Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas
16 de enero de 2015
Este manuscrito describe un protocolo para aislar exosomas de la orina humana utilizando una técnica de precipitación modificada.
El objetivo general de este procedimiento es diseñar un método de precipitación de exosomas modificado que ofrezca una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas de la orina. Esto se logra eliminando primero las células muertas grandes y los restos celulares de la muestra de orina por centrifugación, y el snat que contiene los exosomas urinarios se transfiere a un tubo nuevo. En el segundo paso, el pellet se disuelve en una solución aislada que contiene DTT para eliminar la proteína de caída de caballo TAM.
Luego, después de una centrifugación adicional, el sobrenadante libre de TP se incuba con un reactivo TC exo rápido durante la noche para precipitar los exosomas al día siguiente. Las muestras tratadas con reactivo exo quick TC se centrifugan por última vez para obtener el pellet de exosoma. En última instancia, los procesos posteriores, como la Western blot y la QPCR en tiempo real, se pueden realizar en los exosomas para identificar los biomarcadores de interés.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la filtración y la precipitación ultra centrificación, es que el método de brazo no requiere pasos de ultra certificación, es fácil de realizar relativamente rápido, al tiempo que proporciona un rendimiento de exosomas alto y relativamente puro para el análisis molecular posterior antes de la recolección de orina. A 3.125 mililitros de cóctel de inhibidores de proteasa recién preparados, se coloque en un recipiente estéril vacío y luego recoja aproximadamente 10 mililitros de la primera orina miccional en el recipiente. Transfiera la muestra a tubos cónicos de 15 mililitros.
Tenga en cuenta que una muestra de orina recolectada durante 24 horas también se puede usar para el aislamiento de exosomas almacenándola a cuatro grados Celsius. Gire los tubos durante 10 minutos a 17.000 GS y 37 grados Celsius para eliminar o separar los restos celulares de los exosomas urinarios. A continuación, teniendo cuidado de no alterar el pellet, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de solución aislante.
Incubar el pellet con DTT a una concentración final de 200 miligramos por mililitro a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Vórtice de la muestra cada dos minutos. Luego, cuando el gránulo esté completamente disuelto, agregue 500 microlitros de solución aislante a la muestra e inmediatamente gire la suspensión resultante.
Agrupar el sobrenadante con el sobrenadante previamente recogido y volver a suspender, el nuevo pellet en 50 microlitros de solución aislante. Para el análisis de la página SDS para aislar los exosomas, primero incube 11 mililitros del sobrenadante combinado con 3,3 mililitros de reactivo exo quick TC a cuatro grados Celsius durante al menos 12 horas. Después de la incubación, centrifugar la muestra, luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis de la página SDS y el pellet que contiene los exosomas urinarios se usa para extraer D-N-A-R-N-A o proteína, o se almacena a menos 80 grados Celsius.
Utilice un espectrofotómetro NanoDrop para determinar las concentraciones de ADN y ARN de cada extracción midiendo la absorbencia a 260 y 280 nanómetros con dos microlitros de muestra aquí. Se muestra una reproducción modificada de un análisis de página SDS y la detección de biomarcadores mediante análisis de sangre occidental en los carriles con orina sin procesar y se observaron las primeras prohibiciones de proteínas en gránulos urinarios correspondientes a 90 a 100 kilodaltons, lo que indica la presencia y la eliminación de la proteína de caída de caballo TAM, respectivamente, en los carriles finales de gránulos de sobrenadante y exosoma. No se observó la banda de proteína de caída de caballo TAM, lo que indica una eliminación de la proteína de caída de caballo TAM en los pasos anteriores y resultó en un mayor rendimiento de gránulos de exosomas.
En este experimento, se detectaron los biomarcadores Alex y TSG 1 0 1 incluso cuando se utilizaron cantidades bajas de muestra, lo que indica un pellet de exosoma muy puro para el análisis de biomarcadores y una ausencia de proteínas solubles abundantes, incluida la proteína de caída de caballo TAM después de su desarrollo. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad renal crónica utilicen exosomas aislados en orina para la detección temprana y el diagnóstico de la nefropatía diabética.
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Descripción general
Este manuscrito describe un protocolo para aislar exosomas a partir de orina humana utilizando una técnica de precipitación modificada. El método tiene como objetivo proporcionar una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación de exosomas
Antecedentes
- Los exosomas son vesículas extracelulares pequeñas implicadas en la comunicación intercelular.
- El aislamiento de exosomas a partir de orina puede proporcionar información sobre diversos procesos biológicos.
