Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga
11 de febrero de 2014
La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.
El objetivo general de este procedimiento es crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga de una manera rápida, precisa y mínimamente invasiva. Esto se logra expandiendo primero la línea celular tumoral particular y la suspensión de las células tumorales en Matrigel. A continuación, se monta el animal en la plataforma de imágenes y se visualiza la vejiga con ecografía.
A continuación, se separan las capas mucosas y musculares de la vejiga con una inyección de solución salina. Finalmente, la suspensión de matrigel de células tumorales se inyecta en este espacio creado artificialmente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento tumoral a través de imágenes de ultrasonido y bioluminiscencia.
La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como el uso de la laparotomía para la inoculación de xenoinjertos primarios, es que este abordaje es rápido, preciso y mínimamente invasivo. Las implicaciones de estas técnicas se extienden al diagnóstico y tratamiento del cáncer de vejiga, ya que los autoxenoinjertos son el estándar de oro para el estudio preclínico de nuevos tratamientos. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de inyección son bastante difíciles de aprender, y el agua es muy delgada, la demostración de este procedimiento será.
Igor Mosca tiene un asistente de investigación y Wolfgang Yeager, un becario postdoctoral. Ambos son urólogos después de confirmar la identidad de las respectivas líneas celulares de cáncer de vejiga humana. Para este estudio a través de la huella dactilar del ADN, se utilizó una construcción lentiviral que lleva el gen de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga para el análisis del crecimiento por bioluminiscencia de tumores de xenoinjertos para transfectar las líneas celulares.
Cuando esté listo para comenzar el procedimiento, descongele y use DMEM con 10% de FBS para expandir las líneas celulares existentes, incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Para preparar una suspensión celular para la inyección después de descongelar, matrigel, y mantener en hielo los ojos de tripsina, 70% de las células de confluencia y use un medio de crecimiento normal para suspender, luego cuente las células y gire la suspensión a 200 veces G durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante, agregue la cantidad adecuada de volúmenes iguales de D-M-E-M-F-B-S y MATRIGEL para alcanzar la concentración celular deseada para inyectar un volumen de 40 microlitros por animal.
Mezcle bien y evite crear burbujas de aire con cualquier tipo de material plástico plano y rígido. Corte un estabilizador de vejiga, inspeccione cuidadosamente la correa y retire los bordes afilados antes de aplicarlo a los ratones. Después de anestesiar ratones hembra con 3% de isoflurano en oxígeno y realizar un pellizco en el dedo del pie.
Para garantizar una sedación adecuada, monte al animal en la mesa de imágenes de calefacción de la plataforma de imágenes para animales pequeños, monitoreando continuamente sus signos vitales con una banda elástica. Fije las extremidades inferiores y use gluconato de clorhexidina al 0,5% para desinfectar el abdomen antes de usar una punta de algodón estéril para limpiar la piel. A continuación, utilizando la correa de estabilización de la vejiga, inmovilice la vejiga para evitar una evasión de la misma durante la inyección intramural.
A continuación, aplique un gel de ultrasonido estéril en la parte inferior del abdomen. Avance lentamente la ecografía, diríjase a la piel y visualice la vejiga en la pantalla de la ecografía. Si la vejiga está vacía, use 50 microlitros de PBS tibio en un catéter angioico transuretral de calibre 24 para llenarla y separar las capas de la pared de la vejiga.
Comience colocando una jeringa de 1.0 mililitro llena de PBS y conectada a una aguja de tres cuartos de pulgada de calibre 30 a la pinza de la jeringa. Coloque la aguja hacia la piel, justo por encima del hueso púbico. En un ángulo de 30 a 45 grados, detecte la aguja en la pantalla de ultrasonido antes de perforar lentamente la piel y los músculos de la pared abdominal.
A continuación, gire el bisel de la aguja 180 grados para que quede orientado hacia atrás e inserte la punta de la aguja en la pared de la vejiga sin penetrar en la mucosa. Luego, para crear un espacio artificial, inyecte lentamente 50 microlitros de PBS entre la capa muscular y la mucosa antes de retirar la aguja. Para inyectar células cancerosas de vejiga, conecte una segunda jeringa de 1.0 mililitro llena con la suspensión de matrigel de células cancerosas y una aguja de tres cuartos de pulgada de calibre 30 a la pinza de la jeringa.
