Name: Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a preparar un microscopio de dos fotones para imagen intravital de alta resolución usando iluminación en franjas. Este método computacional permite visualizar el comportamiento del sistema inmune en centros germinales de linfonodos de ratones con detalles inaccesibles previamente.

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Agradecemos a R. Heintzmann para un debate fructífero en el desarrollo del enfoque de la iluminación a rayas, K. y A. Rajewsky Haberman para proporcionar ratones transgénicos C57BL / 6 B1-8 GFP. Reconocemos la Deutsche Forschungsgemeinschaft en virtud de concesión NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 y SFB633, A15 proyecto (AEH), la Charité en virtud de concesión Rahel-Hirsch comunión (RN) por el apoyo financiero. Reconocemos en particular la red de JIMI para un debate fructífero y apoyo de infraestructura

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li>
<li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+two-photon+intravital+microscopy+to+the+infrared+by+means+of+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator.</a> Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).</li>
<li>Hell, S. W., Rittweger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy%3A+Light+from+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopy: Light from the dark.</a> Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).</li>
<li>Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraresolution+imaging+in+brain+slices+using+stimulated-emission+depletion+two-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy.</a> Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).</li>
<li>Bianchini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-wavelength+two-photon+excitation+-+stimulated+emission+depletion+%28SW2PE-STED%29+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li>
<li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551(2012).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li>
<li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+M+%22Advanced+optical+imaging%22">Advanced optical imaging</a>. , Springer Verlag. Berlin. (2001).</li>
<li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li>
<li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+in+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li>
<li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li>
<li>Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li>
<li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li>
<li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li>
<li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li>
<li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+structured-illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li>
</ol>

Volker Andresen es accionista de LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Alemania. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses.

El objetivo de formación de imágenes ópticas intravital es visualizar de forma dinámica y funcionalmente la motilidad celular y las interacciones con el fin de comprender la función del órgano en la salud y la enfermedad del tejido y 5. La tecnología más potente para lograr esto, de múltiples fotones láser microscopía de barrido, todavía tiene que superar las limitaciones relacionadas con las distorsiones de onda frontal, la dispersión, la adquisición lenta, photobleaching y fotodaño, que limitan su resolució...

