Name: Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga en ratones mediante técnica mínimamente invasiva guiada por ultrasonido. Este método reduce la morbilidad y permite monitorear el crecimiento tumoral con precisión.

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Los autores desean agradecer Eliana Beraldi para llevar a cabo la transducción viral de líneas celulares tumorales y Ben Deeley para su instrucción en el uso de la pequeña plataforma de imágenes de ultrasonido animal. Este proyecto fue apoyado por el Sistema Fundación Alemana (DFG; JA 2117/1-1: 1), el Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer y un Premio Científico Mentored Médico de Vancouver Coastal Health Research Institute. La plataforma de imágenes de ultrasonido fue financiado por la Fundación Canadiense para la Innovación.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de British Columbia (Número Protocolo: A10-0192). 1. Preparación de Líneas Celulares <ol><li> Confirmar la identidad de las respectivas líneas celulares de cáncer de vejiga humano de la huella de ADN 7. </li><li> Para el análisis de crecimiento de tumores de xenoinjertos por bioluminiscencia, transfectar líneas celulares con un constructo lentiviral que porta el gen de luciferasa de luciérnaga 3. </li><li> Descongelar y ampliar las líneas de células existentes en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en un 5% de CO 2 humidificado ambiente. Pasaje de las células, al menos 3 veces, pero evitar tiempos de cultivo superiores a 3 meses. </li></ol> 2. Preparación de suspensión celular <ol><li> Descongele Matrigel. Mantener la temperatura por debajo4 ° C para evitar el aumento de viscosidad del gel. </li><li> Tripsinizar las células a una confluencia de 70% y suspender en medio de cultivo normal. </li><li> Contar el número de células con un hemocitómetro o un contador automático de células. </li><li> Girar la suspensión de células durante 5 min a 200 x g. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir el volumen apropiado de DMEM (10% de FBS) y Matrigel (proporción de 1:1) con el fin de llegar a la concentración celular deseada, que depende de la línea celular utilizada y la cinética de crecimiento deseados (8-15 x 10 6 / ml). El volumen inyectado de la suspensión de células tumorales será de 40 l. </li><li> Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y abajo (P1000), evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión. </li></ol> 3. Preparación de los animales Nota: Debido a la posible necesidad de cateterismo transuretral en el paso 4.7, ratones hembras son el género preferido en este modelo animal. <ol><li> Los ratones de acuerdo con la gu institucional y nacional de atención de animalesidelines. Obtener la aprobación del comité de ética para todos los experimentos con ratones. </li><li> Anestesiar a los ratones con 3% de mezcla de isoflurano / oxígeno. Confirmar anestesia adecuado de los animales (por ejemplo, la falta de respuesta a pellizcos del dedo del pie). </li></ol> 4. Configuración Experimental <ol><li> Cortar la estabilización de la vejiga a partir de cualquier tipo de material plástico rígido plana [Figura 2 I]. Inspeccione cuidadosamente la correa y eliminar los bordes afilados antes de su aplicación a los ratones. </li><li> Montar el animal en la mesa de formación de imágenes climatizada [Figura 1 I] de la pequeña plataforma de imágenes animal con un seguimiento continuo de los signos vitales. Fijar los miembros inferiores con una banda de goma [Figura 1 III]. </li><li> Desinfectar el abdomen con un 2% de gluconato de clorhexidina y limpie la piel con una punta de algodón estéril. </li><li> Inmovilizar la vejiga con la correa de la