reacción, 1 enzimas de restricción mu l, y, finalmente, H 2 O para traer volumen total de 30 l. </li><li> Coloque las muestras de digestión en 37 ° C baño de agua durante 1 hora. Compruebe la digestión mediante la ejecución de un 1% en gel de agarosa. </li><li> Purificar muestras de digestión de un 1% en gel de agarosa, ligar digerido productos de PCR y vectores Y2H y transformar a las células competentes DH5a. </li><li> Elige las colonias y aislar el ADN plásmido. </li></ol></li><li> Identificar el ADN plásmido pSH2-1-PXR por digestión BamHI / SalI, identificar pGADNOT-SRC-1 ADN plásmido por digestión con NotI / SalI. Verifique todo el ADN plásmido positivo por secuenciación. </li></ol> 2. La levadura de dos ensayos de híbridos <ol><li> Inocular la cepa de levadura en 5 ml de YPAD e incubar durante la noche por agitación constante (220 rpm a 30 ° C). Nota: La cepa de Saccharomyces cerevisiae era CTY10-5d(Mat A trp ade2 1-901 leu2-3, 112 his3-200 ga l4 - GAL80 - URA3 :: lexA-lacZ) que contiene un gen integrado GAL1-lacZ con lexA operador 10. Para obtener células de levadura viables resistentes a ketoconazol, pero los que no llevar a alteraciones del transportador como una causa de la resistencia a los azoles 18-20, nuevas cepas de levadura CTY10-5d se obtuvieron por primera ERG3 borrado (Δ ERG3) y luego la introducción de deleción adicional en ERG11 (ERG3 Δ / Δ ERG11) genes por recombinación homóloga. Los detalles de la construcción se han descrito en un manuscrito publicado previamente 6. </li><li> El día siguiente (por la mañana), inocular la levadura (1:20) en 5 ml de YAPD y se incuba para obtener un OD 600 ~ 0,2 por agitación constante (220 rpm a 30 ° C). </li><li> Sedimenten las células a 2000 rpm en una microcentrífuga durante 2 minutos y descartar el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet dos veces con agua tratada en autoclave y una vez con 0,1 M LiAc. </li><li> Después del lavado final, desechar el sobrenadante y agregar los siguientes reactivos al sedimento celular: 240 l PEG 3500 al 50% w / v, 36 l 1 M LiAc, 50 l 2 mg / ml hervida ssDNA de esperma de salmón, H 2 O 34 l. Vortex para mezclar, añadir 1 g PSH-PXR y 1 mg pGADNOT-SRC-1 DNA y mezclar. </li><li> Transferir la mezcla al poliestireno tubo de fondo redondo, agitar la transformación, la mezcla (220 rpm a 30 ° C) durante 30 min. Mueva el tubo a 42 º C baño de agua y se incuba durante 30 min adicionales. </li><li> Centrifugar el tubo a 2000 rpm durante 2 min y separar el sobrenadante. Lave pellet una vez con agua tratada en autoclave. </li><li> Añadir 100 l de agua estéril en el tubo, vuelva a suspender las células mediante el dedo medio, tocando y pipeta, luego la placa en placas de -His/-Leu Dropout Medio (Formulación por litro -His/-Leu Dropout Medio: 20 g de dextrosa, 1,7 g YNB, 0,67 g CSM-His/-Leu, sulfato de