Name: Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de sensibilización de AMPc en células para cribado de alta producción usando células criopreservadas y tecnología HTRF. Este método permite identificar vías moleculares esenciales en un solo día.

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Los autores desean dar las gracias al Sr. Richard Zink y Todd Wiernicki para la formación metodológica y orientación ensayo. También agradecemos a John Paul Spence para lectura cuidadosa y sugerencias editoriales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, y Eli Lilly and Company a través del Programa de Premios de Investigación Lilly (LRAP).

1. Expansión y Criopreservación de Células de Ensayo Ready <ol><li> Cultivo de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) en una célula plato de 15 cm 2 cultura en medio F12 de Ham suplementado con 1,0 mM de L-glutamina, 800 mg / l de G418, 300 mg / l de higromicina, 100 U / l penicilina, 100 mg / l de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 hasta que las células son 90-95% de confluencia. Lavar las células con 10 l tampón fosfato salino (PBS), y cosechar las células mediante la adición de 3 l de tampón de disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Resuspender las células por medio de 12 l de los medios de cultivo y contar las células mediante exclusión con azul de tripano. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 l de medio de congelación (10% de sulfóxido de dimetilo, 90% de FBS). Diluir la suspensión de células para conseguir la concentración celular deseada (por ejemplo, 1-20 x 10 6 células / l). </li><li> Alícuota de 1,0 l de solución de células a cada criovial. Incubar los crioviales en un recipiente de congelación de células a -80 ° C durante la noche. Transfiera los crioviales a un tanque de N2 líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 2. Plating ensayo Células Ready (y Opción transfección inversa) <ol><li> Rápidamente descongelar un criovial congelado de las células en un 37 ° C baño de agua. Una vez que las células se descongelan, transferir las células a un tubo cónico de 15 l que contiene 9 l de Opti-MEM, y mezclar invirtiendo el tubo 3-5x. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 l de Opti-MEM. </li><li> Contar las células mediante exclusión con azul de tripano para determinar la viabilidad celular y diluir las células viables como sea necesario (por ejemplo,. 3 x 10 5 células / l de concentración) enOpti-MEM. Placa 10 l / pocillo de células en un cultivo de tejido tratado placa de 384 pocillos usando una pipeta multicanal. </li><li> Hacer diluciones en serie de AMPc en Opti-MEM para generar una curva patrón para la estimación de la producción de AMPc por las células (de acuerdo con recomendaciones de los fabricantes - véase la Sección 7). Añadir 10 l / pocillo de los patrones de AMPc a la placa Nota:. Una sola curva estándar se puede preparar en una placa separada o pocillos de blanco en una de las placas de ensayo. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 1 hora. </li></ol> 3. Invertir Opción transfección siRNA * Esta sección es opcional y relevante a la figura 3. <ol><li> Preparar una solución de siRNA en ddH RNasa libre 2 O (por ejemplo, 0,4 pmol / l). Añadir 5 l a pocillos individuales de la placa de 384 pocillos, y centrifugar la placa a 100 g durante 15 síC a temperatura ambiente. </li><li> Diluir Lipofectamine 2000 en Opti-MEM por un factor de 0.006 (por ejemplo, añadir 6 l de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), y mezclar pipeteando arriba y abajo. </li><li> Incubar la solución de Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 5 l de la solución Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluido a pocillos individuales de la placa de 384 pozos que ya contiene siRNA. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la placa durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Células listos ensayo de placa como se describe anteriormente (Sección 2). Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva placa de ensayo para humidificado incubadora a 37 ° C (5% de CO 2) por 48 a 96 horas según lo determinado por génica dirigida tumbar (véase el debate). </li></ol> 4. Screening de moléculas pequeñas <ol><li> Se diluye el fármaco de interés (por ejemplo, los inhibidores de la. Molécula pequeña) en Opti-MEM a 6x las concentraciones finales deseadas. Las diluciones en serie se puede completar utilizando pipetas de mano o una estación de tratamiento de líquidos. </li><li> Añadir 2,5 l / pocillo del compuesto de ensayo o tampón que contiene vehículo (por ejemplo, DMSO) para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente (de incubación es opcional). </li></ol> 5. Tratamiento Agonist persistente <ol><li> Preparar un 600 nM (es decir. 