La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

El objetivo general de este procedimiento es visualizar estructuras como la actina F en la sinapsis lítica de las células NK mediante microscopía TED. Esto se logra recapitulando primero la sinapsis en vidrio usando un anticuerpo activador. El segundo paso del procedimiento es fijar la permea y teñir las células para las estructuras de interés.

A continuación, se obtienen imágenes de los portaobjetos mediante microscopía confocal de barrido láser, seguida de la aplicación de agotamiento constante para aumentar la resolución de la imagen. El paso final es procesar las imágenes utilizando un algoritmo de deconvolución. En última instancia, los resultados pueden mostrar una resolución inferior a 100 nanómetros de las estructuras celulares gracias a la endoscopia y la endoscopia de doble color.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como la relación entre el citoesqueleto y la exocitosis. En nuestro caso, estamos interesados en la secreción de lisosomas especializados denominados gránulos líticos por las células asesinas naturales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque hay múltiples variables que se pueden ajustar en la aplicación del láser de depleción TED.

Una aplicación inapropiada del haz de agotamiento dará como resultado un empeoramiento en lugar de una mejora en la resolución En la preparación, caliente 30 mililitros de medios RPMI con 10%FCS y por separado. Un mililitro de BD CY efectos cyop permanente ambos a 37 grados centígrados. A continuación, comience el proceso de recubrir los cubreobjetos con anticuerpos.

Tome las hojas de cubierta número 1.5 y use un bolígrafo PAP. Haz cuadrados del tamaño de una moneda de diez centavos en las portadas. Prepare un cuadrado para cada condición probada.

Cargue cada círculo con 200 microlitros de anticuerpo a cinco microgramos por mililitro en PBS. Para la activación de las células NK 92, utilice anticuerpos anti CD 18 y anti NK P 30. Incubar las hojas de cubierta cargadas a 37 grados centígrados durante media hora, y luego lavarlas con un baño a temperatura ambiente, PBS procede inmediatamente con la adición de las celdas para cada condición probada, 500, 000 celdas deben estar listas para usar.

Lave las células en 10 mililitros de los medios precalentados y luego vuelva a suspenderlas en los mismos medios calentados. A 2,5 millones de células por mililitro con las células completamente en suspensión, decanta 200 microlitros en cada cuadrado de anticuerpo en la cubierta Los deslizamientos incuban los cubreobjetos con células a 37 grados Celsius con 5%CO2 en este caso. 20 minutos es tiempo suficiente para polarizar los gránulos en las células NK después del lavado de incubación, la cubierta se desliza suavemente en PBS a temperatura ambiente.

Comience agregando un microlitro de TRITTON X 100 a un mililitro de solución tibia de citopermanente BD CY effects. Luego vórtice. Aplique 200 microlitros de esta solución a cada cuadrado de condición en los cubreobjetos.

Luego coloque las celdas en la oscuridad a temperatura ambiente y espere 10 minutos. Cuando termine la incubación, lave suavemente los cubreobjetos con tampón para manchas. A continuación, seque los bordes de las regiones rodeadas con un bastoncillo de algodón.

A continuación, agregue 200 microlitros del anticuerpo primario en el tampón de tinción a las regiones circundantes y deje que los cubreobjetos se incuben en la oscuridad durante media hora. Algunos buenos anticuerpos secundarios para la obtención de imágenes stead incluyen Alexa floor 4, 88 Pacific orange y Horizon V 500. Cada uno de estos funciona bien en una dilución de uno a 200.

Después del lavado de la incubación, la cubierta se desliza en las manchas, tamponlas y séquelas. Al igual que antes, aplique 200 microlitros del anticuerpo secundario en cada cuadrado de condición. Luego déjelos reposar en la oscuridad durante otros 30 minutos.

En este punto, es posible agregar anticuerpos adicionales después de lavados adicionales. Por ejemplo, Phin se puede aplicar de uno a 200 para detectar factina. Para un medio de montaje, elija prolongar sobre el escudo vectorial, que no es compatible con stead.

Si se utiliza la tinción de phin, evite usar dos dos tio etanol, mientras que sin embargo está bien, ahora aplique de 10 a 20 microlitros de medio de montaje a un portaobjetos. Con el cubreobjetos invertido, bájelo suavemente en el medio, evitando las burbujas de aire. A continuación, incubar el portaobjetos durante 24 horas.

Con la funda, colóquela al día siguiente, selle la funda con esmalte de uñas y proceda con la toma de imágenes. Ponga en marcha los láseres y el software. El láser de agotamiento de posición debe calentarse al 100% de potencia y estar alineado.

Con el ocular, concéntrese en la muestra y, a continuación, diríjase al software. Escanea el primer canal, el que tiene la longitud de onda más larga. Piso cuatro, optimice la potencia del láser, la posición del haz de excitación y el alcance del detector.

Evite establecer por encima de 100. A continuación, capture una imagen confocal y compruebe si hay píxeles. La saturación, la línea y el promedio de fotogramas mejorarán la resolución de píxeles.

El objetivo es estar por debajo de los 30 nanómetros por píxel. Algo de saturación es aceptable para el lugar. A continuación, aplique el haz de agotamiento de posición al 50% de potencia y capture una imagen.

Si la resolución mejora, se puede aplicar más potencia. Además, ajustar la potencia del láser de excitación o el promedio de la línea o la ganancia también podría mejorar la resolución. Para reducir el fondo, aplique 0,3 nanosegundos de control de tiempo y ajuste hacia arriba.

La nueva resolución debe estimarse utilizando un cálculo máximo de medio ancho completo. Una vez satisfecho, repita estos pasos con el segundo canal cuando todos los canales estén ajustados. Compruebe la superposición espectral mediante la obtención de imágenes de controles de tinción única con todas las secuencias de exploración.

La superposición leve se puede corregir con la desmezcla espectral por el software, pero es mejor evitarla o mantenerla al mínimo. Ahora, adquiera imágenes para obtener imágenes cuantitativas. Obtener al menos 20 imágenes por condición de acuerdo con las condiciones experimentales.

Para devolver las imágenes guardadas, abra los archivos en el software adecuado. Verifique los parámetros de cada canal, específicamente los espectros de excitación y admisión, la emisión de agotamiento constante y la dirección de la imagen. A continuación, aplique los cálculos de deconvolución del software.

Los ajustes predeterminados suelen ser suficientes, pero la señal a ruido variará según la fuerza del suelo, por lo que ese parámetro debe establecerse manualmente para el experimento. Hay algunos errores comunes que pueden conducir a una resolución subóptima con stead. Uno de ellos es el submuestreo.

Esto conduce a la granulosidad y a la pérdida de información de los píxeles, como en estos filamentos de fractina. El aumento del promedio de línea o fotograma a menudo soluciona este problema. Otro problema es el blanqueo o sobremuestreo causado por píxeles largos.

El tiempo de permanencia, generalmente debido a un promedio excesivo de líneas sobre el escaneo antes de la adquisición de imágenes, también puede ser el culpable y se puede corregir usando un escaneo más pequeño antes de adquirir imágenes o usando una velocidad de escaneo más alta. Reducir la potencia del láser también puede ayudar a que todo funcione. La imagen mejorará drásticamente.

La deconvolución mejorará aún más la imagen. Tanto cuantitativa como cualitativamente. Se debe obtener una resolución inferior a 100 nanómetros de forma rutinaria mientras se intenta este procedimiento.

Es importante recordar realizar la alineación de la viga fija antes de cada experimento y aproximadamente una vez por hora a partir de entonces siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis cuantitativo, para responder a preguntas adicionales sobre la colocalización, la localización subcelular y las interacciones moleculares.