estabilización de la vejiga [Figura 2 II]. Por lo tanto, una evasiónde la vejiga durante la inyección intramural en el paso 5.6 se evitará. </li><li> Aplicar gel de ultrasonido estéril a la parte inferior del abdomen. </li><li> Poco a poco acercarse a la cabeza de exploración de ultrasonido (frecuencia de 40 MHz) [Figura 1 IV] a la piel (longitudinal con un ángulo de 45-70 ° craneal) y visualizar la vejiga en la pantalla de ultrasonido [Figura 3 I]. </li><li> Si la vejiga está vacía, llénela con 50 l de solución salina tibia estéril, tamponada con fosfato (PBS) a través de un G angiocatéter transuretral 24. </li></ol> 5. Separación de las capas de pared de la vejiga <ol><li> Acople una jeringa 1,0 ml llena con PBS y conectado a un 30 G, ¾ en la aguja (bisel dirigido en sentido anterior) a la abrazadera de la jeringa. </li><li> Coloque la aguja hacia la piel justo por encima del hueso púbico en un ángulo de 30-45 ° (80-90 ° con respecto al eje longitudinal de la cabeza de exploración de ultrasonido [Figura 1]). </li><li> Detectar la agujaen la pantalla del ultrasonido. </li><li> Lentamente perforar la piel y los músculos de la pared abdominal [Figura 3 II]. </li><li> Gire el bisel de la aguja 180 ° (ahora dirigida posteriormente). </li><li> Inserte la punta de la aguja en la pared de la vejiga sin penetrar la mucosa [Figura 3 III] </li><li> Inyectar lentamente 50 l de PBS entre la capa muscular y la mucosa con el fin de crear un espacio artificial [Figura 3 IV]. Nota: Si la mucosa se perfora accidentalmente durante el paso 5.6, tire lentamente la aguja e inyectar 50 l de PBS después de la capa de la mucosa se ha invertido sobre la punta de la aguja. </li><li> Retire la aguja. </li></ol> 6. Intramural La inoculación de las células del cáncer de vejiga <ol><li> Adjunte una segunda ml jeringa 1,0 (lleno de células de cáncer suspendidas en Matrigel) con un 30 G, ¾ de aguja a la abrazadera de la jeringa. </li><li> Guiar la punta de la aguja a la mismaEspacio lleno de PBS que fue creado en el paso 5.7. </li><li> Inyectar 40 l de la suspensión celular en este espacio [Figuras 3 V y VI]. </li><li> Retire la aguja. </li></ol> 7. Tratamiento de Soporte Post-intervencionista <ol><li> Desmontar el ratón desde la plataforma de imágenes. </li><li> Mantener el animal en un ambiente cálido y confortable bajo vigilancia continua mientras se recupera de la anestesia. </li><li> Después de recuperar la conciencia y reanudar la deambulación normal, coloque el animal de nuevo en su jaula. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
<li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse%3A+the+importance+of+orthotopic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li>
<li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Kang, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Bladder+Tumor+Model+and+the+Evaluation+of+Intravesical+saRNA+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
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<li>Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+phototoxicity+of+5-aminolevulinic+acid-induced+PpIX+in+an+orthotopic+rat+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model.</a> J. Urol. 153, 802-806 (1995).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+view%3A+Genetic+profiling+reveals+decades+old+cross-contamination+of+bladder+cancer+cell+line+KU7+with+HeLa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa.</a> J. Urol. (13), (2013).</li>
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<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Black, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

El acceso abierto para este video-artículo es patrocinado por FUJIFILM VisualSonics, Inc.

