Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

El objetivo general de este procedimiento es preparar un microscopio estándar de dos fotones para imágenes intravital de alta resolución. Esto se logra primero alineando el microscopio, lo que incluye ajustar los láseres. A continuación, se alinea el multiplexor de haces para obtener una forma de haz perfecta y una disposición óptima del haz luminoso.

En el caso del escaneo multihaz, las imágenes en bruto se adquieren escaneando la muestra con un patrón de iluminación rayada. Finalmente, se aplica un algoritmo para calcular la imagen final de alta resolución. En última instancia, la microscopía de iluminación rayada se utiliza para mostrar detalles del comportamiento del sistema inmunitario dentro de los centros germinales en los ganglios linfáticos de ratones, anteriormente inaccesibles para la microscopía intravital.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía de iluminación estructurada o la microscopía de localización, es que puede aplicarse a grandes profundidades tisulares en muestras vivas. No requiere ninguna modificación de la forma del haz láser, manteniendo así el método muy sencillo y fácil de implementar en cualquier microscopio de dos fotones. El montaje utilizado para la microscopía de iluminación rayada de dos fotones con múltiples haces se muestra aquí para lograr una resolución y calidad de contraste óptimas con el menor nivel de fotoblanqueo y la adquisición más rápida.

Considere realizar ajustes en el montaje según se describe en el protocolo escrito. Después de realizar los ajustes, verifique que el haz regrese al espejo ubicado directamente encima del espejo de entrada, al final del compresor de pulsos basado en prisma. Una vez establecida la trayectoria de la luz desde este punto, el haz se refleja hacia el multiplexor de haces.

Si se realiza una iluminación rayada con múltiples haces, microscopía de múltiples fotones con el escáner apagado. Alinee los espejos en el multiplexor de haces colocando una muestra homogéneamente fluorescente sobre la platina y enfoque el haz láser dentro de la muestra, pero cerca de la superficie superior. Cerca de la lente frontal del objetivo.

Configure el microscopio en modo de múltiples haces y seleccione el número de haces y la polarización. Por ejemplo, use P para encontrar el haz láser mediante la imagen de la portaobjetos fluorescente, abra el obturador de P y active continuamente la cámara CCD mientras enfoca el haz, asegurándose de que esté en la posición central. Al alinear el haz P, cambie al modo de 64 haces y abra el obturador correspondiente.

Verifique la posición del haz. Ajuste los espejos del primer al quinto multiplexor de haces, asegurándose de que los haces de luz estén equidistantes. Dado que los algoritmos de iluminación rayada se basan en este supuesto, reemplace la muestra uniformemente fluorescente por una con estructura heterogénea.

Por ejemplo, coloque la muestra de raíz de área Conval y escanee una imagen multihaz. Verifique que la imagen se vea nítida, uniforme y recta. Reemplace la muestra heterogénea con la muestra homogénea.

Inicie el escáner XY para controlar el proceso de escaneo. Para generar el patrón de excitación de imagen rayada para el escaneo con múltiples haces. Mueva el espejo del escáner Y perpendicularmente a la línea iluminada por el haz.

Repita el patrón generado aquí indicado por el número de bloques moviendo el espejo del escáner X, denominado aquí desplazamiento de bloque, para generar una imagen rayada rectangular. Coloque nuevamente la muestra heterogénea y utilice el escáner como disparador maestro. Sincronice la cámara con el escáner para adquirir y guardar automáticamente una imagen rayada y así obtener repetidamente imágenes rayadas.

Mueva el espejo del escáner X a diferentes posiciones seleccionando aquí suficientes pasos de repetición, el número de desplazamientos y la longitud de paso adecuada aquí. Establezca el paso de desplazamiento entre dos imágenes rayadas consecutivas para cubrir la distancia entre dos anchos de haz consecutivos. Ajuste el desplazamiento en X a un valor inferior al límite de resolución lateral en la longitud de onda de excitación dada.

Por ejemplo, utilizar 10 pasos del espejo del escáner X por desplazamiento y 12 o 13 desplazamientos proporciona la mejor resolución espacial. Ajuste estos dos valores mediante el control deslizante del área de conval hasta que la imagen del área de conval sea la más nítida posible. Utilice la herramienta de perfil de línea en las imágenes convencionales del CCD y en las imágenes calculadas de iluminación rayada.