6 veces la concentración final deseada de 100 nM) solución de quinpirol en Opti-MEM. </li><li> Añadir 2,5 l / pocillo de la solución quinpirol nM 600 para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 2 horas. </li></ol> 6. Estimulación de la acumulación de AMPc <ol><li> Durante la incubación de 2 horas, se preparan los stimulatien solución en Opti-MEM. La solución estimulación se compone de 40 forskolina M, 2 M 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), y 4 M espiperona (todas las concentraciones en el paso 6 se 4x la concentración final deseada). </li><li> Añadir 5 l / pocillo de la solución de estimulación para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. </li></ol> 7. Temple y Estimación de la acumulación de AMPc <ol><li> La producción de AMPc por las células se midió usando el kit de cAMP dinámica 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, reconstituir anti-AMPc-criptato y cAMP-D2 en agua destilada. Congele alícuotas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li><li> Diluir una alícuota de anti-AMPc-criptato y una alícuota de AMPc-D2 por separado en el tampón de lisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante para hacer soluciones de trabajo. </li><li> Ladd 10 l / pocillo de la solución de trabajo anti-cAMP criptato y 10 l / pocillo de la solución de trabajo cAMP-d2 a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Leer la placa en un lector de placas de fluorescencia (ajuste de escala automática de la sensibilidad), utilizando una excitación de 337 nm y medir las emisiones a 620 nm y 665 nm por las instrucciones del fabricante. </li><li> Aplicar el análisis radiométrico para evaluar la curva patrón de AMPc por las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores resultantes, extrapolar la acumulación de cAMP estimada en los pozos de prueba utilizando el software de análisis de datos. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En un esfuerzo para facilitar los estudios de sensibilización heteróloga, que ampliamente hemos modificado nuestro método anterior logrando un ágil &quot;mezcla y leer&quot; formato que es modificable a la detección y el mecanismo de examen de acción de alto rendimiento. Las principales modificaciones a nuestro protocolo se pueden resumir de la siguiente manera: 1) el uso de células crioconservadas como reactivos de ensayo &quot;-listo&quot;; 2) la miniaturización del ensayo en formato de 384 pocillos, y 3) la utilizaci...

Un adenililciclasa adaptativo (AC) de señalización de respuesta conocido como heterólogo o sensibilizantes fue descubierto en el laboratorio del premio Nobel, el Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg propuso que el aumento de la capacidad de respuesta de CA observado después de la activación del receptor opioide δ crónica era un mecanismo implicado en la tolerancia y dependencia de opiáceos 1. Además de la activación del receptor opioide δ crónica, esta respuesta neuroadaptativos de la señalización de AC también se produce tras la activación persistente de varios otros receptores / o acoplados a Gai 2. En particular, muchos de estos receptores se asocian con el dolor, los trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, e incluyen opioide μ / κ, D 2/4 de dopamina, 5HT 1A, y M 2/4 receptores muscarínicos 2. Además de los descubrimientos del Dr. Nirenberg, un gran cuerpo de evidencia existe vinculación de la sensibilización de la señalización de CA a la activación del receptor opioide crónica tanto <em&gt; in vitro e in vivo 3-7. Sensibilización de CA también se ha asociado con una variedad de enfermedades que implican los receptores de dopamina D 2-como incluyendo la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson (para una revisión véase la referencia 2). A pesar de la importancia potencial de sensibilización, el mecanismo exacto (s) asociado con la activación persistente Gai / o-receptor acoplado a que conduce a un aumento de la capacidad de respuesta de CA permanece en gran medida desconocido. Estos estudios proporcionan la justificación para el examen de los mecanismos para la sensibilización de la guanilato ciclasa como un objetivo importante neurobiológica. Igualmente, el relevancia fisiológico AC señalización 8 e importancia que isoformas AC individuales sostienen este respuesta adaptativa deberían reconocerse 2,9,10. En