En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes in vivo de 360 grados de un ratón para determinar el ángulo óptimo para el análisis de fluorescencia. Esto se logra preparando primero los modelos animales de tumor cerebral ortotópico, tumor cerebral modificado y artritis. A continuación, se produce la proteína C de SAP y se preparan las nanovesículas SAP D-O-P-S-C-V-M.

A continuación, las nanovesículas se inyectan en la vena de la cola de los animales. Finalmente, se toman y analizan imágenes de fluorescencia y rayos X. En última instancia, se utiliza el método M-A-R-O-I para mostrar el ángulo óptimo para el análisis de imágenes de fluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes de fluorescencia plana 2D, es que el método M-A-O-M-A-R-O-I permite a los investigadores determinar el ángulo óptimo para el análisis de imágenes de fluorescencia. Las implicaciones de esta técnica se expanden hacia la terapia y el diagnóstico del cáncer y la artritis porque CEP CS Vesical puede dirigirse al tumor y al tejido inflamatorio. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cincinnati y la Fundación de Investigación del Hospital Infantil de Cincinnati para llevar a cabo estos estudios y ratones con tumores cerebrales ortotópicos.

Se utiliza un ratón con tumor cerebral modificado genéticamente y un modelo de ratón con artritis A-K-B-X-N De acuerdo con el protocolo de texto, utilice un sistema de puntuación macroscópica de índice artrítico para evaluar la artritis en ratones de la siguiente manera, cero equivale a no artritis detectable, uno es igual a hinchazón y/o enrojecimiento de la pata, o un dígito dos es igual a dos articulaciones involucradas. Tres equivalen a tres articulaciones involucradas y cuatro equivalen a artritis severa de toda la pata y el dedo producen la proteína C SAPs humana recombinante en las células E coli antes de precipitar con etanol y la purificación por cromatografía líquida de alta resolución después de la liofilización determina la concentración de SAP C seco en peso. Para mezclar la proteína SAP C, combine 0,18 miligramos de DOPS y 0,03 miligramos de CVM en un tubo de vidrio y use gas nitrógeno para evaporar los solventes lipídicos.

A continuación, añada 0,32 miligramos de proteína marina en polvo de SAP a la mezcla. Suspenda la mezcla seca en un mililitro de tampón PBS y baño sonicate durante 15 minutos. Pase la suspensión a través de una columna Cidex G 25 para eliminar el tinte CVM libre.

Las nanopartículas SAP C-D-O-P-S-C-V-M tendrán máximos de excitación y emisión de 653 nanómetros y 677 nanómetros respectivamente. Para probar el método de imagen óptica rotacional multiángulo o M-A-R-O-I utilizando el sistema Mars, después de anestesiar un ratón de uno de los modelos de ratón descritos con flúor ISO al 2%, coloque el ratón en posición supina en el sistema Marte con la columna vertebral dirigida hacia la cámara desde la pantalla de vista previa de la pestaña rotadora brucker MI, calibrar la película de soporte Mars de 380 grados. Para colocar el ratón para administrar los SAP C-D-O-P-S-C-V-M en la cola del ratón, inyecte 200 microlitros por vía intravenosa 24 horas después y, de nuevo, de siete a nueve días después de la inyección, tome imágenes de fluorescencia y rayos X en incrementos de 10 grados en un recorrido de 380 grados, creando una ligera superposición para garantizar que no haya huecos en el conjunto de datos rotacionales.

Utilizando el software de rotación Bruker, superposición de imágenes fluorescentes sobre imágenes de rayos X para la localización anatómica. Para analizar las imágenes, dibuje una región rectangular de interés, o ROI que abarque el ancho del campo de visión, o FOV del sitio de la enfermedad para ratones con tumores cerebrales. Utilice el mismo ROI en cada modelo de tumor y en los ratones de control respectivos para todos los puntos de tiempo utilizando puntos de referencia anatómicos para marcar la posición del ROI después de la sustracción automática de fondo.

Determine la intensidad de fluorescencia media para cada imagen utilizando el software Brucker MI para convertir las imágenes de fluorescencia en fotones por segundo por milímetro cuadrado, trace los valores de fluorescencia en función de los ángulos de la imagen y aplíquelos como barras de error. Desviación estándar de los valores medios de fluorescencia obtenidos de los ratones de control. En esta figura se muestra la imagen de fluorescencia de un ratón representativo portador de un tumor ortotópico.

Demostramos aquí que las semillas de SAPs, las nanovesículas DOPS marcadas con un tinte rojo lejano, se acumulan específicamente en tumores cerebrales ortotópicos y espontáneos de ratones, así como en articulaciones artríticas de ratones KBXN. El objetivo principal del sistema de Marte es determinar el ángulo óptimo de fluorescencia para que se puedan tomar las mediciones más precisas, como se ve aquí. El ángulo de imagen óptimo para este animal es de 10 grados.

La posición en la que la intensidad del fotón de fluorescencia es la mayor basal, las mediciones se tomaron antes de la inyección de SAP C-D-O-P-S-C-V-M, y 24 horas después de la inyección, los ratones de control libres de tumores recibieron un tratamiento similar. Estas cifras muestran datos comparables del modelo de ratón con tumores cerebrales modificados genéticamente. Las imágenes de fluorescencia y las mediciones de fotones se tomaron al inicio del estudio 24 horas y nueve días después de la inyección de SAP C-D-O-P-S-C-V-M.

Los gráficos muestran que el ángulo óptimo de imagen en el tumor animal portador de tumor mute 49 es de 20 grados, 24 horas después de la inyección, pero cambia a 10 grados nueve días después de la inyección. Esto sugiere que la alteración de la señal fluorescente se correlacionó con cambios morfológicos que probablemente reflejaban el crecimiento tumoral. Como se muestra en esta tabla, el método M-A-R-O-I demuestra claramente que la señal fluorescente disminuye para las proyecciones al aumentar la rotación lejos del ángulo óptimo de imagen.

En los tumores cerebrales se obtuvo una disminución media del 7% en la señal fluorescente. Si la orientación física del animal era de más o menos 10 grados, con respecto al ángulo óptimo de la imagen. Se midió una disminución promedio del 21% en la señal fluorescente a más o menos 20 grados.

Por lo tanto, desplazamientos relativamente pequeños desde el ángulo óptimo pueden dar lugar a disminuciones porcentuales significativas de la señal. El uso de la técnica M-A-R-O-I para el posicionamiento de imágenes permitirá a los investigadores producir datos más consistentes y confiables. Finalmente, se utilizó el método M-A-R-O-I para evaluar el objetivo de las articulaciones artríticas por las SAP C-D-O-P-S-C-V-M 24 horas después de la inyección.

Este animal anotó tres con tres articulaciones artríticas. Las imágenes de fluorescencia de la punta y el tobillo del ratón artrítico se muestran aquí basadas en gráficos de las mediciones de fotones correspondientes A rotaciones de 10 grados, los ángulos de imagen óptimos encontrados para la punta y el tobillo son 140 grados y 120 grados respectivamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y adquirir datos M-A-R-O-I que permitan a los investigadores determinar el ángulo óptimo para el análisis de imágenes de fluorescencia.