amonio 5 g, 1,5% de agar) y IncUbaté a 30 ° C durante 3-4 días para aislar transformantes. </li></ol> 3. Ensayo Filtro de X-gal <ol><li> Cortar membrana de nitrocelulosa con el tamaño de una parte de una placa de Petri. Etiquetar la membrana de nitrocelulosa para marcar la orientación. </li><li> Coloque membrana de nitrocelulosa previamente marcada en colonias de levaduras, asegurarse de que la membrana está en contacto con la superficie del medio de placa. </li><li> Retire la membrana, colóquelo con las colonias hacia arriba sobre un papel de filtro de 3 mm, y colocar la membrana y el papel de filtro a -80 ° C durante 15 min. </li><li> Haga solución X-gal. Añadir 50 l 20 mg / ml de X-gal y 15 l β-mercaptoetanol al 5 ml de Z-buffer (tampón 1 L contiene 16,1 g de Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 g de NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,75 g KCl, 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O). Si Z tampón se mantuvo a 4 ° C, llevarlo a la temperatura ambiente antes de la adición de estos reactivos. </li><li> Coloque dos círculos de papel de filtro de 3 mmen una placa de Petri y déjelos remojar con 5 ml de solución de X-gal. Escurrir el exceso de tampón de la placa de Petri y colocar la membrana de nitrocelulosa con el lado de las colonias hacia arriba. </li><li> Cierre la tapa, asegúrese de que la membrana está en contacto completo con el papel de filtro y es completamente mojada. Envuelva la placa de Petri en papel de aluminio y se incuba a 37 ° C durante 30 min para toda la noche. </li></ol> 4. Líquido de ensayo β-gal <ol><li> Crecer levadura en medio líquido -His/-Leu Dropout a OD 600 de 0,7. </li><li> Transferencia de 1 ml de medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 3000 rpm durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de tampón Z para volver a suspender el sedimento, se centrifuga a 3000 rpm de nuevo durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 150 l de buffer Z con 2ME para volver a suspender el sedimento celular, mezclar a continuación, añadir 50 l de cloroformo y 20 l 0,1% de SDS. Vigorosamente agite la muestra durante 15 segundos. </li><li> Añadir 700 l de solución de ONPG (1 mg / ml en Z BUFfer). Ajuste el temporizador, se incuba a 30 ° C el tiempo suficiente para permitir que el color amarillo para el desarrollo y tenga en cuenta el tiempo de reacción total. </li><li> Añadir 500 l de 1 M de Na 2 CO 3 para detener la reacción y determinar la absorbancia a 420 nm. El blanco es la solución de ONPG 700 l, más 500 l 1 M Na 2 CO 3. </li></ol> Calcular Unidades de Miller de la siguiente manera: Miller Unidades = (A420 * 1000) / (A600 * min * ml) A420: unidades de absorbancia a 420 nanómetros; A600: unidades de absorbancia a 600 nanómetros; min: el tiempo de reacción en minutos; ml: el volumen de reacción en ml

