Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

El objetivo general del experimento es observar el efecto de la terapia antiangiogénica en un modelo murino de neovascularización corneal. Esto se logra aplicando brevemente una solución molar de hidróxido de sodio al ojo del ratón para inducir un nivel controlado de neovascularización corneal. Como segundo paso, el compuesto antiangiogénico se administra diariamente, lo que inhibe el crecimiento de nuevos vasos en la córnea lesionada.

A continuación, se sacrifica al ratón y se extrae el ojo lesionado, se disecciona y se tiñe con inmunidad. Con el fin de cuantificar el nivel de neovascularización e inflamación, los resultados muestran una reducción cuantificable de la neovascularización basada tanto en la observación clínica como en la inmunotinción. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia nuevas terapias para la ceguera corneal, ya que proporciona un nivel de neovascularización reproducible contra el que se pueden probar nuevos compuestos y terapias.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la neovascularización patológica de la córnea. También puedes ser un modelo para explorar los mecanismos de la angiogénesis y la inflamación en general. La demostración del procedimiento será un póster en mi laboratorio para prepararse para la lesión por quemadura alcalina.

Comience remojando un trozo redondo de papel de filtro, de aproximadamente dos milímetros de diámetro, en una solución de hidróxido de sodio molar. Luego anestesia a un ratón con una inyección de 100 miligramos por kilogramo, ketamina y cinco miligramos por kilogramo de xilacina. Después de uno o dos minutos, pruebe la profundidad de la anestesia pellizcando suavemente el dedo del pie o la cola del animal para asegurarse de que no haya respuesta.

Usando un gotero tópicamente, aplique una gota de clorhidrato de propano al 0,5% en la superficie córnea del ojo para la analgesia local y coloque al ratón bajo un microscopio quirúrgico. A continuación, utilice pinzas estériles para recoger el trozo de papel de filtro empapado en hidróxido de sodio y mire a través del endoscopio. Coloque el papel de filtro en la córnea central.

Déjalo durante 30 segundos para generar una quemadura alcalina aguda de aproximadamente dos por dos milímetros cuadrados. El segundo ojo del ratón no se lesiona y, por lo tanto, sirve como control interno. Después de quitar el papel de filtro, use una jeringa para enjuagar suavemente el ojo con 10 mililitros de un XPBS dos veces para lavar cualquier hidróxido de sodio residual de un molar.

Después del lavado, aplique inmediatamente una gota de una solución de trabajo X Saha por vía tópica en la córnea. Repita esta aplicación tres veces al día durante 14 días en los ratones de control. Después de la quemadura alcalina y un doble enjuague con PBS, aplique PBS DMSO diluido que no contenga saha diariamente durante 14 días. Durante este período de dos semanas, administre diariamente una solución líquida de gentamicina al 3% tanto a los ratones tratados con saha como a los ratones de control.

La evaluación clínica consiste en un examen diario de los ratones de forma ciega bajo un microscopio quirúrgico. Estos al menos dos observadores y registran una puntuación final que es el promedio de la puntuación de los dos observadores. Marque la opacidad de la córnea en una escala de cero a cuatro, donde cero es igual a completamente claro, uno es ligeramente borroso con el iris y la pupila.

Fácilmente visible, dos equivalen a ligeramente opaco con el iris y la pupila aún detectables. Tres es igual a opaco con la pupila apenas detectable, y cuatro es igual a completamente opaco sin vista de la pupila. Aquí se muestra una comparación de la puntuación de opacidad corneal.

Además, puntúe la neovascularización en una escala de cero a tres. Tenga en cuenta que todos los ojos tienen un anillo de vasos normales no patógenos alrededor de la córnea. Por lo tanto, una puntuación de neovascularización de cero significa que no hay neovasos.

Una puntuación de uno significa neovasos en el limbo corneal. Dos significa neovasos que atraviesan el limbo corneal y se acercan al centro corneal. Y tres significa neovasos que atraviesan el centro de la córnea.

Aquí se muestra una comparación de la puntuación de neovascularización. Agregue una puntuación adicional para el tamaño de los recipientes en una escala de cero a tres, donde cero equivale a que no haya nuevos vasos. Uno de ellos es igual a neovasos apenas detectables bajo el endoscopio quirúrgico.

