Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

Este experimento genera virus vaccinia recombinantes marcados con fluorescencia mediante un método modular y rápido basado en la selección transitoria dominante. En primer lugar, cree un vector recombinante que contenga una etiqueta fluorescente rodeada por regiones mínimas sintetizadas de homología, así como marcadores para selección metabólica y fluorescente. Transfecte este vector de recombinación en células infectadas y amplifique los virus recombinantes utilizando selección metabólica y fluorescencia. A continuación, elimine la selección metabólica para excindir el casete marcador y aísle las células que contienen virus recombinantes mediante selección por marcador fluorescente. Los resultados de las placas virales en monocapas celulares permiten la visualización de partículas virales individuales que son características del gen marcado con fluorescencia.

Desarrollamos este método porque deseábamos generar virus recombinantes con múltiples modificaciones genéticas utilizando un método de selección que pudiera emplearse de forma repetida y universal, independientemente de la etiqueta. Aunque el principio de la selección dominante transitoria ya ha sido descrito anteriormente, queríamos aplicarlo a una escala mayor y de manera modular para tener mayor flexibilidad al realizar modificaciones genómicas. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que el cribado y aislamiento de placas virales recombinantes puede ser complicado. Su frecuencia puede ser baja, por lo que se requieren métodos específicos para recuperar eficazmente el virus.

Etiquete el gen viral de interés en el extremo N o C del polipéptido. En consecuencia, identifique regiones aledañas de homología de 150 pares de bases de longitud. Luego, diseñe una secuencia de oligonucleótidos que comprenda los brazos izquierdo y derecho de 150 pares de bases, separados por un par de sitios de restricción de elección. Además, delimite esta región con un segundo par de sitios de restricción distintos al primer par, para permitir su incorporación al vector TDS una vez sintetizado. Verifique ahora que el oligonucleótido con los sitios de restricción esté diseñado para estar en el mismo marco de lectura que el sitio de inserción deseado. Para la síntesis del oligonucleótido, asegúrese de que los sitios de restricción incorporados entre los brazos izquierdo y derecho coincidan con los que flanquean la región codificante del marcador fluorescente elegido. Incorpore estos mismos sitios de restricción a ambos lados del marcador fluorescente mediante PCR. Clone el fragmento sintetizado en el vector TDS. Clone también el marcador fluorescente en el vector de recombinación resultante utilizando los sitios de restricción ubicados entre las regiones de homología de los brazos izquierdo y derecho. Inficte una monocapa de células BS-C-1 con virus vaccinia en medio libre de suero.

Una hora después de la infección, rescate las células con medio de Eagle modificado por Dulbecco. Transfecte con una mezcla del plásmido del vector de recombinación y reactivos de transfección en una proporción de tres a uno en medio sin suero. Después de 24 horas, raspe y recupere las células en DMEM que no contenga suero bovino fetal. Someta las células a tres ciclos de congelación y descongelación para romper las células y liberar las partículas virales. A continuación, para obtener una separación adecuada de placas individuales, infecte monocapas celulares de células BS-C-1 al 100 % de confluencia con diluciones seriadas de la preparación de partículas virales. Cubra con medio líquido de DMEM más 10 % de FBS y reactivos de selección GPT, e incube durante 24 horas.

Aspire el sobrenadante líquido y utilice un microscopio de fluorescencia para buscar placas que presenten fluorescencia roja difusa correspondiente a la incorporación de M-cherry desde el vector TDS al virus. Dependiendo del gen diana y la etiqueta fluorescente elegida, también puede observarse fluorescencia localizada del gen marcador en la misma placa roja.

Ahora, para seleccionar múltiples placas para cada virus recombinante, raspe con la punta de la pipeta y, con 100 microlitros de DMEM que contenga 5 % de FBS, transfiera las células a un tubo Eppendorf. Realice tres ciclos de congelación y descongelación de las células raspadas para liberar los virus recombinantes.