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En nuestro ensayo Y2H modificado, hemos identificado los residuos importantes para las interacciones ketoconazol sobre PXR 6. Desde SRC-1 es un coactivador (y se clonó en el vector de pGADNot), también a prueba si SRC-1 podría activar la expresión de lacZ cuando se clona en el sistema de vector PSH y si esto cambiaría el perfil de activación y / o afectar a la permeabilidad de el ensayo de dos híbridos de levadura. Uso de nuestros plásmidos rediseñados que llevamos a cabo dos ensayos de híbridos en ERG3</...

La levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo es ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína y, más recientemente, para el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que alteran los complejos proteína-proteína de interacción 7, 8, 9, 10, 11. Sin embargo, los enfoques convencionales de este ensayo, que se utiliza para la detección de drogas o &quot;hits&quot;, no permiten la detección de residuos de interacción alostéricos de compuestos químicos en las superficies de la proteína-proteína, que cuando se alteran aún interactuar y permitir el interrogatorio de los residuos alterados 11 . De hecho, un método (s) de tal manera, si es factible desarrollar, permitiría un sistema de levadura manejable para la evaluación de alto rendimiento de los residuos de interacción alostéricos críticos para la proteína-proteína interacción interrupción. En el contexto del descubrimiento de fármacos, la forma más directa para establecer la interacción de los compuestos con proteínas implicaría la determinación estructural (por ejemplo, cristalización del complejo de proteína-inhibidor). Estos métodos son cumbersome, utilizar los recursos elaborados y que no sea técnicamente factible realizar estudios estructurales de cada proteína. Sistemas de detección de drogas genética tratable se han establecido en las bacterias 1, 2 y otros sistemas modelo, como los mamíferos de dos híbridos. Sin embargo, estos sistemas necesitan optimización y sistemas alternativos como Y2H siguen siendo los más probado en el descubrimiento de fármacos. Hay limitaciones que incluyen poca sensibilidad y fiabilidad de las interacciones utilizando métodos singulares 13, sin embargo, un único ensayo Y2H puede ser modificado para responder a preguntas específicas respecto a los residuos de interacción. En el campo de la investigación de los receptores nucleares, Y2H se ha utilizado para definir las proteínas que interactúan 14, sin embargo, estas interacciones proteína rara vez se han utilizado para definir la naturaleza en el que los ligandos / antagonistas interactúan con complejos de proteína de receptor nuclear. Por lo tanto, nuestro laboratorio se centró esfuerzos en la definición de un método, especialmente para proteínas receptoras que no estánque se presta fácilmente a proteómicos métodos basados, eso sería desenterrar nuevo ligando / antagonista interactuar residuos utilizando una plataforma de descubrimiento Y2H basado inversa. Basándonos en nuestra anterior conclusión de que el ketoconazol altera PXR y su activador SRC-1, hemos desarrollado un novedoso sistema de reversa Y2H que nos permiten definir e interrogar a los residuos de ketoconazol interactuar en PXR 6. Nuestro método se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de levadura que consiste en dominios separables responsables de la activación de unión a ADN y la transcripción. La proteína PXR LBD se expresa como una fusión con el dominio de unión a ADN LexA (ADN-BD), mientras que la longitud total co-activadores SRC-1 (coactivador del receptor de esteroides 1) las proteínas se expresan como fusiones al dominio de activación de GAL4 (AD ). Interacción entre PXR y SRC-1 proteínas de fusión conduce a la activación transcripcional de los sitios de unión de GAL4-que contiene el gen reportero de β-Lac Z que está integrado en el Genom levadurae. Ketoconazol, un antagonista de PXR, interrumpe PXR y SRC-1 interacción 15, 16, 17 y que puede detectar la interacción de PXR y SRC-1 en presencia o ausencia de ketoconazol después de la tinción colonias sobre filtros para la actividad de X-gal. El principio de Y2H se ilustra en la Figura 1 y el procedimiento experimental se resume en la Figura 2.