Dos equivalen a neovasos que se ven fácilmente bajo el endoscopio quirúrgico, y tres son iguales a neovasos que se ven fácilmente sin el microscopio. Aquí se muestra una comparación de la puntuación del tamaño de los buques a los siete días y a los 14 días. Use una cámara digital para tomar imágenes representativas del ojo.

Después de sacrificar a un ratón, fije el ojo enucleado en aldehído paraformado al 4% durante al menos una hora a cuatro grados Celsius, y luego transfiera el ojo a un XPBS y use fórceps para eliminar cuidadosamente el exceso de tejido. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, utilice un microbisturí para perforar la región pericórnea del ojo. Esto debe liberar líquido del ojo con un par de tijeras quirúrgicas, iniciar la perforación y cortar la porción anterior del ojo.

Es decir, la córnea de la porción posterior. Transfiera la córnea de nuevo al 4% de paraldehído para su fijación durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente.

Deseche el 4% de formaldehído de acuerdo con las regulaciones y enjuague la córnea tres veces con un XPBS para eliminar cualquier aldehído paraforme residual. A continuación, incubar la córnea en un tampón de bloqueo durante al menos dos horas a temperatura ambiente para penetrar en el tejido y evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario. Aplique el anticuerpo primario en un tampón de bloqueo x en una dilución de 100 a 500 veces e incube a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente.

Lave la córnea seis veces con un tampón de lavado durante una hora cada vez. Para eliminar por completo cualquier anticuerpo primario no unido, este paso se lleva a cabo a temperatura ambiente. Aplique un anticuerpo secundario en un tampón de bloqueo x en una dilución de 500 a 1000 veces e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, lávese tres veces con un XPBS durante una hora cada uno a temperatura ambiente para eliminar por completo cualquier anticuerpo secundario no unido. Después de transferir la córnea a una nueva XPBS, use un microscopio quirúrgico para hacer cuidadosamente cuatro incisiones desde la periferia hacia el centro. Esto debería dividir la córnea en cuatro cuadrantes de aproximadamente el mismo tamaño.

La forma resultante debe parecerse más bien a una mariposa y permitir que quede plana en un tobogán. Transfiera la córnea a un portaobjetos y móntelo con un medio de montaje apropiado para imágenes fluorescentes para obtener mejores resultados. Las muestras deben ser fotografiadas inmediatamente, pero pueden almacenarse durante varias semanas protegidas de la luz a cuatro grados centígrados.

Siete días después de la lesión por quemadura alcalina, se puede ver claramente la progresión de la neovascularización corneal. Esta imagen muestra neovascularización en un ojo que no fue tratado con saha. Por el contrario, este ojo fue tratado tres veces al día con el inhibidor de la histona desacetilasa. Saha.

Nótese la diferencia en la opacidad de la córnea y la neovascularización entre los dos ojos, aquí se muestran montajes planos de la córnea una semana después de la lesión por quemadura alcalina. Estas córneas fueron tratadas con el vehículo control P-B-S-D-M-S-O durante esa semana. Las siguientes imágenes son de la córnea tratada con saha después de la lesión por quemadura alcalina.

La tinción verde muestra la tinción de células endoteliales vasculares con PE camm one y la tinción roja muestra la tinción de células endoteliales linfáticas con LYVE one. El tratamiento con saha resultó en una disminución drástica tanto de la angiogénesis como de la angiogénesis linfática. La córnea permite la tinción con PE camm one, que sirve como marcador de los vasos sanguíneos y LYVE one, que se une específicamente a los vasos linfáticos.

Esta imagen muestra la tinción fusionada de PE camm one LYVE one, lo que permite comparar la angiogénesis con la angiogénesis linfática, así como una comparación de la morfología celular diferente. Secciones sagitales usando F cuatro 80. Tinción de macrófagos y dpi.

Aquí se muestra la tinción de los núcleos celulares. Esta imagen fusionada F 4 80 y DPI muestra la infiltración de macrófagos en la córnea de un ojo quemado por álcali después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología exploraran la neovascularización corneal en modelos de ratón.