Añada el DMEM que contiene el virus descongelado a una monocapa de células en una placa de 12 pocillos para amplificar los virus recombinantes con reactivos de selección GPT en el medio de crecimiento. Luego, raspe las amplificaciones exitosas a las 24 horas posteriores a la infección. Para un ensayo de placas de placas amplificadas con éxito, que exhiben fluorescencia roja, siembre una placa de seis pocillos con una monocapa de células BS-C-1.

Realice una dilución seriada de los virus recombinantes e infecte las pocas con una dilución creciente de virus en DMEM sin FBS. Una hora después de la infección, retire el medio líquido y cubra cada pocillo con agarosa al 0,5 % en medio mínimo esencial completo. Tres días después de la infección, seleccione las placas que muestren fluorescencia tanto roja como del color de la etiqueta fluorescente elegida.

Amplifique nuevamente sin selección por GPT. Seleccione placas que hayan perdido su fluorescencia roja difusa, pero que conserven la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida. Continúe con la purificación de placas sin selección para obtener un stock puro de virus recombinantes que hayan perdido los genes de selección M-cherry y GPT, pero que conserven la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida.

Evalúe la pureza de los lotes mediante un ensayo de placas, buscando que todas las placas presenten un fenotipo de placa similar. Amplifique los lotes virales de prueba en una monocapa de células BS-C-1. Después de 24 horas posteriores a la infección, raspe las células infectadas en 250 microlitros de DMEM. Centrifugue las células infectadas, elimine el sobrenadante y reconstituya el botón celular en 500 microlitros de SDS al 0,1 % en tampón TE. Agite en vórtex para lisar las células. A continuación, añada 500 microlitros de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico y agite por inversión para mezclar. Centrifugue. Recupere la fase superior y repita la extracción.

Luego, para precipitar el ADN de la capa acuosa, agregue un mililitro de etanol frío al 100 % y 50 microlitros de acetato de sodio. Mezcle mediante inversión y coloque la muestra a menos 20 grados Celsius durante la noche. Después de sedimentar el ADN mediante centrifugación, elimine todo el líquido, seque el sedimento de ADN al aire y resuspenda en 50 microlitros de tampón TE. Utilice esta plantilla de ADN genómico para tamizar mediante PCR la inserción viral. Genere virus recombinantes con múltiples etiquetas según se detalla en el protocolo de texto.

Estos virus vaccinia recombinantes expresan proteínas marcadas con indicadores fluorescentes dirigidos a las proteínas estructurales virales A3 y F13, que forman parte del núcleo interno del virus y de la envoltura externa, respectivamente. Se seleccionaron genes correspondientes a proteínas localizadas en el virión para visualizar las partículas virales. A3 es una proteína del núcleo del virión vaccinia, y F13 es una proteína de la envoltura viral.

Se muestra también un virus con doble marcaje, etiquetado con A3 y F13 fluorescentes. Se puede realizar microscopía de fluorescencia en tiempo real con un virus doblemente marcado. En este caso, la proteína de la cápside interna del virus de la vacuna, A3, se etiqueta en rojo y la proteína de la envoltura externa F13 se etiqueta en verde.

Las partículas virales desprovistas procedentes de la fábrica viral se visualizan en rojo y los viriones envueltos se representan mediante la colocalización de los canales rojo y verde. Se utilizó un análisis cuantitativo para determinar las eficiencias de recombinación entre los vectores recombinantes y el genoma del virus vaccinia. La eficiencia de recombinación homóloga de los vectores con el genoma del virus vaccinia puede detectarse incluso con regiones de homología tan pequeñas como 70 pares de bases.

Este método se ha utilizado para crear virus con múltiples marcadores fluorescentes y/o múltiples eliminaciones génicas. Estos virus se han empleado en el estudio del ciclo vital infeccioso del virus, del papel de las proteínas virales en la subversión de los sistemas de defensa del huésped, así como en las interacciones con los procesos de señalización del huésped. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar virus vaccinia recombinantes utilizando un método que es modular en cuanto a los marcadores utilizados, meticuloso en la identificación de los recombinantes deseados y aplicable en una variedad de contextos de investigación.