<table><tbody><tr><td>Cepa de levadura CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Nuestra</td><td>levadura CTY10-5d de laboratorio fue doblemente eliminada ERG3 y ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) genes6 .</td><td></td></tr><tr><td>YPD Medio</td><td>de crecimiento BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Levadura Base de nitrógeno (YNB) sin aminoácidos y sulfato de amonio</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-LEU Mezcla completa de suplementos</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (O-nitrofenilo y beta;-D-galactopiranósido).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Salmón Sonicado Esperma ADN hervido (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketoconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 solución, esterilizada por filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulosa</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'nuestro</td> <td>laboratorio</td><td></td><td>PXR LBD imprimación directa para pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'nuestro</td> <td>laboratorio</td><td></td><td>PXR LBD imprimación inversa para pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'nuestro</td> <td>laboratorio</td><td></td><td>SRC-1 imprimación directa para pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'nuestro</td> <td>laboratorio</td><td></td><td>SRC-1 imprimación inversa para pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>nuestro laboratorio</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>nuestro laboratorio</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>nuestro laboratorio</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos receptor nuclear residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Como un regulador crítico de la inflamación y el metabolismo de fármacos, pregnano receptor X (PXR), juega un papel importante en la fisiopatología de la enfermedad que une el metabolismo y la inflamación (por ejemplo, la esteatosis hepática) 1,2. Ha habido muchos avances en la identificación de ligandos agonistas de PXR, sin embargo, hay descripciones limitadas de antagonistas similares a las drogas y sus sitios de unión en PXR 3,4,5. Un obstáculo fundamental ha sido la incapacidad para purificar eficientemente la proteína de longitud completa para estudios estructurales con antagonistas a pesar de que PXR se clonó y caracterizó en 1998. Nuestro laboratorio desarrolló una nueva levadura de alto rendimiento basado en dos híbridos de ensayo para definir un antagonista, ketoconazol de, residuos de unión en PXR 6. Nuestro método implica la creación de bibliotecas mutacionales que rescatar el efecto de mutaciones individuales en la superficie de AF-2 de PXR espera que interactúe con ketoconazol. Rescate o &quot;ganancia de función&quot; second mutaciones pueden realizarse de tal manera que las conclusiones relativas a la interacción genética de ketoconazol y el residuo (s) de superficie en PXR son factibles. Por lo tanto, hemos desarrollado una evaluación de la levadura de dos híbridos de alto rendimiento de mutantes PXR que interactúan con su coactivador, SRC-1. El uso de este enfoque, en el que se modificó la levadura para acomodar el estudio del fármaco antifúngico, ketoconazol, hemos podido demostrar mutaciones específicas en PXR enriquecidos en los clones incapaces de unirse al ketoconazol. Por lógica inversa, llegamos a la conclusión de que los residuos originales son residuos de la interacción directa con ketoconazol. Este ensayo representa una novela, ensayo genético manejable para detectar sitios de unión sobre las superficies antagonistas de receptores nucleares. Este ensayo podría aplicarse a cualquier fármaco, independientemente de su potencial citotóxico a la levadura, así como a la proteína (s) celular que no pueden ser estudiados utilizando la biología estructural estándar o métodos proteómicos basada. Peligros potenciales incluyen la interpretación de los datos (métodos complementarios de utilidad), relición en un solo método Y2H, experiencia en el manejo de la levadura o la realización de dos ensayos de híbridos de levadura, y la optimización del ensayo.

Se realizó un ensayo para ver si podíamos detectar una lectura colorimétrica de la asociación de PXR y receptor de esteroides coactivador-1 (SRC-1). Dado que la levadura tiene una producción significativa de esterol, que previamente se ha demostrado que la expresión de lacZ en la levadura puede ser inducida sin la necesidad de ligando exógeno adicional. Hemos encontrado que la expresión de lacZ (colonias azules) también es inducida en la cepa de levadura transformada con PXR y SRC-1, sin embargo, no hay inducción de la ...

El ketoconazol se une a y antagoniza pregnano X activación del receptor (PXR). De levadura de alto rendimiento pantallas de mutantes PXR definen una región única para la unión ketoconazol. Este método de genética de la levadura descubre la interacción del receptor nuclear novedosas con ligandos que se asocian con los sitios de unión de la superficie.

Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un ensayo de doble híbrido de levadura de alto rendimiento que revela interacciones entre el receptor de pregnano X o PXR y el inhibidor de molécula pequeña ketoconazol. Esto se logra primero mediante la construcción de los plásmidos de doble híbrido de levadura, uno que expresa el dominio de unión al ligando del PXR humano y el otro que expresa el coactivador del receptor esteroideo uno o SRC uno. La presencia de ketoconazol interrumpe la interacción del PXR humano con SRC uno, tal como se evidencia mediante ensayos líquidos de beta-galactosidasa.Junto con la selección colorimétrica de colonias en un filtro, el cribado de mutantes del PXR en presencia de ketoconazol permite identificar mutaciones que hacen que el receptor sea inmune a la acción del fármaco, lo que finalmente facilita la expresión laxa mediante inspección visual y los resultados del ensayo líquido de beta-galactosidasa. Los ensayos SASE se utilizan para mostrar cambios en la activación del PXR en presencia de ketoconazol, lo que permite identificar residuos originales implicados en la interacción. Tuvimos esta idea por primera vez en el laboratorio del Dr. Manny, donde soy asociado.Cuando nos enfrentamos con datos estructurales incompletos sobre PXR, las técnicas bioquímicas no nos permitieron realizar la identificación, especialmente para interacciones de tamaño muy reducido y no fácilmente modificables. Para la caracterización estructural. Basándonos en el principio de detección de mutantes de PXR resistentes a kiton, desarrollamos un método que será manejable, factible y que podría realizarse en cuestión de días de manera de muy alto rendimiento.Aunque este método puede proporcionar información sobre la fuerza farmacológica de unión de moléculas pequeñas a proteínas receptoras, también puede aplicarse a otros sistemas, como cualquier proteína que tenga un papel patogénico en una enfermedad, particularmente aquellas con limitaciones en los enfoques de biología estructural antes de la identificación preliminar de residuos de unión, para comprender y diseñar mejor interactores moleculares pequeños dirigidos. Para comenzar, amplifique el dominio de unión de ligandos del PXR humano y la SRC humana de longitud completa tal como se describe en el protocolo del texto. Verifique los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%.A continuación, purifique los productos de PCR a partir del gel de AROS. Diga los productos de PCR en dos vectores híbridos según se describe en el protocolo escrito y coloque las muestras de digestión en un baño de agua a 37 grados Celsius durante una hora. Purifique las muestras digeridas a partir de un gel de agarosa al 1%, luego ligue los productos de PCR digeridos y purificados con los dos vectores híbridos antes de transformarlos en células competentes DH cinco alfa, seguido de una incubación nocturna a 37 grados Celsius.Seleccione las colonias y aísle el ADN plasmídico; utilice digestión con enzimas de restricción para confirmar la presencia del vector y del inserto, y verifique todo el ADN plasmídico positivo mediante secuenciación. Inocule la cepa de levadura en cinco mililitros de YAPD e incube durante la noche con agitación constante a 220 rpm y 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, inocule la levadura en una proporción de 1 a 20 en cinco mililitros de YAPD e incube para obtener una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,2 mediante agitación constante.Centrifugar las células a 2000 RPM en una microcentrífuga durante dos minutos y desechar el sobrenadante. Luego lavar el sedimento dos veces con agua autoclave y una vez con acetato de litio 0,1 molar. Después de desechar el sobrenadante del último lavado, añadir los reactivos de transformación enumerados en el protocolo del texto al sedimento celular y mezclar mediante vortex. Luego agregue los vectores preparados que contienen PXR y que contienen SRC antes de mezclar. Nuevamente, aspire la mezcla de transformación con una pipeta y colóquela en un tubo de poliestireno de fondo redondo y agítela durante 30 minutos. Coloque el tubo en un baño de agua a 42 grados Celsius e incube durante 30 minutos adicionales.A continuación, centrifugue el tubo a 2000 RPM durante dos minutos tras la eliminación del sobrenadante. Lave el precipitado una vez con agua de autoclave, pipeteando 100 microlitros de agua estéril en el tubo y resuspendiendo las células mediante golpecitos suaves con el dedo y pipeteo. Luego, siembre las células en medio de selección sin histidina ni leucina e incube a 30 grados Celsius durante tres a cuatro días para aislar los transformantes.Para comenzar el ensayo con filtro Xga, corte un triángulo de una membrana de nitrocelulosa para que encaje en una porción de 10 milímetros de una placa de Petri. Etiquete la membrana de nitrocelulosa para marcar su orientación. Coloque la membrana de nitrocelulosa previamente marcada sobre las colonias de levadura asegurándose de que la membrana esté en contacto con la superficie del medio de la placa.Retire la membrana. Colóquela con el lado de las colonias hacia arriba sobre un papel filtro de tres milímetros y coloque la membrana junto con el papel filtro a menos 80 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, coloque dos círculos de papel