Name: Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprende un método de precipitación modificado para aislar exosomas urinarios de forma rápida y escalable. Esta técnica facilita el análisis de biomarcadores mediante Western blot y qPCR.

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Estamos agradecidos a la Fundación de la Familia Roney por el apoyo de este estudio. Reconocemos la contribución de la Dra. M. Lucrecia Álvarez a la planificación y ejecución de los experimentos descritos en este trabajo.

NOTA:. Los pasos implicados en el aislamiento de los exosomas urinarios utilizando el método de precipitación modificado se ilustran en la Figura 1 Los primeros pasos implican la eliminación de grandes células muertas y los desechos celulares por centrifugación. El sedimento final obtenido a partir del sobrenadante recogido de cada paso subsiguiente corresponde a la exosome, que se disuelve en solución de aislamiento para una mayor extracción de proteína, ARN y ADN. 1. Recolección de orina <ol><li> Antes de la recogida de orina, preparar cóctel inhibidor de proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 3,125 ml de este cóctel a un receptáculo estéril vacía. El tubo que contiene el cóctel inhibidor de la proteasa se puede distribuir a los voluntarios para la recogida de orina. NOTA: La razón de la adición de inhibidor de la proteasa es reducir al mínimo la degradación de proteínas en la muestra de orina. Aunque hemos utilizado específicamente un cóctel inhibidor de la proteasa deSigma, otros inhibidores de la proteasa comercialmente disponibles pueden ser sustituidos. </li><li> Recoger aproximadamente 10 ml de orina de primera evacuación. Procesar la orina inmediatamente después de la recolección sin almacenamiento o refrigeración. Aislar los exosomas urinario en duplicado utilizando el método de precipitación modificado; uno de los duplicados es para el ADN, el ARN total y la extracción de proteína, mientras que el otro es para la cuantificación de partículas de exosoma urinario. NOTA: Una muestra de orina de 24 horas se pueden recoger para el aislamiento exosome mediante el almacenamiento a 4 ° C. </li></ol> 2. La eliminación de los restos celulares y Tamm-Horsfall Proteína (THP) <ol><li> Transferir las muestras de orina de 15 ml tubos de centrífuga. Centrifugar 10 ml de orina a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar las células y los residuos celulares (Figura 1). </li><li> Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para su posterior procesamiento. Resuspender el precipitado en 500 l de solución de aislamiento (sacarosa 250 mM, 10 mM prueba lasanolamine, pH 7.6) seguido de 10 min de incubación con DL-ditiotreitol (DTT: concentración final de 200 mg / ml) a 37 ° C. NOTA: la TDT se añade para degradar THP, que atrapa los exosomas, lo que lleva a la disminución de los rendimientos. Tenga cuidado de dejar el pellet inalteradas durante la transferencia del sobrenadante, y confirme que el sobrenadante esté libre de pellets. </li><li> Muestras de pellets Vortex cada 2 minutos hasta que la pastilla se disuelva completamente. A continuación, añadir 500 l de solución de aislamiento al sedimento disuelto. </li><li> Inmediatamente después de la adición de solución de aislamiento al sedimento, se centrifuga a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipetear el sobrenadante y se combinan con el sobrenadante recogido antes. </li><li> Resuspender el precipitado en 50 l de solución de aislamiento para el análisis de SDS-PAGE. NOTA: PBS o TBS se pueden utilizar en lugar de solución de aislamiento para resuspender el pellet. </li></ol> 3. Aislamiento de exosome Pellet <ol><li> Para 11 ml de la supern recogidaatant, añadir 3,3 ml de reactivo de ExoQuick-TC y se incuba a 4 ° C durante al menos 12 h. NOTA: La relación de volumen de sobrenadante a reactivo ExoQuick-TC se puede ajustar para aumentar o disminuir el rendimiento exosomal. Hemos observado que menores volúmenes de reactivo añadido producen rendimientos más pequeños de exosomas. </li><li> Después de la incubación, se centrifuga la mezcla de muestra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis SDS-PAGE. </li><li> El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C para el ADN, el ARN y la extracción de proteínas y cuantificación de las partículas de exosoma usando ELISA 11 CD9. NOTA: El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C durante 1 año con la congelación y descongelación limitada. </li></ol> 4. La detección de biomarcadores y Análisis de exosome Pellet <ol><li> Para los análisis corriente abajo, extraer el ADN, ARN y proteínas a partir del sedimento usando el exosome / ARN / kit de aislamiento de proteínas de ADN y un ki aislamiento de ARNt de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar las concentraciones utilizando un espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm con 2 l de muestra. </li><li> Realizar cuantitativa en tiempo real RT-PCR (qPCR) utilizando ensayos TaqMan microARN (en nuestro caso, hemos utilizado miR-192- y 1207-5p específicas MIR ensayos humanos) o cebadores miRNA-específicos. </li><li> Para el análisis de SDS-PAGE, usar 4-12% de gel de Bis-Tris y muestras de proteínas separadas por electroforesis unidimensional. Visualizar geles utilizando el kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar análisis de transferencia de Western usando membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Use anticuerpo policlonal de conejo a la apoptosis ligada al gen-2 interactuando proteína X o ALIX y anticuerpo monoclonal de ratón a genes de susceptibilidad tumoral 101 proteína o TSG101 en la detección de Western blot. Cuantificar la densidad de las bandas por el libre acceso software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programa similar. </li><li> Cuantificar el número de partículas de exosoma urinarios obtenidos usando un kit de ELISA CD9 según las instrucciones del fabricante. </li></ol>