Dos fotones de láser microscopía de barrido (TPLSM), con sus ventajas para la formación de imágenes de los tejidos profundos relacionados con infrarrojos ultracorto excitación pulsada 1, ha revolucionado nuestra visión sobre los procesos vitales a nivel de células individuales mediante la revelación de la motilidad y la interacción de los diversos patrones subconjuntos de células en animales vivos 2-5. Sin embargo, la tecnología actual sigue siendo insuficiente para esclarecer los mecanismos de la función del órgano y la disfunción, como requisito previo para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, ya que hace sólo escasa información acerca de las bases moleculares de la respuesta celular en los tejidos en la salud y la enfermedad. La tecnología actual permite sólo una ventana espacial de unos pocos cientos de micras debido a la dispersión y la onda efectos de distorsión del frente sobre la resolución espacial y la relación señal-ruido 6, que son particularmente evidentes en el tejido altamente compacta de animales adultos. Estos dispersión y oleaje efectos de distorsión del frente se deben a una una gran heterogeneidadd distribución anisotrópica del índice de refracción en el tejido, lo que en un primer paso a un deterioro dependiente de la profundidad de la resolución espacial en 3D y finalmente a la pérdida total de la señal procedente de los fotones de excitación balísticos, es decir, la pérdida de la relación señal-ruido. En términos de biocientífico y aplicaciones de tejido profundo biomédicas, esto significa que la tecnología actual no puede revelar de manera inequívoca la comunicación celular causa una pobre resolución daría lugar a interacciones falsamente positivos, mientras que la disminución de la relación señal-ruido podría provocar que el sistema pasa por alto algunos interacciones entre estructuras tenues. Con el fin de detectar inequívocamente las interacciones celulares en una forma dinámica, se necesita una resolución espacial muy mejorada profunda dentro del tejido. Las técnicas Nanoscopia potentes introducidos actualmente basándose en algoritmos numéricos especiales, por ejemplo, enfoques estructura de iluminación, en el agotamiento del primer estado excitado, por ejemplo, </em&gt; STED, RESOLFT, o en la localización de la molécula, por ejemplo dSTORM, PALM, han encontrado muchas aplicaciones en las células fijadas, así como en cultivos de células en vivo 7. Sin embargo, con el fin de extender estas aplicaciones para secciones de tejidos, los tejidos vivos y organismos que todavía tenemos que superar las dificultades técnicas severas. Excitación de dos fotones Sted con diferentes longitudes de onda, así como con una sola longitud de onda (sw2PE-STED) para la excitación y la emisión estimulada se ha aplicado para mejorar la resolución lateral en rodajas de cerebro de 8 o en matrices artificiales con células embebidas 9, respectivamente, en la misma resolución axial como TPLSM estándar. Uso de un fotón STED, la dinámica de las espinas dendríticas podrían ser reflejados en la superficie de la corteza cerebral (hasta 10-15 m de profundidad) en un ratón vivo Thy1 EGFP a una resolución de 67 nm 10. Una herramienta versátil para la biología del desarrollo es proporcionada por el multifocal microscopía estructurada-iluminación, que proporciona doble mejorado 2Dresolución. Sin embargo, esta técnica sólo se puede utilizar en organismos con una baja propensión de dispersión de la luz, tales como embriones de pez cebra 11. Sin embargo, ninguna de estas técnicas se puede aplicar en el tejido altamente dispersión de animales adultos en varios cientos de micrómetros, que son modelos importantes para la investigación biomédica y clínica de las enfermedades con inicio después del nacimiento. Independiente de la aproximación utilizada para calcular la forma de onda frontal de difracción limitada, es decir, la función de dispersión de punto (PSF), después de enfocar a través de una lente, la anchura de la PSF a lo largo del eje óptico (resolución axial) es al menos tres veces más grande que la anchura de fibras discontinuas de poliéster perpendicular al eje óptico (resolución lateral) 12. Ola distorsiones del frente de diferentes órdenes cuantificados por los coeficientes de Zernike modificar considerablemente la forma del frente de onda de la onda electromagnética enfocada en imágenes de tejido profundo que conduce a mucho más grandes PSF, en especial a lo largo de la ópticaal eje 13-15. Por lo tanto, tanto las leyes de difracción y los efectos de distorsión del frente de onda apuntan a la resolución a lo largo del eje óptico tal como el factor limitante en la formación de imágenes de tejido profundo. Considerando que las técnicas de Nanoscopia se centran en contrarrestar los límites de difracción sólo, se necesita una tecnología que mejora la resolución y el contraste al contrarrestar tanto la difracción y los efectos de distorsión de la onda frontal axial para intravital de imágenes de alta resolución. Lo ideal sería que esta técnica debe ser también lo suficientemente rápido como para permitir el seguimiento de la dinámica celular. La corrección en tiempo real de las aberraciones de PSF y pérdida de contraste usando óptica adaptativa en TPLSM ha sido ampliamente estudiado y mejorado en la última década 13,14,16-18 y por lo tanto es la mejor opción disponible en la actualidad conduce a una mejor gestión de la excitación balístico aquellos fotones 14. Sin embargo, debido al hecho de que la mayor ola de corrección frente a los enfoques utilizados en óptica adaptativa es iterativo y que HÃve que ser repetido para áreas pequeñas (unos pocos 10 x 10 m 2) debido a la alta heterogeneidad del índice de refracción en el tejido, la velocidad de adquisición es significativamente menor que la necesaria para la motilidad celular de formación de imágenes y la comunicación. Por otra parte, el límite físico de adaptación óptica mejorada TPLSM todavía está determinado por difracción. La modulación espacial de la iluminación (SPIN) y modulación temporal en el lado de detección (PALA) se han propuesto teóricamente para ser aplicado a la microscopía de escaneo láser para mejorar la resolución. Su aplicación práctica en intravital de imágenes aún queda por demostrar 19. En conjunto, hay una gran demanda para el desarrollo de las tecnologías, que mejoran la resolución de imágenes de tejido profundo en vivir los animales adultos. En este trabajo, logramos modulación espacial del patrón de excitación mediante el control del proceso de digitalización en la multi-haz-iluminación rayas multi-fotón láser-smicroscopía enlatado (MB-SI-MPLSM) 20. Contrariamente a los enfoques iluminación estructurada, en la que la sección transversal del haz de excitación se modula espacialmente, utilizamos solamente el proceso de exploración para lograr la modulación espacial de la excitación. Con la ampliación de la excitación a una longitud de onda más larga, que son capaces de mejorar la resolución espacial y la relación señal-ruido en profundidad de los tejidos de alta dispersión de tejido (por ejemplo, los ganglios linfáticos, el camino libre dispersión de 47 m 6), independientemente de la óptica señal no lineal que detectamos, por ejemplo, fluorescencia, segunda generación armónica u otra frecuencia de mezcla fenómeno. El uso de este enfoque en longitudes de onda de excitación de hasta 900 nm podemos imagen dinámicamente las estructuras de proteínas celulares en la escala de pocas moléculas en los centros germinales de los ganglios linfáticos de ratón. Por lo tanto, podemos visualizar mejor la interacción entre unidades de antígeno llevar en la superficie de las células dendríticas foliculares y células B en el proceso de sondeo de la lucha contraGen durante la respuesta inmune en los órganos linfoides secundarios.

