Name: Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a medir el flujo sanguíneo retiniano en ratones mediante videomicroscopía intravital con microesferas fluorescentes. Este protocolo permite cuantificar diámetros vasculares y velocidades sanguíneas con precisión.

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Financiado por NIH EY017599 (NRH).

Los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de LSUHSC-S y realizados de acuerdo con los criterios descritos por los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación de soluciones de perfusión
<ol>
	<li>Sonicar una solución madre al 1% (en peso) de microesferas de 1,9 μm de diámetro.</li>
	<li>Extraiga ~ 25-30 x 106 microesferas fluorescentes verdes (es decir, ~ 10 μl de la solución madre) en una jeringa de 300 μl. Diluya las microesferas retirando 240 μl adicionales de solución salina en la jeringa.</li>
	<li>Prepare una solución de 50 μl de dextrano fluorescente de peso molecular 2 x 106 disuelto en solución salina estéril, con la dosis inyectada en el rango de 3-10 mg/kg. Mantenga el dextrano cubierto con papel de aluminio hasta el momento de su infusión.</li>
</ol>
2. Anestesia Animal y Canulación Vascular
<ol>
	<li>Anestesiar al animal para la inserción quirúrgica de cánulas vasculares y para su posicionamiento estacionario bajo un objetivo de microscopio. Existen muchas opciones de protocolos anestésicos, con diversas ventajas y desventajas, y efectos potenciales sobre los parámetros sistémicos. Entre las muchas opciones diferentes se encuentran una combinación de ketamina (100-150 mg/kg), xilacina (10 mg/kg) y acepromazina (2 mg/kg), o una combinación de ketamina (50 mg/kg) y pentobarbital (50 mg/kg). Los procedimientos descritos son agudos y concluyen con eutanasia inducida por una sobredosis de pentobarbital (150 mg/kg) seguida de una toracotomía; La inclusión de un analgésico no es necesaria para el procedimiento terminal.</li>
	<li>Mantenga una almohadilla térmica debajo del animal durante el resto del experimento.</li>
	<li>Mantenga los ojos húmedos con solución salina tamponada con fosfato durante las inserciones quirúrgicas posteriores de las cánulas vasculares.</li>
	<li>Preparar una cánula vascular para las infusiones posteriores de trazadores fluorescentes. En la punta de una aguja de jeringa se coloca un tubo de polietileno de 20 cm de longitud (por ejemplo, 0,28 mm de diámetro interior; 0,61 mm de diámetro exterior), con el extremo afilado de la aguja roto previamente doblándolo hacia adelante y hacia atrás con un hemostático.</li>
	<li>Llene una jeringa y un tubo con solución salina heparinizada (25 U/ml).</li>
	<li>Afeita un lado de la parte inferior del abdomen y haz una incisión para exponer la vena femoral.</li>
	<li>Para canular la vena femoral, ate el vaso con una sutura 5.0, haga una incisión parcial del vaso (aproximadamente la mitad del diámetro del vaso) e inserte el tubo en el vaso, asegurando el tubo con la sutura atada alrededor de la sección canulada.</li>
</ol>
3. Preparación para la microscopía intravital
<ol>
	<li>Dilatar la pupila del ojo con una gota de solución oftálmica de tropicamida al 1% seguida de una gota de solución oftálmica de hipromelosa al 2,5%.</li>
	<li>Cubra el ojo con un cubreobjetos de vidrio de 5 mm.</li>
	<li>Coloque al animal en un tablero de plexiglás, que se colocará debajo del objetivo del microscopio de un microscopio vertical. Coloque estratégicamente la gasa quirúrgica debajo de la cabeza para permitir un eje directo a través del objetivo hasta la retina central y el disco óptico.</li>
	<li>Enfoque a través del microscopio en el disco óptico, encontrando el disco con un objetivo 4X de baja potencia y usando un filtro de fluoresceína.</li>
</ol>
4. Infusión de microesferas fluorescentes para medir velocidades
<ol>
	<li>Usando un objetivo 4X, concéntrese en la retina con el disco óptico en el centro del campo de visión.</li>
	<li>Infundir la solución de microesferas fluorescentes a una velocidad de 250 μl/min/kg.</li>
	<li>Grabe en video la retina visible alrededor del disco óptico, utilizando un tiempo de exposición de la cámara de ~ 8 mseg.</li>
	<li>Detenga la infusión de microesferas cuando se haya grabado una duración suficiente de video (1-2 min); es probable que alguna solución de microesferas permanezca sin usar.</li>
</ol>
5. Infusión de un marcador de plasma fluorescente para medir diámetros
<ol>
	<li>Usando un objetivo 4X, concéntrese en la retina con el disco óptico en el centro del campo de visión.</li>
	<li>Infundir la solución preparada de dextrano fluorescente en la vena femoral como un bolo durante ~ 5 segundos, mientras graba el video. Este video ayudará a determinar la identidad de las arteriolas frente a las vénulas, y primero se perfundirán las arteriolas. Realice este paso con el tiempo de exposición de la cámara establecido en ~8 mseg, aunque el tiempo de exposición preciso no es crítico.</li>
	<li>Cambie a un objetivo de 10X y un tiempo de exposición de 20-40 mseg para mejorar la resolución y grabar en video cada una de las 4-7 arteriolas y 4-7 vénulas en la retina superficial. Enfoque (y grabe en vídeo) aproximadamente un cuadrante de la retina visible a la vez, con el centro del disco óptico en una esquina del campo de visión. Se debe intentar minimizar el tiempo que la luz del microscopio ilumina el tejido para reducir la posibilidad de fototoxicidad inducida por la luz/colorante17.</li>
</ol>
6. Análisis de video
<ol>
	<li>Con una escala micrométrica, calibre el sistema de vídeo para obtener una conversión de μm/píxel.</li>
	<li>Con el software de procesamiento de imágenes, reproduzca el video grabado.</li>
	<li>A partir del video de la infusión en bolo de dextrano fluorescente, identifique las arteriolas frente a las vénulas.</li>
	<li>Para cada una de las 4-7 arteriolas y 4-7 vénulas registradas con el objetivo 10X, se midan los diámetros llenos de dextrano fluorescente, con un promedio de 5 medidas de diámetro por vaso a lo largo de la longitud visible.</li>
	<li>Para cada una de las mismas arteriolas y vénulas, se mida la longitud de las microesferas fluorescentes, utilizando 10 estrías de microesferas sucesivas en cada vaso para evitar el sesgo de selección. Divida las longitudes de las rayas por el tiempo de exposición para calcular la velocidad de la microesfera, por ejemplo, 160 μm/8 mseg = 20 μm/mseg = 2 cm/seg. Promedie las 10 velocidades por embarcación.</li>
	<li>Calcule el caudal volumétrico para cada recipiente con la siguiente ecuación: flujo = velocidad media × π × diámetro2/4.</li>
	<li>Suma las tasas de flujo arteriolar, y por separado las tasas de flujo venular, para obtener el flujo sanguíneo total de la retina.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta técnica de videomicroscopía intravital se puede aplicar no solo a ratones, sino también a ratas. Este protocolo se basa solo en varios supuestos, pero se limita a su uso bajo anestesia y con dilatación de la pupila como lo hemos descrito. Los otros supuestos y limitaciones son los siguientes:
1. Suposición de un error de aumento óptico mínimo resultante de la naturaleza refractiva del ojo. Como lo describen otros18-20, el método de llenar el espacio entre la cór...