filtro de tres milímetros en una placa de Petri y saturelos con cinco mililitros de solución xal.Deseche el exceso de tampón de la placa de Petri y coloque la membrana de nitrocelulosa en el recipiente con el lado de las colonias hacia arriba. Cierre la tapa asegurándose de que la membrana esté en contacto completo con el papel de filtro y esté completamente humedecida. Envuelva la placa de Petri con papel de aluminio e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos hasta toda la noche para hacer crecer las levaduras y eliminar el medio líquido sin histidina y leucina hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,7.Transfiera un mililitro de medio a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 3000 RPM durante dos minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue un mililitro de tampón Z al precipitado y centrifugue. Como antes, agregue 150 microlitros de tampón Z con mercaptoetanol para resuspender el precipitado celular.Luego, agregue 50 microlitros de cloroformo y 20 microlitros de SDS al 0,1% vigorosamente. Vortexee la muestra durante 15 segundos. A continuación, añada 700 microlitros de solución de ONPG, configure el temporizador e incube a 30 grados Celsius el tiempo suficiente para que se desarrolle el color amarillo.Una vez que se desarrolle el color, anote el tiempo total de reacción. Añada 500 microlitros de carbonato de sodio uno molar para detener la reacción. Luego, determine la absorbancia a 420 nanómetros.Como paso final, calcule las unidades Miller según se describe en el protocolo del texto. Dado que la levadura presenta una producción estéril significativa, la expresión de laxy en levadura puede inducirse sin necesidad de un ligando exógeno adicional. El ensayo xal lift reveló que la expresión de laxy, visualizada mediante las colonias azules, se induce en la cepa de levadura transformada con PXR y SRC uno.Esto también se observa en el ensayo líquido de beta-galactosidasa. Sin embargo, no hay inducción de la expresión de laxy en levaduras transformadas con los vectores vacíos PXR solo o SRC uno solo. La ketoconazol interrumpe las interacciones entre P XR y SRC uno en levaduras, ya que todas las colonias procedentes del filtro de réplica fueron blancas, lo cual también se evidenció mediante la actividad significativamente reducida de la beta-galactosidasa en ensayos enzimáticos líquidos.Cuando se realizaron transformaciones en levaduras con S rrc uno en el doble mutante P XR, se reveló que las colonias expuestas a la ketoconazol aún conservan la expresión de laxy. Esto es similar a estudios previos en este laboratorio que mostraron que el mismo PXR puede ser activado por un ligando potente, pero es inmune a los efectos antagonistas de la ketoconazol en ensayos mamíferos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un procedimiento cuidadoso y en dónde podría aplicarse el sistema híbrido AC, así como de las modificaciones necesarias para el estudio de residuos de unión a moléculas pequeñas en proteínas.Es fundamental recordar, al intentar este procedimiento, obtener una biblioteca altamente diversa de mutantes de su receptor, lograr una eficiencia de transformación adecuada en cada uno de los más de 200 clones, desarrollar réplicas casi idénticas del filtro montado con o sin fármacos, y finalmente realizar una inspección visual y química precisa para la detección de nasa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ácidos nucleicos 200a, proteínas precursoras de ácidos y modelos homólogos de acoplamiento iCal, con el fin de responder preguntas adicionales, como por ejemplo si al menos la flexión uc es aplicable a proteínas en células humanas. Y de ser así, si puede elaborarse un modelo que defienda estos residuos como un fármaco.

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Investigación

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Biología

MITO permite la detección sensible de las interacciones transitoria y estable entre las proteínas que se expresan en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Se ha aplicado con éxito para estudiar las proteínas integrales de membrana exógenos y la levadura con el fin de identificar a sus socios que interactúan de un modo de alto rendimiento.

Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.

Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

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Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero

Las interacciones de las biomoléculas, como las interacciones proteína-proteína, son la base molecular de las funciones biológicas. Si se pueden aislar mutantes nulos/deteriorados por interacción que carecen específicamente de la interacción relevante, serán de gran ayuda para comprender las funciones de esta interacción. Este artículo presenta una forma eficiente de aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción.

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Aplicación de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK y HEX loria para el diseño de proteínas De Novo e In Silico

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Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas (Video) | JoVE Journal

Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

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