Guíe la punta de la aguja hasta el espacio lleno de PBS. Acaba de crear e inyectar 40 microlitros de la suspensión en el espacio. A continuación, retire la aguja después de desmontar el ratón de la plataforma de imágenes.
Manténgalo en un ambiente cálido y cómodo bajo monitoreo continuo. Después de recuperar la conciencia y la deambulación normal, vuelva a colocar al animal en su jaula de origen. Se realizó la inyección intramural de tres líneas celulares tumorales diferentes en 50 animales bajo guía ecográfica durante tres días consecutivos.
La inoculación se realizó de manera eficiente y no se asoció con complicaciones intra o post intervencionistas. El seguimiento del crecimiento tumoral se realizó mediante ecografía y bioluminiscencia. Al tercer día, se pudo detectar un tumor mediante ecografía en la vejiga anterior de los 50 animales, y el 98% de los ratones mostraron un crecimiento tumoral constante durante el período de seguimiento después de la inoculación de la uc. Tres.
Luke, un ratón desarrolló diseminación tumoral intraperitoneal y el tumor involucionó después del séptimo día en un segundo animal. Este fue el primer grupo de ratones inoculados con esta nueva técnica después de la inoculación de uc. Tres. Lucas uc, un tal Lucas, y uc.
13 Lucas. Los ratones fueron sacrificados los días 24, 28 y 37 respectivamente. Los tumores de xenoinjerto se extrajeron y examinaron mediante secciones h y d.
Todos los tumores fueron músculo invasivos y algunos infiltrados en la grasa per visceral, pero no se observó invasión a los órganos adyacentes. 60% de la CU, 13 Lucas y 20% de la CU. Tres ratones portadores de tumores Luke desarrollaron metástasis en los ganglios linfáticos retroperitoneales, que se confirmaron mediante tinción h y e.
Una vez dominado, esta técnica se puede realizar en tres minutos. La familiaridad con las imágenes de ultrasonido es un requisito previo para realizar este procedimiento Después de que los tumores se han inoculado de esta manera, la ecografía nos permite no solo monitorear el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo y también observar la perfusión tumoral con microburbujas. También nos permite realizar inyecciones intratumorales con nuevos agentes experimentales.
Descripción general
Este artículo presenta una técnica novedosa y mínimamente invasiva para crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga utilizando guía por ultrasonido. El método tiene como objetivo reducir la morbilidad asociada con los procedimientos tradicionales de laparotomía, al tiempo que garantiza una inoculación rápida y precisa de células tumorales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Urología
- Imagen biomédica
Antecedentes
- Los métodos tradicionales para la inoculación de xenoinjertos de cáncer de vejiga implican laparotomía, un procedimiento técnicamente difícil y que consume mucho tiempo.
- Estos procedimientos pueden provocar una morbilidad significativa en los modelos animales.
- La guía por ultrasonido ofrece una solución potencial para un enfoque más eficiente.
- Los autoxenoinjertos son fundamentales para estudios preclínicos de tratamientos novedosos contra el cáncer de vejiga.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y preciso para crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga.
- Minimizar la invasividad y mejorar el bienestar general de los animales de investigación.
- Facilitar el monitoreo del crecimiento tumoral mediante imágenes por ultrasonido y bioluminiscencia.
Métodos Utilizados
- Amplificación de líneas celulares tumorales y preparación de una suspensión celular en Matrigel.
- Visualización ecográfica de la vejiga y separación de sus capas mediante inyección de suero salino.
- Administración de la suspensión de células tumorales en el espacio creado dentro de la vejiga.
- Seguimiento del crecimiento tumoral mediante imágenes ecográficas y análisis de bioluminiscencia.
Resultados principales
- La nueva técnica se realizó con éxito en 50 animales sin complicaciones intraoperatorias ni postoperatorias.