Casi todos los grandes avances en el tratamiento del cáncer requerirán pruebas en modelos animales antes de iniciar los ensayos clínicos. Los modelos animales de cáncer son herramientas esenciales que permiten a los investigadores a estudiar la biología del tumor in vivo. Modelos de xenoinjertos ortotópico siguen siendo el estándar de oro de 1,2 y siguen ofreciendo la mayor flexibilidad (en términos de la selección de líneas celulares) y tienen la utilidad más práctica. El procedimiento ilustrado es una modificación mínimamente invasiva del modelo ortotópico descrito previamente por Dinney et al. 12 Hemos establecido tumores de xenoinjertos por ultrasonido guiado inyección percutánea de tres líneas celulares diferentes con una tasa de éxito técnico del 100%. Durante un seguimiento continuo, el 98% de los ratones demostró aumento constante en el volumen del tumor. Mediante la realización de una técnica mínimamente invasiva, hemos sido capaces de hacer frente a las limitaciones existentes del modelo intramural. Además respenexión bienestar de los animales, la reducción de la invasividad de este procedimiento también contribuye a la reproducibilidad de los experimentos in vivo al disminuir el número de complicaciones quirúrgicas. Es altamente eficaz del tiempo para evitar una laparotomía abdominal y necesidad asociada de cierre de la herida. Hemos sido capaces de reducir considerablemente el tiempo del procedimiento por animal a 3,4 min (± 1,6). Sin embargo, la principal ventaja de nuestro enfoque novedoso es su exactitud. Ultrasonido de alta resolución nos permite visualizar el espacio creado por la inyección de solución salina bajo la mucosa de la pared de la vejiga. Esta primera inyección de paso facilita la inyección de células tumorales en un segundo paso y minimiza el riesgo de derrame de células tumorales. Esto contrasta con la técnica de inyección intramural después de la laparotomía, donde es imposible visualizar colocación de la aguja y siempre hay un elemento de incertidumbre en cuanto a la profundidad exacta de la inyección. También, ya que estamos inoculando células tumorales estrictamente en la pared anterior de la vejiga, growt tumorh en la pared posterior de la vejiga se evita. Posteriormente, la tasa de complicaciones obstructivas debido al crecimiento del tumor en la proximidad de los orificios ureterales es extremadamente rara. Este efecto permite que acompaña los períodos de crecimiento y de tratamiento más largos. La principal limitación de la inoculación del tumor guiada por ecografía es la necesidad de un equipo técnico adecuado. Por lo tanto el rendimiento de este procedimiento es probable que se limita a los centros que se especializan en modelos animales de cáncer humano. Esto debería fomentar la colaboración entre grupos de investigación fuera de estas instituciones y de los grupos con experiencia en dicha novela modelado animal. Aunque depende de la familiaridad con la ecografía y cierta destreza manual, este modelo es fácil de aprender bajo la instrucción competente. La etapa clave en el procedimiento es la creación de un espacio artificial por vía submucosa en la pared de la vejiga con solución salina. Una vez creado este espacio sin perforación of la capa de la mucosa, que se mantiene estable durante varios minutos. La orientación de la segunda aguja en este espacio con el fin de inocular las células tumorales es relativamente simple. La principal complicación durante la creación del espacio submucoso es la perforación de la aguja en el lumen de la vejiga. La creación de un espacio submucoso, sin embargo, sigue siendo viable. La aguja tiene que ser retirado lentamente en la pared de la vejiga y la solución salina se inyecta sólo cuando la capa de la mucosa voltea sobre la punta de la aguja. Después de esta maniobra el espacio submucoso es menos estable (solución salina se escapará al lumen de la vejiga dentro de 30-60 seg) y la inyección de las células tumorales tiene que ser realizado rápidamente. El derrame de las células tumorales en el lumen de la vejiga puede ocurrir en estos casos con perforación de la mucosa. Aunque la pérdida de las células tumorales del espacio intramuros podría conducir a una disminución del volumen del tumor durante el seguimiento, nunca hemos observado ningún captación tumoral intravesical. Otro potencial Complication es el vertido de las células tumorales a la cavidad peritoneal a través del canal de inyección. Hemos observado un solo intraperitoneal difusión de células tumorales en 50 animales, y esto ocurrió en uno de nuestros primeros intentos. Atribuimos esto a la inyección de un volumen demasiado importante suspensión de células tumorales. Esto fue apoyado por el hecho de que la reducción del volumen de 50-40 l no dio lugar a derrame intraperitoneal más. Esta inoculación mínimamente invasivo de murino ortotópico de xenoinjertos de cáncer de vejiga representa una modificación innovadora del &quot;modelo intramural&quot; existente, beneficiando tanto el investigador como los animales por igual. Las ventajas de este modelo estimulan su adaptación a otros órganos tales como el riñón, la próstata y el hígado con el fin de establecer tumores de xenoinjertos ortotópico de una manera mínimamente invasiva.