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<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
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<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
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<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

Las tasas de publicación de este artículo fueron pagados por OSE Biosciences.

La mayoría de los métodos que implican la precipitación de exosomas de la orina no se ocupan de la eliminación de la red polimérica formada por la proteína de Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente en grandes cantidades en la orina, donde supuestamente trampas exosomas durante la centrifugación inicial baja velocidad. En nuestro método modificado redujimos THP utilizando la TDT antes de la precipitación exosome. Como se muestra en la Figura 2, se observó una mayor cantidad de THP en la orina s...

Exosomas urinario son pequeñas vesículas internas de 100 nm de los cuerpos multivesiculares (MVB) derivados de todos los tipos de células en condiciones normales y patológicas en el espacio urinario incluyendo podocitos glomerulares, células del túbulo renal y las células que revisten los sistemas de drenaje urinario que parecen ser enriquecido para miRNAs 1 -2. Muchos investigadores han detectado proteínas distintas en exosomas aislados de la orina de individuos sanos, así como aquellos con insuficiencia renal y / o enfermedades sistemáticas 3-5. Los exosomas se pueden aislar utilizando diferentes métodos, tales como de dos etapas de ultracentrifugación diferencial con o sin sacarosa 6-7, la combinación de filtro nanomembrana con ultracentrifugación 8-9, 10-11 o precipitación. Recientemente hemos desarrollado un método simple, rápido, escalable y eficaz para aislar exosomas urinario y detectar miRNA y biomarcadores de proteínas 11. Aunque los biomarcadores pueden ser detectados en una variedad de diferentes fluidos biológicos, urine es la opción más conveniente para los pacientes con enfermedades de los riñones y del tracto urinario, ya que puede obtenerse en grandes cantidades de una manera relativamente no invasiva. Aunque existen varios métodos para aislar exosomas urinario 6-11, el procedimiento más comúnmente utilizado depende de ultracentrifugación diferencial con un colchón de sacarosa al 30%. Si bien este método es eficiente y la calidad de los exosomas resultantes aisladas con este procedimiento es alto, la técnica en sí requiere de personal capacitado y consume mucho tiempo, que requiere varios pasos de ultracentrifugación. Otros métodos, tales como filtración y precipitación, se han desarrollado para el aislamiento de exosomas, incluyendo uno que utiliza un reactivo de precipitación de propiedad (es decir, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Aunque precipitación usando este reactivo es rápido y relativamente fácil, la pureza de los exosomas aislados es baja en comparación con la ultracentrifugación metod. Recientemente nos comparamos seis métodos para el aislamiento de los exosomas urinario, incluyendo una modificación del método de precipitación usando ExoQuick-TC que hemos desarrollado en nuestro laboratorio 11. Encontramos que este método de precipitación modificado produjo mayores cantidades de proteína, miRNA y los ARNm y el procedimiento en sí era más rápido y más fácil de implementar que ultracentrifugación. Aquí se describe el protocolo experimental de nuestro método de precipitación modificado de una manera gradual, e incluir un análisis de las ventajas y desventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de aislamiento exosome. El método de precipitación modificada implica una precipitación inicial de partículas de exosoma, seguido de la eliminación de la proteína de Tamm-Horsfall, que se correlaciona con las proteínas exosomal, y se sabe que reducir el rendimiento exosome de la orina. Se encontró que estas modificaciones aumentan el rendimiento y la pureza de la preparación exosomal de la orina.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga Corning de 15 ml</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>utilizada a una concentración final de 200 mg/ml</td></tr><tr><td>Sistema Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 pocillos</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Para el análisis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ECL Advance Kit de detección de Western blot</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2135</td><td>Para la detección de biomarcadores con Western blot Sistema de</td></tr><tr><td>reactivos Exoquick-TC</td><td>Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>Para el aislamiento de exosomas</td></tr><tr><td>Exosoma CD9 ELISA Complete Kit System</td><td>Biosciences (SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>Para la cuantificación de exosomas</td></tr><tr><td>AllPrep Mini kit de ADN/ARN/Proteínas</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td>Para ADN, ARN, Aislamiento de proteínas</td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>para la cuantificación de proteínas</td></tr><tr><td>ProteoSilver Sliver Stain Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>Para la tinción de geles</td></tr> <tr><td>SDS-PAGESistema de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Para ejecutar los geles SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Para ensayos RT-PCR</td></tr><tr><td>Software qBasePlus v1.5</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>Para el análisis de datos de ensayos RT-PCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra ALIX</td><td>Millipore</td><td></td><td>Para la detección de biomarcadores</td></tr> <tr><td>por Western blotAnticuerpo monoclonal de ratón contra TSG101</td><td>Abcam</td><td></td><td>para la detección de biomarcadores por Western blot</td></tr></tbody></table>