<table><tbody><tr><td>ATTO590 &ndash; NSH para acoplamiento</td><td>ATTO Tec, Alemania</td><td>AD-590-35</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35 &ndash; Fab fragmento &ndash; ATTO590</td><td>DRFZ, Berlín</td><td></td><td>La reacción de acoplamiento se realizó en el laboratorio central de nuestra institución.</td></tr><tr><td>B1-8 Jk-/- EGFP+</td><td>Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td><td></td><td>También se puede encontrar en Jackson Laboratories (JAX).</td></tr><tr><td>EasySep Selección Negativa Ratón Enriquecimiento de Células B&nbsp;</td><td>StemmCell Technologies, Alemania</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno (605), 0.2 y micro; m</td><td>Life Technologies, Alemania</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriMScope I</td><td>LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO (versión manual)</td><td>APE, Berlín, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td><td>Coherent, Duisburg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lente objetivo de inmersión en agua, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td><td>Olympus Alemania, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

muy resuelto microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Control de la comunicación celular por intravital de tejido profundo de múltiples fotones microscopía es la clave para entender el destino de las células inmunes dentro de muestras de tejido de espesor y órganos en la salud y la enfermedad. Al controlar el patrón de exploración en microscopía de múltiples fotones y la aplicación de algoritmos numéricos apropiados, hemos desarrollado un enfoque de rayas-iluminación, lo que nos permitió lograr 3 veces mejor resolución axial y la mejora de la relación señal a ruido, es decir el contrario, en más de 100 profundidad del tejido micras dentro altamente dispersante tejido de los órganos linfoides en comparación con la microscopía de multi-estándar de fotón. La velocidad de adquisición, así como photobleaching y fotolesiones efectos fueron similares a la técnica basada en la foto-multiplicador estándar, mientras que la profundidad de formación de imágenes era ligeramente inferior debido a la utilización de detectores de campo. Utilizando el enfoque de la iluminación de rayas, somos capaces de observar la dinámica de los depósitos de complejos inmunes en las células dendríticas foliculares secundarias ̵1; en el nivel de un par de moléculas de proteína en los centros germinales.

La resolución espacial en los ganglios linfáticos Las dimensiones de la función de dispersión de punto efectiva (epsf) corresponden a la resolución espacial de un microscopio 12. Medimos esta función triple dimensión mediante la adquisición de la señal de la segunda generación de armónicos de las fibras de colágeno en los ganglios linfáticos por nuestro MB-SI-TPLSM en comparación con las técnicas establecidas de dos fotones microscopía de escaneo láser, es decir TPLSM detecc...

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar un microscopio estándar de dos fotones para imágenes intravital de alta resolución. Esto se logra primero alineando el microscopio, lo que incluye ajustar los láseres. A continuación, se alinea el multiplexor de haces para obtener una forma de haz perfecta y una disposición óptima del haz luminoso.En el caso del escaneo multihaz, las imágenes en bruto se adquieren escaneando la muestra con un patrón de iluminación rayada. Finalmente, se aplica un algoritmo para calcular la imagen final de alta resolución. En última instancia, la microscopía de iluminación rayada se utiliza para mostrar detalles del comportamiento del sistema inmunitario dentro de los centros germinales en los ganglios linfáticos de ratones, anteriormente inaccesibles para la microscopía intravital.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía de iluminación estructurada o la microscopía de localización, es que puede aplicarse a grandes profundidades tisulares en muestras vivas. No requiere ninguna modificación de la forma del haz láser, manteniendo así el método muy sencillo y fácil de implementar en cualquier microscopio d

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Neisseria meningitidis (Nm), una gram negativos humanos específicos de patógenos respiratorios, se puede unir a humanos α-actinina. Aquí se presenta un protocolo para la visualización de la colocalización de la bacteria intracelular de α-actinina después de la entrada de bacterias en las células endoteliales microvasculares cerebrales (HBMECs).

La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

Este video demuestra la visualización de linfocitos intraepiteliales γδ (IELs) en ratones transgénicos utilizando microscopía confocal. El procedimiento quirúrgico consiste en crear una línea de perforación y hacer una incisión longitudinal para exponer la mucosa intestinal y las vellosidades. Los ratones transgénicos expresan proteínas reporteras exclusivamente en γδ IELs, lo que permite su seguimiento. Las imágenes intravitales capturan el movimiento dinámico de las IAL γδ marcadas con...

Visualización intravital de linfocitos intraepiteliales gamma delta

Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto.

La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Este protocolo describe la generación de quimeras mixta médula ósea murina con centros germinales autoinmunitarios espontáneos, en autorreactivos que linfocitos llevan un reportero de la proteína verde fluorescente (GFP-PA) de photoactivatable. Esto proporciona la capacidad para vincular la localización celular en posteriores análisis moleculares y funcionales de los tejidos.

Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.

Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila

Aprende a preparar un microscopio de dos fotones para imagen intravital de alta resolución usando iluminación en franjas. Este método computacional permite visualizar el comportamiento del sistema inmune en centros germinales de linfonodos de ratones con detalles inaccesibles previamente.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

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