La investigación del cáncer depende de los modelos animales de cáncer humano utilizando líneas celulares derivadas de tumores de pacientes con el fin de profundizar nuestra comprensión de la biología del tumor. Para análisis in vivo el crecimiento de bajo diferentes estrategias de tratamiento de cáncer de vejiga modelos murino ortotópico siguen siendo el estándar de referencia 1,2. La inoculación de células de cáncer de vejiga humano en ratones inmunocomprometidos (modelo de xenoinjerto) se basa en la instilación intravesical (&quot;modelo intravesical&quot;) 3,4,5 o inyección directa en la pared de la vejiga (&quot;modelo intramural&quot;) 6,7. Ambas técnicas se pueden también realizar en ratas 8,9. Instilación intravesical induce la formación de tumores en la superficie urotelial de la vejiga que luego son susceptibles de posterior de la instilación intravesical de agentes de tratamiento novedosas. Sin embargo, el número de líneas de células que son tumorigénicas de forma fiable cuando se entrega a través de este método se limita unaD una de esas líneas celulares, KU7, recientemente se ha demostrado ser HeLa 4,10. Instilación intravesical es también consume mucho tiempo debido a tiempos de espera necesarios, y que con frecuencia induce el crecimiento del tumor en elementos adyacentes del tracto urinario, incluyendo la uretra, uréter y pelvis renal 11. Además, la instilación intravesical a menudo conduce al crecimiento del tumor en el suelo de la vejiga donde los uréteres entran en la vejiga, y esto puede causar obstrucción de las vías superior e insuficiencia renal concomitante. Xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios que son adecuados para tratamientos sistémicos se crean mediante inyección directa de las células tumorales en la pared de la vejiga 12. Aunque numerosas líneas celulares crecen adecuadamente en este modelo, su limitación es la invasividad de la modelo relacionado con la necesidad de una incisión abdominal 13. El modelo también es difícil de aprender debido a la dificultad técnica de la inyección de células, precisamente, en la pared muscularde la vejiga. Un nuevo enfoque para establecer ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios en ratones se ha desarrollado en nuestro servicio con el fin de subsanar las deficiencias existentes del &quot;modelo intramural&quot;. Hemos sido capaces de optimizar la inyección percutánea guiada por ecografía de las células de cáncer de vejiga en la pared anterior de la vejiga como resultado de esta nueva técnica para sustituir con éxito el modelo invasivo establecida. Por otra parte tenemos potencialmente hemos mejorado la precisión y reproducibilidad del &quot;modelo intramural&quot;.

<table><tbody><tr><td>Gluconato de clorhexidina (2%)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3004202</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (1 ml)</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica (30 G; &frac34; en)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatéter (24 g)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>plataforma de imagen para animales pequeños Vevo 770</td> Cabezal de exploración ultrasónica <td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mínimamente invasiva establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga son el estándar de oro para estudiar las manipulaciones celulares moleculares y nuevos agentes terapéuticos in vivo. Las líneas celulares adecuadas se inoculan ya sea mediante instilación intravesical (modelo de crecimiento invasivo no muscular) o la inyección intramural en la pared de la vejiga (modelo de crecimiento invasivo). Ambos procedimientos son complejos y altamente consume mucho tiempo. Además, el modelo superficial tiene sus deficiencias debido a la falta de líneas de células que son tumorigénicas después de la instilación. Inyección intramural, por otro lado, está estropeada por la invasividad del procedimiento y la morbilidad asociada para el ratón huésped. Con estas limitaciones en mente, hemos modificado los métodos anteriores para desarrollar un abordaje mínimamente invasivo para la creación ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga. Usando la guía del ultrasonido que hemos realizado con éxito la inoculación percutánea de las líneas celulares de cáncer de vejiga UM-UC1, UM-UC3 y UM-UC13 en 50 desnudos atímicos. Hemos sido capaces de demostrar que este enfoque es tiempo eficiente, precisa y segura. Con esta técnica, se crea inicialmente un espacio debajo de la mucosa de la vejiga con PBS, y las células tumorales se inyectan en este espacio en un segundo paso. El crecimiento tumoral se monitorizó a intervalos regulares con imágenes de bioluminiscencia y ultrasonido. Los volúmenes promedio de tumor aumentaron constantemente en en todo menos en una de nuestras 50 ratones durante el periodo de estudio. En nuestra institución, este nuevo enfoque, que permite la inoculación de xenoinjertos de cáncer de vejiga de una manera mínimamente invasiva, rápida y muy precisa, se ha sustituido el modelo tradicional.