- El crecimiento tumoral se detectó en todos los animales mediante ultrasonido al tercer día.
- El 98 % de los ratones presentó crecimiento tumoral continuo durante el seguimiento.
- El examen histológico confirmó la invasión muscular y algunas metástasis en ganglios linfáticos.
Conclusiones
- El método percutáneo guiado por ultrasonido es eficiente y minimiza el sufrimiento animal.
- Es fundamental tener experiencia en imágenes por ultrasonido para llevar a cabo el procedimiento con éxito.
- Esta técnica permite la monitorización continua de la dinámica tumoral y las respuestas al tratamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica mínimamente invasiva guiada por ultrasonido aborda un cuello de botella crítico en el desarrollo de modelos preclínicos de cáncer de vejiga al reducir la complejidad del procedimiento y la morbilidad animal. Permite un establecimiento rápido y reproducible de xenoinjertos ortotópicos, apoyando tuberías eficientes de validación de dianas y cribado terapéutico. El enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar un sistema de modelo ortotópico clínicamente relevante para la reducción de riesgos mecanicistas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en un microentorno ortotópico que conserva las interacciones entre el tumor y el estroma.
- Valor operativo: Reduce el tiempo y las barreras técnicas para el establecimiento del modelo, acelerando los ciclos de prueba de hipótesis.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la generación de modelos con fenotipos invasivos musculares y potencial metastásico observados en la enfermedad humana.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera señales cuantificables de crecimiento tumoral mediante bioluminiscencia y ultrasonido para la evaluación de respuesta a dosis y cribado de agentes.
- Valor operativo: Estandariza el inicio de xenoinjertos entre diferentes operadores y estudios mediante precisión guiada por imagen.
- Escalabilidad: Permite la inoculación de alto rendimiento debido al breve tiempo del procedimiento (~3 minutos tras la capacitación) y a las bajas tasas de complicaciones.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la fidelidad histopatológica al cáncer de vejiga humano, incluyendo la invasión muscular y la metástasis en ganglios linfáticos.
- Valor operativo: Facilita el monitoreo longitudinal de la dinámica tumoral y la respuesta al tratamiento mediante modalidades de imagen integradas.
- Continuidad traslacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al proporcionar una plataforma confiable para evaluar nuevos agentes in vivo.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la validación temprana del blanco y la evaluación de compuestos líder en un contexto fisiológicamente relevante.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación funcional del blanco mediante el análisis del crecimiento tumoral ortotópico y la modulación de vías.
- Selección: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles de establecimiento y crecimiento tumoral, esenciales para la preparación del ensayo.
- Análisis: Genera datos longitudinales de bioluminiscencia y ecografía para la evaluación comparativa de condiciones e índice terapéutico.
- Investigación Traducional: Se alinea con la validación preclínica mediante la modelización del crecimiento invasivo y la diseminación metastásica relevantes para la progresión clínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable para la generación de xenoinjertos de cáncer de vejiga en diversos proyectos y equipos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la variabilidad del modelo y mejorar la relevancia biológica de los xenoinjertos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y el rendimiento mediante la guía por ultrasonido y la preparación estandarizada de células.
- Valor estratégico: Permite decisiones más rápidas de avance o interrupción al reducir el tiempo hasta la obtención de datos y minimizar el fracaso del modelo debido a la morbilidad procedimental.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar modelos consistentes y con capacidad metastásica para la evaluación de eficacia y seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de inyección estéril y en imágenes por ultrasonido en pequeños animales.
- Depende del acceso a sistemas de ultrasonido de alta frecuencia y capacidades de imagen por bioluminiscencia.
- Necesita la preparación estandarizada de líneas celulares en suspensión de Matrigel para asegurar una calidad constante del inóculo.
- Implica capacitación y desarrollo de pericia para lograr tiempos de procedimiento inferiores a tres minutos y minimizar la variabilidad técnica.
- Se limita a huéspedes inmunocomprometidos (por ejemplo, ratones desnudos atímicos) para la propagación de xenoinjertos humanos, como se indica en el estudio.
