Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la eficacia citotóxica de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma. Esto se logra midiendo primero la absorción intracelular del fotosensibilizador M-T-H-P-C por parte de las células de osteosarcoma. En el segundo paso, se aplica luz láser a las células para activar el M-T-H-P-C y producir radicales de oxígeno citotóxicos.

Por último, el metabolismo celular y el número de células se miden mediante un ensayo de tetra oleum soluble en agua uno o WST uno. En última instancia, el ensayo WST, así como el recuento celular directo, se pueden utilizar para medir la citotoxicidad de la terapia fotodinámica en las células de osteosarcoma. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del osteosarcoma, ya que permite medir la eficacia de la terapia fotodinámica in vitro y se asemeja a la técnica utilizada actualmente en los pacientes.

Para comparar la absorción de M-T-H-P-C entre líneas celulares de osteosarcoma, comience por la siembra de 0,2 veces 10 al sexto Hoss y 143 células B por pocillo. Por triplicado en placas de seis pocillos, deje que las células se adhieran durante la noche a una fluidez del 80 al 90%, y luego, al día siguiente, incube las células con una concentración fija de M-T-H-P-C durante diferentes períodos de tiempo en la oscuridad para evaluar la absorción dependiente del tiempo del fotosensibilizador por parte de las células. Después de las incubaciones, aspire el medio y lave las células tres veces con PBS, luego separe las células con 0,5 mililitros de tripin EDTA y cuéntelas.

A continuación, gire las células durante cinco minutos a 400 veces G y temperatura ambiente. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet en PBS hasta una densidad final de dos veces 10 por la quinta celda por mililitro. Pipetee 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de un 96.

Cubra y mida la fluorescencia de las células en un espectrofotómetro de fluorescencia configurado a 417 nanómetros de excitación y 652 nanómetros de emisión. A continuación, prepare una curva estándar colocando 100 microlitros de cero a cuatro miligramos por mililitro de concentraciones de M-T-H-P-C por triplicado. En una placa de 96 pocillos y mida la fluorescencia como se acaba de demostrar para generar una curva estándar para calcular la unidad de fluorescencia relativa de cada célula que contiene pocillo a partir de la placa medida anteriormente.

Para medir la fototoxicidad del fotosensibilizador, primero siembre 3000 células por pocillo por triplicado por cada concentración de M-T-H-P-C en una placa de 96 pocillos, incluidas las celdas de control de toxicidad oscura para cada concentración de fotosensibilizador. Deje que las células se adhieran durante la noche a una fluidez del 50 al 60% al día siguiente. Incubar las células con un rango de concentraciones de M-T-H-P-C en la oscuridad durante cinco horas después de la incubación.

Aspire el medio y lave las células dos veces con PBS y agregue medios nuevos sin M-T-H-P-C luego específicos para el espectro de absorción M-T-H-P-C, usando la protección ocular adecuada. Ajuste un láser de diodo de 652 nanómetros a una potencia de 21,88 milivatios por centímetro cuadrado a una altura de 13,5 centímetros. Distancia de las células para obtener una dosis energética de cinco julios por centímetro cuadrado.

A continuación, ilumine las células, excepto las células de control de toxicidad oscuras, durante 230 segundos después de la iluminación. Mantenga las celdas en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 24 horas. Posteriormente, agregue 10 microlitros de wst, un reactivo por cada 100 microlitros de medio, tres horas después de la adición del wst, un reactivo mida la absorbancia de los pocillos individuales a 415 nanómetros.

Por último, calcule el número de células supervivientes además del ensayo WST. El recuento directo de las células es un segundo método para medir la toxicidad celular. Para calcular el porcentaje de células viables, siembre dos veces 10 a la cuarta celda por pocillo en 2 placas de 24 pocillos y deje que se adhieran durante la noche.

Al día siguiente incubar las células durante cinco horas en la oscuridad con M-T-H-P-C e iluminarlas como se acaba de demostrar. Mantenga las celdas de control oscuras en la oscuridad después de 24 horas, recoja el sobrenadante, lave las células una vez con PBS y ojos de tripsina, finalmente gire las células y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de medio fresco para contar. Los resultados ilustrados en este gráfico muestran en el panel superior la absorción de M-T-H-P-C de una manera dependiente del tiempo con una intensidad de fluorescencia de la suspensión celular que representa los niveles intracelulares de M-T-H-P-C.

En el panel inferior. La absorción de M-T-H-P-C dependiente de la dosis se puede evaluar midiendo la fluorescencia de M-T-H-P-C con un espectrofotómetro de fluorescencia. Este gráfico ilustra la absorción de una concentración fija de M-T-H-P-C de una manera dependiente del tiempo con la intensidad de fluorescencia de la suspensión celular que representa los niveles intracelulares de M-T-H-P-C.

En este gráfico, se muestra la absorción de M-T-H-P-C dependiente de la dosis en Haass y 143 células B después de una incubación de cinco horas. La absorción en la línea celular 143 B de alta metástasis fue significativamente mayor que en la línea de células huésped parentales de baja metástasis. Se demuestra la toxicidad oscura dependiente de la dosis de las células del osteosarcoma.

Se trataron 143 células B con diferentes dosis de M-T-H-P-C y se compararon con las células no tratadas, y se observó una disminución dependiente de la dosis de la actividad metabólica y del número de células medido por un ensayo de WST. Se reconoció una disminución de la viabilidad celular a una concentración de M-T-H-P-C igual y superior a 2,5 microgramos por mililitro. En el gráfico inferior, se ilustra la toxicidad dependiente de la dosis de M-T-H-P-C.

Las células fueron tratadas con diferentes dosis de M-T-H-P-C y posterior iluminación a cinco julios por centímetro cuadrado. Se observó una disminución consecuente en la actividad metabólica celular, así como una disminución en el número de células. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer aplicaran estos métodos a modelos in vivo de osteosarcoma, así como para otras investigaciones preclínicas.