<html> Inyección intramural de tres líneas celulares tumorales diferentes (luc UM-UC1, UM-UC3 luc y UM-UC13 luc) se realizó en 50 animales de menos de ultrasonido orientación sobre tres días consecutivos. La inoculación se realizó de manera eficiente (tiempo medio de 5,7 min / animal) y no se asoció con ningún tipo de complicaciones intra o post-intervención. Monitoreo del crecimiento del tumor se realizó mediante imágenes de ultrasonido y bioluminiscencia. El día # 3 un tumor podría ser detectado por ecografía en el anterior de la vejiga de los 50 animales [Figura 4 I]. 98% de los ratones mostró el crecimiento del tumor constante durante el período de seguimiento [Figuras 4 y 5]. Tras la inoculación de UM-UC3 luc, un ratón desarrolló diseminación tumoral intraperitoneal y el tumor involucionado tras día # 7 en un segundo animal [Tabla 1]. Este fue el primer grupo de ratones inoculados con esta nueva técnica. nt &quot;&gt; Los ratones fueron sacrificados en el día # 24, # 28 y # 37 después de la inoculación de luc UM-UC3, UM-UC1 luc y UM-UC13 luc, respectivamente. xenoinjertos de tumores se recolectaron y examinaron en hematoxilina y eosina (H &amp; E secciones). Todos los tumores fueron músculo invasivo y algunos se infiltraron en la grasa perivesical, pero sin invasión en órganos adyacentes se observó [Figura 6 I]. 60% de los ratones portadores de tumores luc UM-UC13 y 20% de los ratones portadores de UM-UC3 Luc tumores desarrollan metástasis en los ganglios linfáticos retroperitoneales que fueron confirmadas por H &amp; E tinción [Figura 6 II]. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Figura 1. Imagen e ilustración esquemática de la configuración experimental El ratón está montada. Sobre la mesa de operaciones climatizada (I) y se mantiene bajo anestesia (&lt;strong&gt; II) con 3% de mezcla de isoflurano / oxígeno. Los miembros inferiores se fijan con una banda de goma (III). Después de acercarse a la cabeza de exploración de ultrasonido (IV) a la piel (alineación longitudinal con un ángulo de 45-70 ° craneal) de la vejiga (V) se visualiza en la pantalla del ultrasonido. Una jeringa con una aguja de 30 G (VI) es guiado a la piel en un ángulo de 30-45 ° (80-90 ° con respecto al eje longitudinal de la cabeza de exploración de ultrasonido). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Figura 2. Inmovilización de la vejiga. Dimensiones e ilustración para la construcción de la correa de la estabilización de la vejiga (I) La correa se adjunta a la parte inferior del abdomen y inmoviliza la vejiga (II). Por lo tanto una evasión de la<html> se evita la vejiga durante la inyección intramural. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Figura 3. La inoculación intramural de las células tumorales. Visualización de la vejiga en la pantalla de ultrasonido (I). La perforación de la piel y los músculos de la pared abdominal (II). La inserción de la aguja en la pared de la vejiga sin penetración de la mucosa (III). PBS (50 l) entre la capa muscular y la mucosa después de la inyección lenta (IV). Las células tumorales suspendidas en Matrigel en el intramural espacio creado artificialmente (V, VI). 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. . Seguimiento por ultrasonido continuo seguimiento mediante ecografía mostró un aumento significativo en el volumen del tumor (I: día # 3, II: día # 7, III: día # 13). <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Figura 5. Seguimiento por parte de la bioluminiscencia. Seguimiento continuado por bioluminiscencia mostró aumento constante de la luminiscencia en el período estudiado. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Figura 6. Histología de xenoinjertos de tumores y metástasis ganglionares. En toto sección H &amp; E de un xenotrasplante representante ma<html> Mor que demuestra el crecimiento invasivo en el músculo sin invasión en órganos adyacentes (I). 60% de los ratones portadores de tumores luc UM-UC13 y el 20% de los ratones portadores de UM-UC3 tumores luc metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales presentados (II). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Línea de células inoculadas </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> Luc UM-UC13 </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Número de ratones </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Volumen inyectado, l </td>UR A: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Cantidad de elementos absoluta </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5.5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tiempo por animal, min </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,4 (± 1,6) </td><td style="width:64px;"> 7,7 (± 3,7) </td><td style="width:64px;"> 6,8 (± 2,9) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> La incidencia de tumores </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98%) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100%) </td><td style="width:64px;"> 14 (93%) </td><td style="width:64px;"> 15 (100%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Metástasis ganglionares </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20%) </td><td style="width:64px;"> 9 (60%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Seguimiento (días) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [antes del tratamiento] </td><td style="width:64px;"> 28 [antes del tratamiento] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> El volumen del tumor (l) </td><td style="width:64px;"> día 4 </td><td style="width:64px;"> 11,6 (± 1,3) </td><td style="width:64px;"> 12,5 (± 1,7) </td><td style="width:64px;"> 14,4 (± 1,3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowspan = &quot;2&quot; style = &quot;altura: 61px; anchura: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> final de </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (± 72,4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (± 66,1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78,3 (± 13,4) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> seguimiento </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Luminiscencia tumoral (fotones / seg) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> día 4 </td><td style="width:64px;"> 4,6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2.0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5.8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (± 9,4 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 3,7 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 1,3 x 10 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;altura: 67px; anchura: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> final de </td><td style="width:64px;"> 1,9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> seguimiento </td><td style="width:64px;"> (± 4,0 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 2,3 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 1,9 x 10 9) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Inyección de células tumorales guiada por ultrasonido - procedimiento y los resultados.

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

El objetivo general de este procedimiento es crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga de forma rápida, precisa y mínimamente invasiva. Esto se logra primero expandiendo la línea celular tumoral particular y suspendiendo las células tumorales en Matrigel. A continuación, se coloca al animal sobre la plataforma de imagen y se visualiza la vejiga mediante ultrasonido.Luego, las capas mucosa y muscular de la vejiga se separan mediante una inyección de suero salino. Finalmente, se inyecta la suspensión de células tumorales en matrigel en este espacio artificialmente creado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento tumoral mediante imágenes por ultrasonido y bioluminiscencia.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como el uso de laparotomía para la inoculación de xenoinjertos primarios, es que este enfoque es rápido, preciso y mínimamente invasivo. Las implicaciones de estas técnicas se extienden al diagnóstico y tratamiento del cáncer de vejiga, ya que los xenoinjertos autólogos son el estándar de oro para el estudio preclínico de tratamientos novedosos. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de inyección son muy difíciles de aprender, y la pared vesical es muy delgada. Demostrar este procedimiento será esencial.Igor Mosca es investigador asistente y Wolfgang Yeager es investigador posdoctoral. Ambos son urólogos. Después de confirmar la identidad de las respectivas líneas celulares humanas de cáncer de vejiga mediante el perfil genético del ADN, utilice un constructo lentiviral que porta el gen de luciferasa de luciérnaga para el análisis de crecimiento mediante bioluminiscencia de tumores xenoinjertados, para transfectar las líneas celulares.Cuando esté listo para comenzar el procedimiento, descongele y use DMEM con 10 %FBS para expandir las líneas celulares existentes, incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5 %CO2. Para preparar una suspensión celular para inyección tras el descongelamiento, agregue matrigel y mantenga los ojos de tripsina en hielo; recolecte células con 70 % de confluencia y suspenda con medio de crecimiento normal, luego cuente las células y centrifugue la suspensión a 200 ×g durante