Compare el ancho de los perfiles de línea, que en este ejemplo corresponde a la señal fluorescente de las paredes celulares de conval. Adquiera cada imagen en rayas en bruto sincronizada con el movimiento del escáner y guárdela por separado, por ejemplo, en archivos TIFF o binarios. Para generar una matriz bidimensional de la imagen de iluminación en rayas de alta resolución, abra un conjunto completo de imágenes en rayas en bruto como matrices en la rutina de evaluación.

Utilice ya sea el algoritmo de máximo mínimo o un algoritmo basado en transformada de Fourier, como se ha descrito previamente en detalle, para realizar la iluminación estriada, microscopía de múltiples haces y múltiples fotones en tejido profundo. En organismos vivos, adquiera imágenes estriadas en diferentes profundidades del tejido a lo largo del tiempo y evalúelas como se ha descrito anteriormente, para generar una película tridimensional de alta resolución que muestre la interacción dinámica entre el centro germinativo, las células B y las células dendríticas foliculares. Las dimensiones de la función de dispersión puntual efectiva corresponden a la resolución espacial de un microscopio.

Medimos esta función tridimensional adquiriendo ya sea la señal de generación de armónicos segundos de las fibras de colágeno o la señal fluorescente de microesferas de poliestireno de 100 nanómetros que emiten a 515 nanómetros en ganglios linfáticos mion. Utilizando nuestra microscopía T-P-L-S-M con iluminación rayada de múltiples haces en comparación con las técnicas establecidas de microscopía de barrido láser de dos fotones, como la detección de campo T-P-L-S-M mediante cámaras CCD y la detección puntual T-P-L-S-M. A partir de estas mediciones, resulta evidente que en la superficie del espécimen, tanto la resolución lateral como la axial corresponden a los valores esperados predichos por la teoría de difracción.

Sin embargo, con un aumento de la profundidad de imagen, y por lo tanto con un incremento del trayecto óptico tanto de la radiación de excitación como de la de emisión a través de un medio con índices de refracción altamente variables, la resolución espacial se deteriora considerablemente independientemente del montaje utilizado. Utilizando la M-B-S-I-T-P-L-S-M independientemente de la profundidad de imagen, alcanzamos aproximadamente un 20 % mejor resolución lateral y un 220 % mejor resolución axial en comparación con los enfoques estándar de T-P-L-S-M.

La selección clonal de linfocitos B durante la respuesta inmunitaria en los órganos linfoides secundarios de ratones adultos es el primer paso en su camino hacia la diferenciación en linfocitos B de memoria o en células plasmáticas. En este proceso, se cree que la interacción altamente dinámica entre las células dendríticas foliculares y los linfocitos B a nivel de las estructuras de complejos inmunitarios dentro de los centros germinales desempeña un papel central. Solo mediante el uso de una tecnología de microscopía intravital de alta resolución es posible analizar esta comunicación celular y sus implicaciones para la respuesta inmunitaria, observada aquí mediante la etiqueta anti CD 2135 FAB ATO cinco 90 en células dendríticas foliculares.

M-B-S-I-T-P-L-S-M proporciona por primera vez la posibilidad de visualizar y cuantificar in vivo las dimensiones de los cúmulos de depósitos de complejos inmunes a una profundidad de hasta 120 micrones en los centros germinales de los ganglios linfáticos poplíteos. Estas imágenes muestran la comparación directa entre las imágenes de fluorescencia 3D de los depósitos de complejos inmunes en un centro germinal, obtenidas mediante detección convencional basada en PMT y mediante M-B-S-I-T-P-L-S-M. Además, las interacciones entre los depósitos de complejos inmunes y las células B del centro germinal pueden resolverse con alta precisión y ahora pueden estudiarse en combinación con sondas funcionales intravital para proliferación, diferenciación o apoptosis.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que, con una técnica basada en detección por cámara, la velocidad de adquisición es aproximadamente ocho veces mayor, mientras que la profundidad máxima de imagen es aproximadamente un 25 % menor que la obtenida con un microscopio multiphotón estándar basado en fotomultiplicadores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar su microscopio multifotón para trabajar con el método de iluminación rayada, incluyendo el ajuste de la trayectoria óptica del microscopio, la alineación de las rejillas de haces, el cálculo de los parámetros de escaneo y las formas de calcular la imagen final de alta resolución. Para experimentos intravitales en tejidos profundos.