Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

Este experimento genera virus EO recombinantes marcados con fluorescencia a través de un método modular y rápido basado en la selección dominante transitoria. En primer lugar, crear un vector recombinante que contenga una etiqueta fluorescente rodeada de regiones mínimas de homología sintetizadas, así como marcadores para la selección metabólica y fluorescente. Transfectar este vector de recombinación en células infectadas y amplificar virus recombinantes mediante selección metabólica y fluorescencia.

A continuación, retire la selección metabólica para extirpar el casete de marcadores y aislar las células que contienen virus recombinantes mediante un marcador fluorescente. Selección. Los resultados de las placas virales en las monocapas celulares permiten la visualización de partículas de virus individuales que son características del gen marcado con fluorescencia. Desarrollamos este método porque queríamos generar virus recombinantes con múltiples modificaciones genéticas utilizando un método de selección que pudiera usarse de manera repetida y universal, independientemente de la etiqueta.

Si bien el principio de selección dominante transitoria se ha descrito anteriormente, queríamos aplicarlo a mayor escala y de manera modular para tener más flexibilidad a la hora de realizar modificaciones genómicas. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que la detección y el aislamiento de la placa viral recombinante pueden ser complicados. Su frecuencia puede ser baja y, por lo tanto, se requieren algunos métodos únicos para una recuperación eficiente del virus.

Por lo tanto, etiquetó un gen viral de interés en el extremo N o C de la proteína. En consecuencia, identifique 150 regiones flanqueantes largas de pares de bases de homología. A continuación, diseñe una secuencia de oligonucleótidos que comprenda los brazos izquierdo y derecho del par de 150 bases, separados por un par de sitios de restricción de elección.

También flanquea esta región por un segundo par de sitios de restricción que son diferentes del primer par para permitir la incorporación al vector TDS. Una vez sintetizado, ahora verifique que el oligonucleótido con los sitios de restricción esté diseñado para estar en el marco con el sitio de inserción deseado. Para la síntesis de oligonucleótidos, asegúrese de que los sitios de restricción estén incorporados entre los brazos izquierdo y derecho.

Haga coincidir los que flanquean el marco de lectura abierto de la etiqueta de fluorescencia de elección. Incorpore estos mismos sitios de restricción a ambos lados de la etiqueta de fluorescencia por PCR. Clona el fragmento sintetizado en el vector TDS.

También clona la etiqueta de fluorescencia en el vector de recombinación resultante utilizando los sitios de restricción entre el brazo izquierdo y el derecho. Regiones de homología. Infecte una monocapa de células BSC one con virus vaccinia y medios libres de suero.

Una hora después de la infección. Rescate de las células con transfect de medio de águila modificado con ECCO con una mezcla de recombinación, plásmido vectorial y reactivos de transfección en una proporción de tres a uno en medio libre de suero. Después de 24 horas, raspe y recupere las células en DMEM que no contienen suero fetal bovino.

Someter las células a tres ciclos de descongelación libre para romper las células y liberar las partículas del virus a continuación para obtener una separación adecuada de las placas individuales. Infectar monocapas de células 100% confluentes de células BSC one con diluciones en serie de la preparación de partículas virales. Superposición con líquido 10%FBS y DMEM más la selección GPT, reactivos e incubación durante 24 horas.

Aspire la capa de líquido y use un microscopio fluorescente para buscar placas. Exhibiendo fluorescencia roja difusa correspondiente a la incorporación de la cereza M del vector TDS al virus. Dependiendo del gen objetivo y de la etiqueta de fluorescencia elegida, también se puede observar fluorescencia localizada del gen de la marca en la misma placa roja.

Ahora, para recoger varias placas para cada virus recombinante, raspe con la punta de la pipeta y con 100 microlitros de 5%FBS que contiene DMEM transfirió las células a un tubo de einor. Realice tres rondas de congelación y descongelación de las células raspadas. Para liberar los virus recombinantes.

