Name: Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica de gránulos de estrés G3BP en células primarias mediante microscopía confocal de tiempo real. Este método permite estudiar la respuesta celular al estrés en neuronas y fibroblastos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer la plataforma Montpellier Rio Imaging (MRI) en la que se realizaron las adquisiciones. Agradecen a Isabel Cristina López Mejía, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot y Virginie Georget por su ayuda en diferentes partes del protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Todos los procedimientos con animales en este protocolo son, en estricto apego a las directrices de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 24 de noviembre de 1986 (86-609/EEC). La casa de los ratones del grupo, permitiendo que los alimentos y el agua ad libitum. Mantener en un ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) con un 12 hr: 12 horas de luz: oscuridad ciclo (la luz a las 7:00 de la mañana). 1 Cultura de células murinas primarias:. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) <ol><li> Autoclave pinzas delgadas, así como pinzas curvas y tijeras de disección. Almacene en un recipiente estéril. Utilice estéril D-PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Preparar medio completo MEFs: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, y 0,5 mM de 2-mercaptoetanol y caliente a 37 ° C. </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas (13,5 días post-coito (dpc)) Por dislocación cervical. Retire los cuernos uterinos del ratón desinfectado con un 90% de EtOH. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en 37 ° C precalentado D-PBS. Abra el cuernos, el lugar los embriones en un 100 mm placa Petri de plástico estéril, limpiarlos a partir del material del cordón umbilical y lavarlos con agua tibia D-PBS para eliminar el exceso de sangre. En virtud de un binocular, retire las extremidades del embrión, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro. </li><li> En una nueva placa de Petri, picar el embriones en piezas muy pequeñas con una estéril quirúrgica cuchilla o tijeras (por lo menos durante 1 min). En el caso de los embriones de diferentes genotipos, tenga cuidado de poner cada embrión en platos individuales de Petri y mantener la cola o la cabeza superior para el genotipado. </li><li> Cubrir el embrión con 1x tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 h en una incubadora a 37 °. Añadir 10 ml de completaMEFs medio para detener la reacción con tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todos los agregados. Dejar reposar la suspensión de células en un tubo de 50 ml (llenado con medio completo) durante 10 min, y se centrifuga el sobrenadante durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en medio completo (6 ml para 1 embrión). Células nucleadas viables pueden contarse utilizando tripano azul (Alrededor de 5 x 10 6 células se puede esperar de un embrión). Placa 3 ml por 60 mm placa de Petri. </li><li> Cambie el medio al día siguiente y permiten que las células crezcan hasta que son confluentes los platos. Muchos tipos de células se pueden ver, pero sólo fibroblastos sobrevivirán subcultivo. </li><li> Dividir las células y les permiten crecer en placas de 35 mm con fondo de cristal (importante para el experimento lapso de tiempo), hasta el 50-70% de confluencia para la transfección. Prueba para Mycoplasma y patógenos del ratón. </li></ol> 2. Cultura Adaptations en el Caso de las neuronas <ol><li> El día anterior a la cultura, la capa 35 mm con fondo de cristal cajas de Petri con poli-L-lisina (200 l de 0,1 mg / ml) en una campana estéril y limpio, y dejar toda la noche. </li><li> En la mañana siguiente, enjuagar con agua pura estéril, dos veces por 5 min y una vez durante 45 minutos a 1 hora. Reemplace con 2 ml de DMEM más 10% de medio FBS y manténgalo en un incubador a 37 ° C. </li><li> Diseccionar embriones en el 18,5 dpc. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en frío HBSS estéril (solución salina equilibrada de Hank) en 100 mm de placa de Petri. Cachorros neonatales también se pueden utilizar en lugar de embriones con el fin de preservar la vida de la presa y le permiten producir más descendencia, especialmente en el caso de animales transgénicos que pueden ser difíciles de obtener. En platos individuales Petri, tome cada embrión o el recién nacido y cortar la cabeza con unas tijeras. Sostenga la cabeza mediante la inserción de pinzas curvas en los ojos, cortar la piel y con cuidado abra el cráneo blando de la parte posteriorde la cabeza hasta los ojos, a cada lado de la cabeza. Cortar los nervios ópticos y el tronco cerebral, retire el cerebro, y lo puso en una nueva placa de Petri que contiene HBSS. En virtud de un estereoscopio, quite todas las meninges utilizando dos pinzas finas. Separar el hipocampo, la corteza o cualquier otra parte del cerebro dependiendo de la estructura a estudiar. </li><li> Sumerja la estructura del cerebro disecado en 4,5 ml de HBSS frío preparado previamente en tubos de 15 ml y mantener en hielo hasta que la digestión con tripsina. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Enjuague el 3x tripsina con HBSS, siendo extremadamente cuidadoso para no descartar las partes del cerebro digeridos. </li><li> Resuspender en 500 l (hipocampos) hasta 1 ml (corteza) DMEM más 10% de SFB y pipetear hacia arriba y abajo varias veces con una micropipeta 1 ml equipado con una punta de 1 ml, a continuación, equipada con 1 ml en 200 l consejos, hasta que haya sin agregado visible. </li><li> Distribuir 100-200 l de suspensión celular a cada 35 mm de vidrio Bottom plato que contiene DMEM más 10% de SFB y dejar que las neuronas se adhieren a 37 ° C durante al menos 3 horas. Reemplazar por medio completo neurona precalentado (medio Neurobasal suplementado con 250 mM de L-glutamina y NS21, preparado como se describe en Chen et al. 19) y dejar a 37 ° C para permitir el crecimiento neuronal. Transfectar las neuronas en 5 a 14 días in vitro (div) (la eficiencia de transfección es mayor después de un par de conexiones sinápticas div pero son mejores estableció 7-10 div). </li></ol> 3. La transfección de los Constructos EGFP-G3BP1 Transfectar las células con un vector que contiene el ADNc de la proteína de interés (cualquier componente de SGS) fusionado a un marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 g de plásmido purificado por placa de 35 mm. <ol><li> Transfectar las MEFs utilizando un método comercial, siguiendo el protocolo del fabricante (Véase la Tabla de Materiales / Reactivos). </li><li> Transfectar las neuronas con un calciométodo del fosfato adaptado de Xia et al 20 Brevemente.: <ol><li> Preparar las soluciones: DMEM-wash: DMEM que contiene 25 mM KCl; solución de transfección: DMEM-lavado que contiene 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, rojo fenol); y la solución de choque: HeBS 1x, 1x DMKY, y DMSO al 2% (v / v); y mantenerlos a 37 ° C. </li><li> Retire el papel de las neuronas, filtrado, y la mantendrá a 37 ° C. Lavar con DMEM-wash luego vuelva a colocar con medio de transfección y mantenerse a 37 ° C durante la preparación de los precipitados de calcio en el ADN plásmido de fosfato. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir (en este orden) de agua Braun (volumen final 50 l), 5 l de CaCl2 2,5 M, y 3 g de ADN plásmido. Deja esta mezcla en 50 l de HeBS 2x ya introducidos en un tubo de polipropileno de fondo redondo. Mezclar el tubo por rotación junto con la caída. Que la forma precipitado a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir el precipitantee gota a gota sobre las neuronas y dejar a 37 ° C durante 30 a 50 min. </li><li> Reemplace con una solución de choque durante 1 minuto y luego enjuague con DMEM-lavado y finalmente reintroducir el medio preacondicionado. Mantener las células a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualización de G3BP Contiene Asamblea SG y Dinámica <ol><li> Sustituya el medio de las células que contiene rojo fenol por medio libre de rojo fenol. </li><li> Utilice un microscopio confocal equipado con fluorescencia para las adquisiciones. Encienda los sistemas de microscopios: lámpara de mercurio, el ordenador y los láseres. Calentar la cámara a 37 ° C al menos 20 min antes del comienzo de las adquisiciones. </li><li> La expresión más de G3BP induce la formación espontánea de un tipo de SGS. Las células pueden por lo tanto ser observadas para el montaje de SG de 24 horas después de la transfección sin inducción de estrés. Alternativamente, la tensión puede ser inducida para inducir aún más el montaje de SGS. Añadir arsenito de sodio 0,5 mM y la estrellat la adquisición justo después de la adición del compuesto (gránulos serán bien formadas dentro de 1 hora). </li><li> Añadir aceite al objetivo de inmersión (40X o 63X utilizar objetivos) e instale la placa de Petri sobre el objetivo en el soporte de microscopio adaptado 35 mm, estabilizado en el soporte de la platina. Compruebe que el plato es plana lo contrario las adquisiciones serán alterados. Encienda la luz de fluorescencia de acuerdo con el fluoróforo relevante y visualizar las células transfectadas. Apagar la fluorescencia una vez una célula de interés está en el campo con el fin de minimizar la decoloración y la citotoxicidad. </li><li> En el &quot;adquirir ficha&quot;, seleccione los láseres en función de la longitud de onda de excitación del fluoróforo tag (488 nm en el protocolo que utiliza G3BP etiquetados-EGFP) y seleccionar la longitud de emisión adaptado al PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar la potencia del láser (por lo general no más de 10%) para minimizar el ruido y la sobresaturación, así como la toxicidad, y establecer la ganancia y el desplazamiento para modificar la relación señal a ruido.Escaneado rápido (1000 Hz) con el fin de reducir al mínimo la duración de la exposición láser (línea media 2, promedio cuadro 1). Si lo desea, configure los parámetros de la pila de Z a ser capaz de reconstruir la imagen en 3D (un paso Z de 1 micra es generalmente muy bien con las células). Determinar el tiempo de intervalo entre cada adquisición: intervalos más pequeños permiten obtener una película más coherente pero esto puede inducir fotoblanqueo y la toxicidad (un intervalo de 20 seg se usó en los experimentos descritos). Duración de adquisición total puede variar dependiendo del tipo de estrés. Muchos SGS contiene G3BP-se forman muy rápidamente bajo tratamiento arsenito y son bien visibles después de 1 hora de tratamiento: en ese caso, elegir rápidamente las células para filmar y comenzar las adquisiciones justo después del estrés, con una duración total de las adquisiciones de 15 - 20 min más que suficiente para observar el montaje de varias Comisiones de Estudio. </li><li> Guardar las imágenes y la reconstrucción de las pilas y la película utilizando el software ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad. Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los pasajes. T...

Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral 1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de 2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación eucariota 2 α). SG son estructuras dinámicas que intercambian los componentes con los polisomas y otros gránulos como los P-cuerpos. Constituyen un &quot;centro de triage&quot;, donde los ARNm se clasifican y procesan, ya sea para la traducción, el reinicio, la degradación o el paquete en mRNPs no polysomal estables 3. El conjunto de SGS es rápido but es un proceso gradual con numerosos pequeños agregados iniciales, que se unen en gránulos más grandes. El uso de inhibidores químicos que interrumpen o estabilizar los microtúbulos muestra que se requiere la red de microtúbulos para la dinámica de SG incluyendo los procesos de montaje, coalescencia y desmontaje. El ensamblado dinámico de SGS también es promovida por la agregación de proteínas de unión de ARN-específicos (ARN-BP) como TIA-1 (de células T antígeno interna-1) y TIAR (proteína relacionada con el TIA-1), que son capaces de dimerizar y promover polysome desmontaje y el encaminamiento de los ARNm en SGS 4. G3BP (proteína de unión a dominio SH3 de RasGAP) es una ARN-BP tales que localiza a SGS cuando las células están estresados ​​con arsenito o alta temperatura, y la sobreexpresión de G3BP desfosforilado pueden inducir conjunto de SG 5. G3BP es un conservadas evolutivamente ARN-BP que se caracterizó inicialmente a través de su interacción con una proteína activadora de GTPasa Ras-(p RasGAP120 6); pero esta interacción ha sido recientemente revisada 7. La familia G3BP incluye dos miembros en los mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) y G3BP2 8. Ambas proteínas colocalize en SG, cuando las células son sometidas a estrés 9. G3BPs comprenden un dominio N-terminal NTF2 sugerido para influir en su localización y oligomerización, seguido de prolina ricos (PxxP) los motivos, a continuación, los motivos C-terminales asociados con RNA vinculante: la canónica ARN-Reconocimiento Motif (RRM) con RNP1 y RNP2 motivos conservados , seguido de una rica cuadro de arginina-glicina (RGG). Curiosamente, el análisis de diferentes partes de la proteína mediante la construcción de diferentes dominios fusionados a EGFP mostró que el dominio NTF2-y el dominio de unión al ARN fueron la reclutó más eficiente a SGS, lo que sugiere la importancia de las propiedades de la dimerización y de unión al ARN en la asamblea de SGS. Diversos modelos han revelado diferentes funciones de las proteínas G3BP in vitro 10-13.La interrupción de la G3BP en ratones han demostrado la importancia de esta proteína en el desarrollo del crecimiento y la supervivencia 14, así como un papel importante para G3BP en el Sistema Nervioso Central (SNC), caracterizado por ataxia y defectos en memoria de trabajo espacial 15. Deficiencia G3BP conduce a la alteración neuronal plasticidad y calcio homeostasis, estableciendo un vínculo directo entre la formación de SG y enfermedades neurodegenerativas 15. Es por lo tanto importante ser capaz de estudiar la dinámica de SG en células primarias como las neuronas. Este protocolo proporciona una manera simple de observar el conjunto de contener G3BP1-SG en células primarias bajo tratamiento arsenito. Se puede utilizar para estudiar el montaje SG bajo diferentes condiciones, por ejemplo, diferentes tipos de tensiones. También se puede adaptar a otros gránulos u otros constituyentes de SGS. De hecho, este protocolo se centra en G3BP1, pero hay otros marcadores de gránulos de estrés como TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (proteína X Frágil Retraso Mental Síndrome) 16, (proteína de unión a DNA respuesta transactivo 43) TDP-43 17 o Staufen 18. En particular, las proteínas como TIA-1 / R son, como G3BP, nucleación proteínas de unión de ARN que pueden inducir conjunto de SG cuando se sobreexpresa, incluso si los diferentes SG formados pueden diferir en función, regulación y transcripciones asociadas. La transfección de versión fluoróforo de etiquetado de cualquiera de estos componentes clave o nucleadores de SGS se puede realizar para la imagen de montaje y la dinámica particular, SGS.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Precalentamiento a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Fondo de vidrio B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Tratados o no (tratados: aumentan la adhesión de las células adherentes)</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Precalentamiento a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Precalentamiento a 37 &° C</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Muy finas, puntas de 0,1 mm (útiles para eliminar las meninges)</td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Muy finas, puntas de 0,1 mm</td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Puede ser útil para eliminar los hipocampos</td></tr><tr><td>Transfección Polyplus Reactivo JetPEI&nbsp;</td><td>Transfección Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs, siga el protocolo de avance</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser invertido</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de g3bp estrés gránulos dinámica en pilas en directo