- Los métodos actuales pueden ser lentos y menos eficientes.
- Una técnica de precipitación modificada podría mejorar la recuperación de exosomas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido para el aislamiento de exosomas a partir de orina.
- Mejorar la escalabilidad y eficacia de la extracción de exosomas.
- Facilitar aplicaciones posteriores, como la identificación de biomarcadores.
Métodos Utilizados
- Centrifugación para eliminar células grandes y restos celulares de las muestras de orina.
- Disolución del sedimento en solución de aislamiento que contiene DTT.
- Incubación del sobrenadante con el reactivo exo quick TC durante la noche.
- Centrifugación final para obtener el sedimento de exosomas.
Resultados principales
- El método modificado aísla con éxito exosomas de la orina.
- Los exosomas pueden utilizarse en análisis posteriores como inmunotransferencia y qPCR.
- La eliminación eficiente de contaminantes mejora la pureza de los exosomas aislados.
- El protocolo es escalable para tamaños de muestra más grandes.
Conclusiones
- La técnica de precipitación modificada es un método viable para el aislamiento de exosomas.
- Este enfoque puede agilizar la investigación de exosomas en diversos estudios biológicos.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones adicionales de los exosomas aislados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de exosomas urinarios permite el descubrimiento no invasivo de biomarcadores para enfermedades renales, lo que favorece la detección temprana y la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo de terapias renales. El método de precipitación modificado ofrece una alternativa escalable y de alto rendimiento frente a la ultracentrifugación, mejorando la reproducibilidad y el rendimiento para los flujos de trabajo de validación de objetivos. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en la identificación de biomarcadores al reducir la contaminación y aumentar la pureza de los exosomas para el perfilado molecular posterior.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de exosomas que reflejan carga específica de tipo celular a partir de segmentos del túbulo nefronal.
- Valor operativo: Proporciona un método rápido y escalable para el aislamiento de exosomas sin necesidad de ultracentrifugación, reduciendo la variabilidad técnica.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en la detección de biomarcadores al obtener pellets de exosomas de alta pureza enriquecidos en miARN y ARNm para su perfilado.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara muestras validadas de exosomas para ensayos posteriores, como inmunotransferencia y qPCR, para detectar biomarcadores asociados a enfermedades.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento de exosomas mediante un protocolo basado en precipitación, compatible con el procesamiento de muestras de alto rendimiento.
- Preparación para ensayos: Genera rendimientos consistentes de exosomas adecuados para la extracción de ARN y el análisis de proteínas, lo que favorece la detección reproducible de biomarcadores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya la progresión desde el descubrimiento de biomarcadores en orina hasta la validación preclínica al proporcionar carga de exosomas relevante para la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite la detección de cambios en el contenido de exosomas bajo disfunción renal, aclarando las vías fisiopatológicas.
- Confianza Predictiva: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de biomarcadores de exosomas con signos tempranos de nefropatía diabética.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento desde la comprobación de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, lo que posibilita el aislamiento no invasivo de biomarcadores que orientan la selección de dianas y la continuidad preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de exosomas que reflejan cargas específicas del tipo celular de origen en las células del tracto urinario.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de exosomas adecuados para el desarrollo de ensayos de biomarcadores y la selección de compuestos.
- Análisis: Permite la medición de niveles de ARN y proteínas asociadas a exosomas mediante qPCR y transferencia Western para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona los biomarcadores de exosomas urinarios con modelos preclínicos de enfermedades renales mediante la detección de cargas relevantes a la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y escalable de aislamiento aplicable a múltiples tipos de muestras de orina y programas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante el aislamiento puro de exosomas para el perfilado de biomarcadores.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad al eliminar los pasos de ultracentrifugación y simplificar el procedimiento.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance o interrupción del desarrollo al aumentar la confianza en la detección temprana de biomarcadores para enfermedades renales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos renales basada en datos robustos de biomarcadores de exosomas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de exosomas y técnicas moleculares como la extracción de ARN y la qPCR.
- Necesita acceso a equipos de centrifugación, al reactivo ExoQuick TC y a herramientas espectrofotométricas para la cuantificación de ARN/ADN.
- Exige estandarización entre los equipos para garantizar tiempos de incubación, temperaturas y manipulación de reactivos consistentes.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes protocolos de recolección de orina o condiciones de almacenamiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una incubación nocturna y un manejo cuidadoso para evitar la pérdida de exosomas durante las transferencias.
