Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

El objetivo general de este procedimiento es diseñar un método de precipitación de exosomas modificado que ofrezca una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas de la orina. Esto se logra eliminando primero las células muertas grandes y los restos celulares de la muestra de orina por centrifugación, y el snat que contiene los exosomas urinarios se transfiere a un tubo nuevo. En el segundo paso, el pellet se disuelve en una solución aislada que contiene DTT para eliminar la proteína de caída de caballo TAM.

Luego, después de una centrifugación adicional, el sobrenadante libre de TP se incuba con un reactivo TC exo rápido durante la noche para precipitar los exosomas al día siguiente. Las muestras tratadas con reactivo exo quick TC se centrifugan por última vez para obtener el pellet de exosoma. En última instancia, los procesos posteriores, como la Western blot y la QPCR en tiempo real, se pueden realizar en los exosomas para identificar los biomarcadores de interés.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la filtración y la precipitación ultra centrificación, es que el método de brazo no requiere pasos de ultra certificación, es fácil de realizar relativamente rápido, al tiempo que proporciona un rendimiento de exosomas alto y relativamente puro para el análisis molecular posterior antes de la recolección de orina. A 3.125 mililitros de cóctel de inhibidores de proteasa recién preparados, se coloque en un recipiente estéril vacío y luego recoja aproximadamente 10 mililitros de la primera orina miccional en el recipiente. Transfiera la muestra a tubos cónicos de 15 mililitros.

Tenga en cuenta que una muestra de orina recolectada durante 24 horas también se puede usar para el aislamiento de exosomas almacenándola a cuatro grados Celsius. Gire los tubos durante 10 minutos a 17.000 GS y 37 grados Celsius para eliminar o separar los restos celulares de los exosomas urinarios. A continuación, teniendo cuidado de no alterar el pellet, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de solución aislante.

Incubar el pellet con DTT a una concentración final de 200 miligramos por mililitro a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Vórtice de la muestra cada dos minutos. Luego, cuando el gránulo esté completamente disuelto, agregue 500 microlitros de solución aislante a la muestra e inmediatamente gire la suspensión resultante.

Agrupar el sobrenadante con el sobrenadante previamente recogido y volver a suspender, el nuevo pellet en 50 microlitros de solución aislante. Para el análisis de la página SDS para aislar los exosomas, primero incube 11 mililitros del sobrenadante combinado con 3,3 mililitros de reactivo exo quick TC a cuatro grados Celsius durante al menos 12 horas. Después de la incubación, centrifugar la muestra, luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis de la página SDS y el pellet que contiene los exosomas urinarios se usa para extraer D-N-A-R-N-A o proteína, o se almacena a menos 80 grados Celsius.

Utilice un espectrofotómetro NanoDrop para determinar las concentraciones de ADN y ARN de cada extracción midiendo la absorbencia a 260 y 280 nanómetros con dos microlitros de muestra aquí. Se muestra una reproducción modificada de un análisis de página SDS y la detección de biomarcadores mediante análisis de sangre occidental en los carriles con orina sin procesar y se observaron las primeras prohibiciones de proteínas en gránulos urinarios correspondientes a 90 a 100 kilodaltons, lo que indica la presencia y la eliminación de la proteína de caída de caballo TAM, respectivamente, en los carriles finales de gránulos de sobrenadante y exosoma. No se observó la banda de proteína de caída de caballo TAM, lo que indica una eliminación de la proteína de caída de caballo TAM en los pasos anteriores y resultó en un mayor rendimiento de gránulos de exosomas.

En este experimento, se detectaron los biomarcadores Alex y TSG 1 0 1 incluso cuando se utilizaron cantidades bajas de muestra, lo que indica un pellet de exosoma muy puro para el análisis de biomarcadores y una ausencia de proteínas solubles abundantes, incluida la proteína de caída de caballo TAM después de su desarrollo. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad renal crónica utilicen exosomas aislados en orina para la detección temprana y el diagnóstico de la nefropatía diabética.