Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Esta tecnología microfluídica tiene como objetivo medir la funcionalidad de los neutrófilos humanos directamente a partir de una gota de sangre en una plataforma que puede ser multiplexada. La cámara de carga central sirve como fuente de sangre completa y también actúa como sumidero para los gradientes de atrayentes de quimioterapia que se forman a partir de las 16 cámaras quimiotácticas focales. La filtración mecánica única de los glóbulos rojos permite sondear la función de los neutrófilos en el contexto natural de los componentes sanguíneos, celulares y bioquímicos.

La bifurcación entre un canal que conduce a la cámara quimiotáctica focal y un canal que sale del dispositivo permite cuantificar y modular la direccionalidad de los neutrófilos migratorios. Por lo tanto, los resultados pueden demostrar cómo los neutrófilos que migran activamente migran fácilmente más allá de los glóbulos rojos atrapados y se acumulan en cantidades con el tiempo. Una característica única de nuestros dispositivos microfluídicos es que son muy fáciles de fabricar y configurar.

Consisten en una capa de PDMS fundida sobre una oblea microfabricada que unimos en un fondo de vidrio, placa de uno o varios pocillos. La principal ventaja de esta técnica es que solo requiere una gota de sangre entera. Los dispositivos se pueden utilizar con pipetas estándar, no tienen partes móviles, no requieren tubos ni bombas de jeringa externas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a aplicaciones clínicas en comparación con las que se requieren con las técnicas tradicionales. Nuestro enfoque toma minutos desde el momento de la recolección de sangre hasta los ensayos de migración de neutrófilos. Los novedosos peines filtrantes de glóbulos rojos evitan que los glóbulos rojos bloqueen la migración activa de los neutrófilos y diferencia este método de otros métodos microfluídicos.

Eso requiere extraer la sangre antes de que se realicen los ensayos de quimioterapia. La interferencia mecánica de los glóbulos rojos y los canales sanguíneos distingue nuestra tecnología y permite la prueba de neutrófilos en nuestro entorno fisiológico de sangre completa, incluidos el suero y las plaquetas. Por lo tanto, la tecnología es precisa y fácil de usar, y puede avanzar significativamente en nuestra comprensión del papel de los neutrófilos y el sistema inmunitario innato C en la salud y la enfermedad.

Fabrica la oblea de molde maestro para definir los canales de migración de acuerdo con las instrucciones del primer patrón del fabricante. La primera capa fotorresistente negativa a base de epoxi de tres micras luego modela la segunda capa de 50 micras para definir la carga celular y las cámaras de quimiocina. Ahora, a los dispositivos de polimetil-soano fundidos, mezcle vigorosamente 20 gramos de PDMS con dos gramos de iniciador durante cinco minutos.

Vierta con cuidado el PDMS sobre la oblea estampada y desgasifique al vacío durante una hora. A continuación, hornee y cure los dispositivos microfluídicos PDMS en un horno a 65 grados centígrados durante al menos tres horas. Para asegurarse de que el PDMS se hornee a la temperatura correcta, asegúrese de controlar la temperatura interna del horno con un termómetro.

Perfore las cámaras centrales de carga de sangre entera de 1,5 milímetros de diámetro. También perfora dispositivos enteros en forma de rosquilla de 5,0 milímetros de diámetro. Retire las partículas de los dispositivos de rosquillas con cinta adhesiva.

A continuación, enjuague una placa de varios pocillos con agua desionizada y séquela con nitrógeno después de colocar la placa en un horno a 60 grados centígrados durante cinco minutos. Tratamiento con plasma de oxígeno durante 35 segundos. Luego agregue los dispositivos de rosquilla y el plasma de oxígeno.

Vuelva a tratar durante otros 35 segundos. Transfiera con cuidado los dispositivos a los pocillos del plato y hornee con dispositivos adheridos en una placa calefactora a 80 grados centígrados durante 10 minutos. Después del tratamiento con plasma de oxígeno, el dispositivo es hidrófilo y los efectos capilares pueden promover el cebado de los pequeños canales en el dispositivo.

Para la solución quimioatrayente, mezcle cinco microlitros de FMLP de 10 micromolares con cinco microlitros de un miligramo por mililitro de fibronectina y 490 microlitros de HBSS. Pipetee lentamente la solución de atrayente de quimioterapia en la pipeta de la cámara de carga de sangre completa y 20 microlitros adicionales del atrayente de quimioterapia alrededor del exterior del dispositivo. Coloque el plato en un desecado durante 15 minutos.