un método de precipitación modificado para aislar urinaria exosomas

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

La identificación de biomarcadores que permiten la detección temprana de enfermedades renales en orina y plasma ha sido un área de interés activo durante varios años. Las vesículas urinarias de exosomas, de 40-100 nm de tamaño, son liberadas en la orina en condiciones normales por células de todos los segmentos de nefronas y pueden contener proteínas, ARNm y microARN representativos de su tipo celular de origen. En condiciones de disfunción o lesión renal, los exosomas pueden contener proporciones alteradas de estos componentes, que pueden servir como biomarcadores de la enfermedad. Actualmente existen varios métodos disponibles para el aislamiento de exosomas urinarios, y previamente hemos realizado una comparación experimental de cada uno de estos enfoques, incluyendo tres basados en ultracentrifugación, uno utilizando un concentrador de ultrafiltración de nanomembrana, uno utilizando un reactivo de precipitación comercial y uno utilizando una modificación de la técnica de precipitación utilizando el reactivo ExoQuick que desarrollamos en nuestro laboratorio. Descubrimos que el método de precipitación modificado produjo el mayor rendimiento de partículas de exosomas, miARN y ARNm, lo que hace que este enfoque sea adecuado para el aislamiento de exosomas para el posterior perfil de ARN. Concluimos que el método de precipitación de exosomas modificados ofrece una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas de la orina. En este informe, describimos nuestra técnica de precipitación modificada utilizando el reactivo ExoQuick para aislar exosomas de la orina humana.

Exosomas urinarios llevan proteínas, miRNA y de ARNm biomarcadores secretadas por las células epiteliales renales. El aislamiento y la detección de estos exosomas pueden proporcionar una herramienta de diagnóstico útil para la detección precoz de enfermedades renales tales como la nefropatía diabética. Hay varios métodos para el aislamiento de exosomas a partir de muestras de orina recogidas de sujetos humanos. Anteriormente comparamos seis métodos de aislamiento exosome orina y se investigaron resultante de proteínas, ...

Este manuscrito describe un protocolo para aislar exosomas de la orina humana utilizando una técnica de precipitación modificada.

Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

El objetivo general de este procedimiento es diseñar un método modificado de precipitación de exosomas que ofrezca una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas a partir de orina. Esto se logra primero eliminando células muertas grandes y restos celulares de la muestra de orina mediante centrifugación, y luego se transfiere el sobrenadante que contiene los exosomas urinarios a un tubo nuevo. En el segundo paso, el sedimento se disuelve en una solución de aislamiento que contiene DTT para eliminar la proteína TAM horse fall.Luego, tras una centrifugación adicional, el sobrenadante libre de TP se incuba con el reactivo Exo Quick TC durante la noche para precipitar los exosomas al día siguiente. Las muestras tratadas con el reactivo Exo Quick TC se centrifugan por última vez para obtener el botón de exosomas. Finalmente, se pueden realizar procesos posteriores, como inmunotransferencia por Western blot y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), sobre los exosomas para identificar los biomarcadores de interés.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la ultrafiltración por centrifugación y la precipitación es que el método arm no requiere pasos de ultracentrifugación, es fácil de realizar y relativamente rápido, y aún así proporciona un rendimiento alto y relativamente puro de exosomas para análisis moleculares posteriores. Antes de la recolección de orina, añada 3,125 mililitros de una mezcla fresca de inhibidores de proteasas a un recipiente estéril vacío, y luego recoja aproximadamente 10 mililitros de la primera micción en el recipiente. Transfiera la muestra a tubos cónicos de 15 mililitros.Téngase en cuenta que también se puede utilizar una muestra de orina de 24 horas para el aislamiento de exosomas, almacenándola a cuatro grados Celsius. Centrifugue los tubos durante 10 minutos a 17.000 ×g y 37 grados Celsius para eliminar o separar los restos celulares de los exosomas urinarios. A continuación, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y resuspenda el precipitado en 500 microlitros de solución de aislamiento.Incube el precipitado con DTT a una concentración final de 200 miligramos por mililitro a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Vortexee la muestra cada dos minutos. Luego, cuando el precipitado esté completamente disuelto, agregue 500 microlitros de solución de aislamiento a la muestra y centrifugue inmediatamente la suspensión resultante.Reúna el sobrenadante con el sobrenadante recolectado previamente y resuspenda el nuevo precipitado en 50 microlitros de solución de aislamiento. Para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS para aislar los exosomas, primero incube 11 mililitros del sobrenadante combinado con 3,3 mililitros del reactivo Exo-Quick TC a cuatro grados Celsius durante al menos 12 horas. Tras la incubación, centrifugue la muestra, luego transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS; el precipitado que contiene los exosomas urinarios se utiliza para extraer ADNARN o proteína, o se almacena a menos 80 grados Celsius.Utilice un espectrofotómetro NanoDrop para determinar las concentraciones de ADN y ARN de cada extracción midiendo la absorbancia a 260 y 280 nanómetros con dos microlitros de muestra. Se muestra una reproducción modificada de un análisis SDS-PAGE y detección de biomarcadores mediante análisis sanguíneo por inmunotransferencia en los carriles con orina no procesada y las primeras bandas proteicas del sedimento urinario correspondientes a 90-100 kilodaltons, que indican la presencia y la eliminación de la proteína TAM horse fall en el sobrenadante final y en los carriles del sedimento de exosomas, respectivamente. No se observó la banda de la proteína TAM horse fall, lo que indica la eliminación de esta proteína en etapas previas y un aumento consiguiente en el rendimiento del sedimento de exosomas.En este experimento, se detectaron los biomarcadores Alex y TSG 1 0 1 incluso cuando se utilizaron cantidades bajas de muestra, lo que indica un pellet de exosomas muy puro para el análisis de biomarcadores y la ausencia de proteínas solubles abundantes, incluida la proteína TAM horse fall. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad renal crónica utilicen exosomas aislados de orina para la detección temprana y el diagnóstico de nefropatía diabética.

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Los exosomas aislados en plasma se pueden utilizar como una forma no invasiva y repetible para la detección y el seguimiento de los biomarcadores para la detección temprana y la progresión de la enfermedad. Este vídeo describe el protocolo para la separación de exosomas de las muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, que podría utilizarse para extracciones de ADN y proteínas.

Aislamiento de exosomas: una técnica para separar exosomas del plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas

Este video describe una técnica de ultracentrifugación basada en la densidad para aislar exosomas de medios acondicionados recolectados de cultivos de células de riñón embrionario humano utilizando un cojín de sacarosa al 25% (p/p) preparado en óxido de deuterio. Los exosomas aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores.

Aislamiento de exosomas: una técnica de ultracentrifugación basada en la densidad que utiliza un cojín de sacarosa para separar exosomas de medios acondicionados de células cultivadas

En este artículo se presenta un método para el aislamiento de exosomas de sangre total y su posterior análisis mediante el seguimiento de nanopartículas utilizando un instrumento semiautomático. La tecnología presentada proporciona un método extremadamente sensible para visualizar y analizar partículas en suspensión líquida.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.

Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Aprende un método de precipitación modificado para aislar exosomas urinarios de forma rápida y escalable. Esta técnica facilita el análisis de biomarcadores mediante Western blot y qPCR.

Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

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