Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

El objetivo general de este procedimiento es crear xenoinjertos ortotópicos de cáncer de vejiga de una manera rápida, precisa y mínimamente invasiva. Esto se logra expandiendo primero la línea celular tumoral particular y la suspensión de las células tumorales en Matrigel. A continuación, se monta el animal en la plataforma de imágenes y se visualiza la vejiga con ecografía.

A continuación, se separan las capas mucosas y musculares de la vejiga con una inyección de solución salina. Finalmente, la suspensión de matrigel de células tumorales se inyecta en este espacio creado artificialmente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento tumoral a través de imágenes de ultrasonido y bioluminiscencia.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como el uso de la laparotomía para la inoculación de xenoinjertos primarios, es que este abordaje es rápido, preciso y mínimamente invasivo. Las implicaciones de estas técnicas se extienden al diagnóstico y tratamiento del cáncer de vejiga, ya que los autoxenoinjertos son el estándar de oro para el estudio preclínico de nuevos tratamientos. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de inyección son bastante difíciles de aprender, y el agua es muy delgada, la demostración de este procedimiento será.

Igor Mosca tiene un asistente de investigación y Wolfgang Yeager, un becario postdoctoral. Ambos son urólogos después de confirmar la identidad de las respectivas líneas celulares de cáncer de vejiga humana. Para este estudio a través de la huella dactilar del ADN, se utilizó una construcción lentiviral que lleva el gen de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga para el análisis del crecimiento por bioluminiscencia de tumores de xenoinjertos para transfectar las líneas celulares.

Cuando esté listo para comenzar el procedimiento, descongele y use DMEM con 10% de FBS para expandir las líneas celulares existentes, incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Para preparar una suspensión celular para la inyección después de descongelar, matrigel, y mantener en hielo los ojos de tripsina, 70% de las células de confluencia y use un medio de crecimiento normal para suspender, luego cuente las células y gire la suspensión a 200 veces G durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante, agregue la cantidad adecuada de volúmenes iguales de D-M-E-M-F-B-S y MATRIGEL para alcanzar la concentración celular deseada para inyectar un volumen de 40 microlitros por animal.

Mezcle bien y evite crear burbujas de aire con cualquier tipo de material plástico plano y rígido. Corte un estabilizador de vejiga, inspeccione cuidadosamente la correa y retire los bordes afilados antes de aplicarlo a los ratones. Después de anestesiar ratones hembra con 3% de isoflurano en oxígeno y realizar un pellizco en el dedo del pie.

Para garantizar una sedación adecuada, monte al animal en la mesa de imágenes de calefacción de la plataforma de imágenes para animales pequeños, monitoreando continuamente sus signos vitales con una banda elástica. Fije las extremidades inferiores y use gluconato de clorhexidina al 0,5% para desinfectar el abdomen antes de usar una punta de algodón estéril para limpiar la piel. A continuación, utilizando la correa de estabilización de la vejiga, inmovilice la vejiga para evitar una evasión de la misma durante la inyección intramural.

A continuación, aplique un gel de ultrasonido estéril en la parte inferior del abdomen. Avance lentamente la ecografía, diríjase a la piel y visualice la vejiga en la pantalla de la ecografía. Si la vejiga está vacía, use 50 microlitros de PBS tibio en un catéter angioico transuretral de calibre 24 para llenarla y separar las capas de la pared de la vejiga.

Comience colocando una jeringa de 1.0 mililitro llena de PBS y conectada a una aguja de tres cuartos de pulgada de calibre 30 a la pinza de la jeringa. Coloque la aguja hacia la piel, justo por encima del hueso púbico. En un ángulo de 30 a 45 grados, detecte la aguja en la pantalla de ultrasonido antes de perforar lentamente la piel y los músculos de la pared abdominal.

A continuación, gire el bisel de la aguja 180 grados para que quede orientado hacia atrás e inserte la punta de la aguja en la pared de la vejiga sin penetrar en la mucosa. Luego, para crear un espacio artificial, inyecte lentamente 50 microlitros de PBS entre la capa muscular y la mucosa antes de retirar la aguja. Para inyectar células cancerosas de vejiga, conecte una segunda jeringa de 1.0 mililitro llena con la suspensión de matrigel de células cancerosas y una aguja de tres cuartos de pulgada de calibre 30 a la pinza de la jeringa.

Guíe la punta de la aguja hasta el espacio lleno de PBS. Acaba de crear e inyectar 40 microlitros de la suspensión en el espacio. A continuación, retire la aguja después de desmontar el ratón de la plataforma de imágenes.

Manténgalo en un ambiente cálido y cómodo bajo monitoreo continuo. Después de recuperar la conciencia y la deambulación normal, vuelva a colocar al animal en su jaula de origen. Se realizó la inyección intramural de tres líneas celulares tumorales diferentes en 50 animales bajo guía ecográfica durante tres días consecutivos.

La inoculación se realizó de manera eficiente y no se asoció con complicaciones intra o post intervencionistas. El seguimiento del crecimiento tumoral se realizó mediante ecografía y bioluminiscencia. Al tercer día, se pudo detectar un tumor mediante ecografía en la vejiga anterior de los 50 animales, y el 98% de los ratones mostraron un crecimiento tumoral constante durante el período de seguimiento después de la inoculación de la uc. Tres.

Luke, un ratón desarrolló diseminación tumoral intraperitoneal y el tumor involucionó después del séptimo día en un segundo animal. Este fue el primer grupo de ratones inoculados con esta nueva técnica después de la inoculación de uc. Tres. Lucas uc, un tal Lucas, y uc.

13 Lucas. Los ratones fueron sacrificados los días 24, 28 y 37 respectivamente. Los tumores de xenoinjerto se extrajeron y examinaron mediante secciones h y d.

Todos los tumores fueron músculo invasivos y algunos infiltrados en la grasa per visceral, pero no se observó invasión a los órganos adyacentes. 60% de la CU, 13 Lucas y 20% de la CU. Tres ratones portadores de tumores Luke desarrollaron metástasis en los ganglios linfáticos retroperitoneales, que se confirmaron mediante tinción h y e.

Una vez dominado, esta técnica se puede realizar en tres minutos. La familiaridad con las imágenes de ultrasonido es un requisito previo para realizar este procedimiento Después de que los tumores se han inoculado de esta manera, la ecografía nos permite no solo monitorear el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo y también observar la perfusión tumoral con microburbujas. También nos permite realizar inyecciones intratumorales con nuevos agentes experimentales.