Aplique una aspiradora al dispositivo para cebarlo con una solución atrayente de quimioterapia. Retire la placa del desecado y confirme la humectación del canal del dispositivo mediante la disminución gradual del tamaño de la burbuja de aire. Luego, lave a fondo toda la cámara de carga de sangre y el exterior del dispositivo para eliminar el exceso de solución atrayente de quimioterapia.

A continuación, generar un gradiente de quimioatrayente desde cada una de las cámaras quimiotácticas focales hasta el centro del dispositivo. Inyecte suavemente 100 microlitros de PBS en el orificio para que se forme una gota de PBS en la parte superior del dispositivo. Incline la placa y pipetee un mililitro de PBS alrededor del dispositivo para recoger en el fondo del pocillo, aspirar el líquido y repetir el lavado de PBS tres veces.

A continuación, llene cada pocillo con medios para sumergir los dispositivos y espere 15 minutos para que el degradado se estabilice. A continuación, pipetee lentamente dos microlitros de sangre entera en cada cámara de carga de sangre entera. Para la recolección de sangre por punción en el dedo, lávese las manos con agua y jabón.

Secar la piel como una solución anticoagulante para las manchas. Añade un mililitro de 0,2%HSA y 10 microlitros de ganchos de 32,4 micromolares. Tinte en un tubo de extracción de sangre con heparina, pincha el dedo del donante sano y limpia la primera gota de sangre.

Recoja 50 microlitros de sangre en la solución anticoagulante para la tinción y mezcle suavemente. Configure la biocámara a 37 grados Celsius, 80% de humedad y 5% de CO2. Inicie inmediatamente la generación de imágenes de lapso de tiempo con un aumento de 10x o más para un análisis estadístico significativo, rastree manualmente al menos 50 neutrófilos en cada muestra.

Cuente las células que ingresan a las cámaras de quimiotaxis focal a lo largo del tiempo. Luego, usando la imagen J, calcule las velocidades de los neutrófilos en el canal entre el WBLC y el FCC. Luego, para cuantificar la direccionalidad de los neutrófilos, cuente el número de células que pasan la bifurcación y calcule la relación entre el número de células que giran hacia las cámaras de quimiotaxis focal y las células que salen del dispositivo.

Las células que no son direccionales no siguen el gradiente quimiotáctico y, por lo tanto, migran en números iguales hacia el FCC y el canal de salida. En este experimento, el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos en sangre total se validó midiendo la acumulación de neutrófilos hacia un gradiente FMLP. Los resultados confirman que los glóbulos rojos son atrapados por el peine de filtración, mientras que los neutrófilos son capaces de migrar activamente fuera de la sangre completa.

El gradiente lineal estable de quimioatrayente formado por el dispositivo microfluídico de sangre total se confirmó utilizando dextrano marcado con FSE y los niveles de fluorescencia se midieron a lo largo del tiempo. Los resultados obtenidos utilizando la novedosa plataforma WB Chemotaxis revelan que los neutrófilos de todas las fuentes sanguíneas migran con una velocidad constante y con células migratorias totales similares. Es importante destacar que este sistema permite la cuantificación de los neutrófilos, por lo que diferencia la quimiotaxis de la quimiocinis Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 10 minutos si se realiza correctamente.

La incorporación de nuestro dispositivo en una placa de 12 o 24 pocillos utilizando técnicas estándar de sala limpia, instalaciones, el cribado de múltiples condiciones simultáneamente. Con esta técnica, podemos medir la velocidad y la direccionalidad de los neutrófilos a nivel de una sola célula. A diferencia de los métodos tradicionales que miden la migración masiva de células de punto final, recuerde cebar cuidadosamente el dispositivo microfluídico y cargar ambas muestras lentamente para que los glóbulos rojos no sean empujados más allá del com del dispositivo.

El protocolo descrito es particularmente útil para medir las deficiencias quimiotácticas transitorias de neutrófilos, ya que permite muestreos repetidos en múltiples puntos de tiempo, pero también podría adaptarse para medir la migración de otros tipos de células de diferentes organismos modelo. Este método puede proporcionar información sobre las alteraciones temporales de la funcionalidad de los neutrófilos en pacientes con diversas afecciones asociadas con una mayor incidencia de infecciones, incluidos los pacientes con traumatismos, los pacientes después de una cirugía mayor y los pacientes con cáncer que reciben quimioterapia.