La retina es uno de los tejidos metabólicamente más activos del cuerpo y, en consecuencia, requiere un generoso suministro de sangre. Dos circulaciones separadas satisfacen esta demanda: la circulación coroidea para la porción externa de la retina y la circulación retiniana para la porción interna de la retina. Las investigaciones de la perfusión retiniana son imprescindibles para comprender los mecanismos patológicos y las consecuencias de la retinopatía diabética, la retinopatía inducida por oxígeno, la oclusión de arterias o venas retinianas y el accidente cerebrovascular. Se han empleado varios métodos para cuantificar el flujo sanguíneo de la retina, y cada técnica tiene sus ventajas, desventajas, limitaciones y suposiciones. Entre estas técnicas se encuentran la infusión de microesferas de 7-8 μm de diámetro que se alojan en las arteriolas precapilares1,2, la autorradiografía cuantitativa3,4, la microangiopatía óptica-tomografía de coherencia óptica5,6, la resonancia magnética7,8 y la videomicroscopía intravital9-16. Las ventajas de este último incluyen la visualización directa en vivo de los vasos y el flujo de la retina, la dependencia de solo unas pocas suposiciones menores y la asequibilidad para los laboratorios que tienen un microscopio de fluorescencia con una cámara de video conectada. En estudios previos de videomicroscopía intravital9-16, el dextrano fluorescente se ha utilizado como marcador plasmático, y los glóbulos rojos marcados con fluorescencia (de un animal donante) se han utilizado como marcadores de velocidad. En el protocolo actual, se utilizan microesferas marcadas con fluorescencia de 1,9 μm de diámetro, en lugar de glóbulos rojos, para medir la velocidad, y esta alteración elimina la necesidad de un donante de células sanguíneas.