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.

La formación de estrés gránulo es importante en la respuesta de las células al estrés, lo que permite una adaptación celular con traducción estancado, hasta que la tensión ha despejado, asociado a la prevención de la apoptosis. Permisos de este ensayo para estudiar los SG en células primarias, siguiendo la localización de los componentes clave de proteínas SGs (Figura 1). G3BP, un factor clave de reunión SG, está presente en lugar de modo difuso en el citoplasma de neuronas o MEFs (Figura 2A A</...

Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la dinámica de los gránulos de ribonucleoproteínas en células primarias, especialmente la formación de gránulos de estrés. Esto se logra primero cultivando células como fibroblastos embrionarios de ratón o neuronas hipocampales procedentes de animales de interés. Como segundo paso, se transfecta un componente marcado de los gránulos de estrés para permitir su visualización.A continuación, las células se inducen al estrés y se monitorean mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los resultados obtenidos muestran la dinámica de los gránulos de estrés que contienen G three BP one en neuronas mitóticas o del hipocampo, basándose en su visualización directa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la respuesta al estrés en células como las neuronas.Por ejemplo, en ratones, el silenciamiento del ARN y la inhibición de proteínas esenciales para los gránulos de estrés provocaron defectos neuronales. Por lo tanto, este método puede ayudar a comprender los mecanismos detrás de estas observaciones. Tras la eutanasia de un ratón preñado de E 13.5, sane el ratón con etanol al 90 % y extraiga los cuernos uterinos bajo una campana estéril.Transfiera los cuernos a DPBS a 37 grados Celsius y retire los embriones. Transfiera los embriones a una placa de 100 milímetros. Retire los tejidos en exceso y lávelos con DPBS tibio.Ahora, bajo un microscopio, retire las extremidades, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro. Las secciones de la cola o de la cabeza pueden utilizarse para la genotipificación. Pique los tejidos restantes en un recipiente separado durante al menos un minuto.No combine genotipos si deben variar dentro de la camada. Cubra el tejido picado con una vez tripsina EDTA e incúbelo durante 30 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, agregue 10 mililitros de medio mes completo.Para detener la reacción, suelte el tejido con una pipeta y transfiera la suspensión resultante a un tubo de 50 mililitros. Complete el tubo con medio y deje que el contenido se asiente. Luego, deseche por decantación las células en suspensión.A continuación, centrifugue la suspensión a 300 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, reuspenda el sedimento en seis mililitros de medio completo por embrión. El recuento de células nucleadas viables debe ser de aproximadamente 5 millones por embrión.Luego, cargue placas de 60 milímetros con tres mililitros de suspensión celular y cultívelas. Cambie el medio al día siguiente y permita que las células crezcan hasta alcanzar confluencia. Cuando las células se subcultiven, solo los fibroblastos sobrevivirán.Divida las placas confluentes en placas de vidrio de 35 milímetros. Cultive estas placas hasta alcanzar entre un 50 y un 70 % de confluencia y continúe con la transfección.Para cada placa de 35 milímetros, tenga tres microgramos de plásmido purificado para la transfección. El uso de un kit de transfección disponible comercialmente será suficiente. En este ejemplo, un vector que expresa el hueco de RAs.Se transfecta la proteína de unión de tres dominios SSH. Es un componente importante de los gránulos de estrés. El procedimiento, por supuesto, es aplicable al estudio de cualquier vector de interés en fibroblastos el día anterior a la recolección del cachorro.Prepare los platos recubiertos con lisina Pauline comenzando por recolectar embriones de hembras de 18,5 DPC y transfiriéndolos a HBSS en un recipiente grande. Si se desea, se pueden utilizar crías neonatales como sustituto para evitar el sacrificio de la madre. Corte la cabeza y extraiga el cerebro.Luego, recolecte los cerebros de las crías en un recipiente limpio con