Agregue el DMEM que contiene el virus liofilizado y descongelado a una monocapa de células. En una placa de 12 pocillos para amplificar los virus recombinantes con reactivos de selección GPT en el medio de crecimiento. A continuación, raspe las amplificaciones exitosas a las 24 horas después de la infección para realizar un ensayo de placa de placas amplificadas con éxito, que exhiben fluorescencia roja C dos seis, bien reproducida con una monocapa de células BSC uno.

Realizar una dilución en serie de los virus recombinantes e infectar los pocillos con una dilución creciente de virus en DME M1 libre de FBS hora después de la infección. Retire el medio líquido y superponga cada pocillo con 0.5%agros en medio esencial mínimo completo tres días después de la infección. Elija las placas que muestren fluorescencia que sea tanto roja como del color de la etiqueta de fluorescencia elegida.

Amplifique estos nuevamente sin selección GPT. Elija placas que hayan perdido su fluorescencia roja difusa, pero que conserven la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida. Continuar con la purificación de la placa sin selección para obtener un stock puro de virus recombinantes que han perdido los genes de selección M cherry y GPT, pero conservan la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida.

Evalúe la pureza de las cepas con un ensayo de placa dirigido a todas las placas de un fenotipo de placa similar. Amplifique las existencias virales de prueba en una monocapa de células BSC one. Después de 24 horas después de la infección, raspe las células infectadas en 250 microlitros de centrífuga DMEM para las células infectadas.

Retire el supernat y vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 microlitros de 0,1%SDS en el vórtice tampón TE para licitar las células. Luego agregue 500 microlitros de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico e invierta para mezclar la centrífuga. Cosecha la fase superior y repite la extracción.

Luego, para precipitar el ADN de la capa acuosa, agregue un mililitro de etanol 100% frío y 50 microlitros de acetato de sodio. Mezclar por inversión y colocar la muestra a 20 grados centígrados bajo cero durante la noche. Después de peletizar el ADN por centrifugación, retire todo el líquido y seque al aire la bolita de ADN y el resus.

Suspenderlo en 50 microlitros de tampón TE. Utilice esta plantilla de ADN genómico para la detección de PCR para la inserción viral. Genere virus recombinantes con múltiples etiquetas como se detalla en el protocolo de texto.

Estos virus vaccinia recombinantes expresan proteínas marcadas con marcadores fluorescentes dirigidos a las proteínas estructurales virales, A 3 y F 13, que forman parte del núcleo interno y la envoltura externa del virus, respectivamente. Se seleccionaron los genes correspondientes a las proteínas localizadas en el virión para visualizar las partículas del virus. A tres es una proteína central del virión vaccinia, y F 13 es una proteína de la envoltura viral.

También se muestra un virus de doble marcaje con A 3 y F 13 marcados con fluorescencia, mientras que la microscopía de fluorescencia en tiempo real se puede realizar con un virus de doble marcado. En este caso, la proteína del núcleo interno del virus vaccinia. Un tres está marcado en rojo y la proteína F 13 de la envoltura exterior está etiquetada en verde.

Las partículas de virus sin envolver de la fábrica de virus se visualizan en rojo y el virión envuelto se representa mediante la colocalización de los canales rojo y verde. Se utilizó el análisis cuantitativo para determinar la eficiencia de recombinación entre los vectores recombinantes y el genoma del virus vaccinia. La eficiencia de la recombinación homóloga de vectores con el genoma del virus vaccinia se puede detectar con tan solo 70 regiones de homología de pares de bases.

Este método se ha utilizado para crear virus con múltiples etiquetas fluorescentes y/o múltiples deleciones de genes. Estos se han empleado en el estudio del ciclo de vida infeccioso del virus, el papel de las proteínas virales en la subversión de los sistemas de defensa del huésped, así como las interacciones con los procesos de señalización del huésped. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar virus vaccinia recombinantes utilizando un método que es modular en las etiquetas utilizadas, meticuloso en la resolución de los recombinantes deseados y aplicable en una variedad de contextos de investigación.