<table><tbody><tr><td>Microesferas fluorescentes</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (verde)</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td> <td>fluorescentes de dextrano de alto peso molecular</td><td>D-7137 (verde); D-7139 (rojo)</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + accesorios objetivo</td><td></td></tr><tr><td>4X</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>apertura numérica 0,13; distancia de trabajo 17,2 mm</td></tr> objetivo <tr><td>10X</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>apertura numérica 0,25; distancia de</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>trabajo 10,5 mm Tropicamida solución oftálmica Bausch Lomb 1% TropicamidaSolución oftálmica de hipromelosa</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2.5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>Universidad de California San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de video digital para microscopía</td><td>Fotometría</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 pixel resolución; tamaño de píxel 6,45 x 6,45 &mu; m</td></tr></tbody></table>

mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Las alteraciones en el flujo sanguíneo de la retina pueden contribuir a, o ser consecuencia de, la enfermedad ocular y la disfunción visual. Por lo tanto, la cuantificación de la perfusión alterada puede ayudar a la investigación de los mecanismos de las patologías de la retina. La videomicroscopía intravital de trazadores fluorescentes se puede utilizar para medir los diámetros vasculares y las velocidades del torrente sanguíneo de la vasculatura de la retina, específicamente de las arteriolas que se ramifican desde la arteria central de la retina y de las vénulas que conducen a la vena central de la retina. Las tasas de flujo sanguíneo se pueden calcular a partir de los diámetros y las velocidades, con la suma del flujo arteriolar y el flujo venular por separado, proporcionando valores del flujo sanguíneo total de la retina. Este artículo y el video asociado describen los métodos para aplicar esta técnica a ratones, que incluyen 1) la preparación del ojo para la microscopía intravital del animal anestesiado, 2) la infusión intravenosa de microesferas fluorescentes para medir la velocidad del torrente sanguíneo, 3) la infusión intravenosa de un dextrano fluorescente de alto peso molecular, para ayudar a la visualización microscópica de la microvasculatura de la retina, 4) el uso de una cámara microscópica digital para obtener videos de la retina perfundida, y 5) el uso de software de procesamiento de imágenes para analizar el video. Las mismas técnicas se pueden utilizar para medir las tasas de flujo sanguíneo de la retina en ratas.

Figura 1 muestra cuadros individuales de un video procedente de un experimento, con los paneles A-D y F-I que muestran trazos de microesferas fluorescentes capturados con un objetivo de 4X&#160;y un tiempo de exposición de 8 ms (y agrupación de píxeles 2 x&#160;2 para reducir el tamaño del archivo de video). Figura 1E muestra la orientación de los vasos retinianos en los otros paneles de la figura. No todos los cuadros del video tendrán un trazo fluorescente enfocado; sin embargo, alguno...

La microscopía intravital se puede utilizar en animales para visualizar y medir los diámetros vasculares de la retina, las velocidades del torrente sanguíneo y el flujo sanguíneo total de la retina.

Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

El objetivo general de este procedimiento es medir el flujo sanguíneo de la retina en ratones. Esto se logra primero infundiendo microesferas fluorescentes a través de la vena femoral canulada de un ratón anestesiado. El segundo paso es grabar en vídeo las microesferas que fluyen a través de los vasos retinianos del ratón.A continuación, infunda dextrano fluorescente a través de la vena femoral y capture el vídeo a medida que fluye a través de los vasos de la retina. El paso final es medir las velocidades de las microesferas y los diámetros de los vasos a partir de los videos grabados para calcular el flujo sanguíneo de la retina. Una de las principales ventajas de esta técnica es la capacidad de medir con precisión el flujo sanguíneo de la retina utilizando un microscopio de fluorescencia estándar.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la retina, como el grado en que los cambios en el flujo sanguíneo contribuyen a la retinopatía diabética. Aunque vamos a demostrar esta técnica en la retina de un ratón. El método general se puede utilizar en otros tejidos y también en ratas.Sonicate, una solución al 1% de microesferas de 1,9 micras de diámetro, extraiga

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Mediciones de microscopía de video intravital del flujo sanguíneo retiniano en ratones

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

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Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

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Este artículo informa sobre un método detallado para la medición dinámica y cuantificación de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales de la vasculatura hepática del ratón utilizando imágenes de microscopía intravital en combinación con una metodología específica para la adquisición y análisis de imágenes.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Las imágenes de células vivas de las células sanguíneas etiquetadas en la circulación ocular pueden proporcionar información sobre la inflamación y la isquemia en la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Se describe un protocolo para etiquetar células sanguíneas e imágenes de las células marcadas en la circulación retiniana.

Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón

Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Un enfoque de ventana de vaso abierto utilizando trazadores fluorescentes proporciona una resolución suficiente para la medición del flujo sanguíneo coclear (CoBF). El método facilita el estudio de los cambios estructurales y funcionales en CoBF en ratón en condiciones normales y patológicas.

Medición del flujo sanguíneo auricular en cóclea de ratón utilizando una ventana de vaso abierto y microscopía de fluorescencia intravital

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

La vasculatura de la retina del ratón es particularmente interesante para comprender los mecanismos de formación de patrones vasculares. Este protocolo mide automáticamente el diámetro de los vasos de la retina del ratón a partir de imágenes de fondo de ojo de angiografía fluorescente a una distancia fija del disco óptico.

Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

Aprenda a medir el flujo sanguíneo retiniano en ratones mediante videomicroscopía intravital con microesferas fluorescentes. Este protocolo permite cuantificar diámetros vasculares y velocidades sanguíneas con precisión.

Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

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