HBSS bajo un microscopio. Retire todas las meninges utilizando pinzas finas. A continuación, separe las partes deseadas del cerebro, como los hipocampos.Transfiera los tejidos a 4,5 mililitros de HPSS frío en tubos de 15 mililitros y manténgalos sobre hielo. Digerir los tejidos añadiendo 0,5 mililitros de solución de tripsina al 2,5 %. Incubar a 37 grados Celsius durante 15 a 20 minutos.Luego, enjuague la tripsina con tres lavados de HBSS teniendo cuidado de no perder ningún tejido. Ahora, re suspenda los tejidos en medio mililitro hasta un mililitro de DMM con 10 %FBS. A continuación, homogenice el tejido pasándolo a través de la pipeta.Luego, cambie a una punta de 200 microlitros y pipetee la solución hasta que no haya agregados visibles. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de la suspensión celular a placas de fondo de vidrio de 35 milímetros preparadas con medio DMM FBS e incube las placas. Después de tres horas de cultivo, reemplace el medio con medio completo para neuronas precalentado para el tiempo restante del cultivo.Después de cinco a 14 días en cultivo, transfiera las neuronas utilizando el método de fosfato de calcio. Veinticuatro horas después de una transfección exitosa, comenzará el ensamblaje de gránulos de estrés debido a la sobreexpresión de G three BP. Un estrés adicional inducirá aún más el ensamblaje de gránulos de estrés; precaliente los componentes del microscopio confocal durante al menos 20 minutos, incluyendo el calentamiento de la platina a 37 grados Celsius.Se requiere un portaplacas de 35 milímetros justo antes de visualizar las células. Haga lo siguiente. En primer lugar, sustituya cualquier medio celular que contenga rojo de fenol por uno sin rojo de fenol.Comience a capturar imágenes de las células inmediatamente. Los gránulos de estrés se formarán en menos de una hora, por lo que el estrés se inducirá después de la visualización de las células. Es importante comenzar las adquisiciones lo antes posible tras la inducción del estrés y ajustar con precisión dos parámetros según el tipo de célula y el tipo de proteína.La intensidad del láser y la duración de las adquisiciones deben ser bajas para reducir la citotoxicidad. A continuación, observe las células con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x y 63 x. Asegúrese de que la placa esté plana en el soporte y use la luz fluorescente de forma mínima.Una vez localizado un campo de interés, utilice el software para adquirir imágenes. Comience con la potencia del láser al 10 % o menos, y ajuste la ganancia y el desplazamiento para obtener la mejor relación señal-ruido posible. Escanee a 1000 hercios para minimizar la exposición de las células al láser, configure el corte óptico según sea necesario y mantenga el intervalo de escaneo lo más largo posible para conservar mejor la salud del cultivo.Adquiera datos durante el tiempo que sea necesario; en MEFs, los gránulos se forman dentro de los 10 minutos y son claramente visibles dentro de una hora. En neuronas, el proceso es un poco más lento. G tres BP debería proporcionar una señal razonablemente fuerte durante al menos 45 minutos utilizando las técnicas descritas.Se monitoreó la formación de gránulos de estrés en células cultivadas. La localización de la proteína marcada con G three BP era difusa en el citoplasma de las células cultivadas y también difusa en el citoplasma de las neuronas. Tras el tratamiento con arsonito, las proteínas se localizan claramente en focos definidos y más grandes en cualquiera de los dos tipos celulares.Estas son las granulas de estrés. Las imágenes obtenidas pueden reconstruirse en una película de lapsos de tiempo. El primer y segundo video muestran fibroblastos respondiendo al estrés.El tercer video muestra lo mismo. En una neurona del hipocampo, las reconstrucciones de Zack ofrecen la localización tridimensional de la proteína G tres B bp marcada y, por tanto, una perspectiva diferente sobre el seguimiento. Tras seguir este procedimiento, se puede utilizar la inmuno citroquímica para visualizar los componentes del gránulo tras diferentes tipos de estrés y tras la auto fijación.Esto puede responder preguntas cuantitativas sobre el tamaño y el número de los diferentes cuerpos celulares en distintas condiciones.