cinco minutos. Tras eliminar el sobrenadante, agregue la cantidad adecuada de volúmenes iguales de D-M-E-M-F-B-S y MATRIGEL para alcanzar la concentración celular deseada para inyectar un volumen de 40 microlitros por animal.Mezcle bien y evite crear burbujas de aire con cualquier material plástico rígido y plano. Corte cuidadosamente un estabilizador de vejiga, inspeccione la correa y elimine cualquier borde afilado antes de aplicarlo a los ratones. Después de anestesiar ratones hembra con isoflurano al 3 % en oxígeno y realizar una compresión del dedo del pie.Para garantizar una sedación adecuada, coloque al animal sobre la mesa de calentamiento del plataforma de imagenología para pequeños animales, monitoreando continuamente sus signos vitales con una banda de goma. Fije las extremidades inferiores y utilice clorhexidina digluconato al 0,5 % para desinfectar el abdomen antes de limpiar la piel con un hisopo estéril. A continuación, utilizando la correa de estabilización de la vejiga, inmovilice la vejiga para evitar su desplazamiento durante la inyección intramural.Luego, aplique gel estéril para ultrasonido en el abdomen inferior. Avance lentamente el escáner de ultrasonido, acercando la sonda a la piel, y visualice la vejiga en la pantalla de ultrasonido. Si la vejiga está vacía, utilice 50 microlitros de PBS tibio en un catéter angiocannula transuretral de calibre 24 para llenarla y separar las capas de la pared de la vejiga.Comience sujetando una jeringa de 1,0 mililitro llena con PBS y conectada a una aguja de calibre 30 de tres cuartos de pulgada al sujetador de jeringa. Coloque la aguja hacia la piel justo por encima del hueso púbico. En un ángulo de 30 a 45 grados, detecte la aguja en la pantalla de ultrasonido antes de perforar lentamente la piel y los músculos de la pared abdominal.A continuación, gire el bisel de la aguja 180 grados para que quede orientado hacia la parte posterior, e inserte la punta de la aguja en la pared de la vejiga sin atravesar la mucosa. Luego, para crear un espacio artificial, inyecte lentamente 50 microlitros de PBS entre la capa muscular y la mucosa antes de retirar la aguja. Para inyectar las células de cáncer de vejiga, coloque una segunda jeringa de 1,0 mililitro cargada con la suspensión de células cancerosas en matrigel, y una aguja de calibre 30 de tres cuartos de pulgada, en la pinza para jeringas.Guíe la punta de la aguja hacia el espacio lleno con PBS recién creado e inyecte 40 microlitros de la suspensión en el espacio. A continuación, retire la aguja después de desmontar el ratón de la plataforma de imagen.Manténgalo en un ambiente cálido y cómodo bajo monitoreo continuo. Después de recuperar la conciencia y la marcha normal, devuelva al animal a su jaula de origen. Se realizó la inyección intramural de tres líneas celulares tumorales diferentes en 50 animales con guía de ultrasonido durante tres días consecutivos.La inoculación se realizó de manera eficiente y no estuvo asociada con complicaciones intra o posintervención. El seguimiento del crecimiento tumoral se realizó mediante imágenes por ultrasonido y bioluminiscencia. En el día tres, se pudo detectar un tumor mediante ultrasonido en la pared anterior de la vejiga de los 50 animales, y el 98 % de los ratones mostraron un crecimiento tumoral constante durante el período de seguimiento tras la inoculación de uc.Three.Un ratón Luke desarrolló una diseminación tumoral intraperitoneal y el tumor se involucionó después del día siete en un segundo animal. Este fue el primer grupo de ratones inoculados con esta nueva técnica tras la inoculación de uc.Three. Luke uc, un Luke y uc.13 Luke. Los ratones fueron sacrificados en los días 24, 28 y 37, respectivamente. Los tumores xenoinjertados se recolectaron y examinaron mediante secciones h y d.Todos los tumores eran invasivos del músculo y algunos infiltraron la grasa perivisceral, pero no se observó invasión a órganos adyacentes. 60% de los uc, 13 Luke y 20% de los uc. Tres ratones portadores de tumores Luke desarrollaron metástasis en ganglios linfáticos retroperitoneales, las cuales fueron confirmadas mediante tinción con H y E.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres minutos. Es un requisito previo conocer la imagenología por ultrasonido para llevar a cabo este procedimiento. Después de que los tumores han sido inoculados de esta manera, el ultrasonido nos permite no solo monitorear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, sino también evaluar la perfusión tumoral con microburbujas. Asimismo, nos permite realizar inyecciones intratumorales con nuevos agentes experimentales.

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