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Este video muestra un ensayo para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos, que consisten en ARNm, proteínas de unión a ARN (RBP) y varias otras proteínas.

Un ensayo de inmunofluorescencia para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos

Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Los colorantes fluorescentes vitales son herramientas esenciales para el análisis de imágenes de células vivas en la biología moderna de células fúngicas. Este artículo detalla la aplicación de colorantes fluorescentes establecidos y menos conocidos para el seguimiento de la dinámica de la membrana plasmática, la endo-/exócicosis y la morfogénesis de la pared celular en hongos filamentosos.

Aplicación de colorantes fluorescentes selectivos de membrana y pared celular para imágenes de células vivas de hongos filamentosos

Presentamos un flujo de trabajo de libre disposición construido para la exploración rápida y el análisis preciso de cuerpos celulares en compartimentos celulares específicos en imágenes de microscopía de fluorescencia. Este flujo de trabajo fácil de usar está diseñado en el software de código abierto Icy y también utiliza funcionalidades ImageJ. La canalización es asequible sin conocimientos en el análisis de imágenes.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

Aprende a visualizar la dinámica de gránulos de estrés G3BP en células primarias mediante microscopía confocal de tiempo real. Este método permite estudiar la respuesta celular al estrés en neuronas y fibroblastos.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

Explorar más videos