el contexto de nuestra investigación, las características generales asociados con la sensibilización heteróloga de las isoformas recombinantes de AC son paralelas a las características described para el estudio de las isoformas endógenas de CA. En concreto, la investigación anterior ha encontrado que la activación de las proteínas Gai / O y subunidades posterior liberación / reordenamiento βγ son requisitos importantes para la sensibilización del receptor inducida de todas las isoformas de CA. Además, varios estudios sugieren que la señalización de las proteínas quinasas y subunidades Gβγ están involucrados en la sensibilización 2,11-13. CCAA individuales también muestran patrones de sensibilización únicas y distintas 12. Por ejemplo, la exposición persistente de los receptores D2 de agonistas se asocia con la sensibilización de AC1 y AC8 a Ca 2 + estimulación / calmodulina 14,15, mientras que el AC3 estrechamente relacionada no está sensibilizado 2. AC2, AC4, y AC7 están estrechamente relacionados, sin embargo, sólo la actividad AC2 estimulado PKC-se sensibiliza con firmeza después de la exposición prolongada de los receptores D2 de agonistas 7,14,16,17. Además, AC5 y AC6 muestran un notable grado de hetersensibilización ologous a gas y la acumulación de AMPc estimulada por forskolina después de la activación de los receptores D 2 14,18-20, pero parecen diferir en su requisito para Gβγ subunidad-CA interacciones 21. Aunque la mayoría de los estudios de la sensibilización de CA han utilizado líneas celulares de modelo (por ejemplo, células HEK293 que expresan isoformas individuales AC), parece que estos resultados se traducen en modelos de células neuronales nativos 4,22. Más recientemente, los efectos de la selectivos inhibidores de moléculas pequeñas de isoformas de CA identificados en células HEK293 que expresan isoformas de CA también se pueden traducir in vivo para estudios de comportamiento 23. La falta de un mecanismo molecular identificado para la sensibilización heteróloga probablemente refleja la complejidad de la respuesta adaptativa, así como las propiedades reguladoras únicas de la persona de CA isoformas 12. Desentrañar esta complejidad se complica aún más por el uso de engorrosos metodología tsombrero ha limitado los investigadores académicos de emplear imparciales enfoques. Por ejemplo, nuestros estudios mecanísticos anteriores implicaban el uso de modelos celulares cultivadas continuamente usando 24 - y 48-así formato de cultivo de tejidos 15. Las células cultivadas se cultivan normalmente durante 48 horas y después se sometieron a tratamiento farmacológico agonista (2-18 hr) seguido de una serie de lavados e incubaciones de células (Figura 1). Protocolos de la acumulación de AMPc específica de CA-isoforma fueron entonces emplea seguido de la medición de la acumulación de AMPc utilizando un laborioso y consume mucho tiempo [3 H] AMPc metodología 15,24 unión. La duración de principio a fin para cada ensayo general, se requiere un total de cuatro a cinco días a partir de planchas de células para el análisis de datos (Figura 1). La aplicación de nuevas tecnologías y la automatización ha llevado a mejoras notables para los estudios de sensibilización en el entorno industrial y el centro de HTS. Por ejemplo, un grupo de trabajo con el Centro Nacional de ChemiCal Genómica informó de un dos días HTS procedimiento de ensayo para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de receptor opioide μ sensibilización inducida en formato de 1.536 pocillos 25. El presente artículo describe nuestros esfuerzos para desarrollar un ensayo HTS para los estudios de sensibilización heteróloga utilizando tecnologías que están disponibles en la mayoría de las instituciones de investigación académica. Esta estrategia se llevó a cabo mediante la incorporación de la utilización de células criopreservadas de modelos celulares heteróloga que expresa el receptor de dopamina D 2 en combinación con isoformas de adenilato ciclasa recombinantes endógenos o individuales (CHO-D 2L o HEK-CA6 / D 2 L). Para mejorar nuestro rendimiento, hemos rediseñado nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (ca.&gt; 20 pasos más de 4-5 días) a una de cinco pasos, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos que era esencialmente &quot;mezclar y leer&quot;. El nuevo formato utiliza un disponible en el mercado el tiempo homogéneo de fluorescencia resuelta (HTRF) de ensayo para medir cAMP accumulation en células intactas con un lector de placa de modo multi. El ensayo es robusto y pueden someterse a cribado molécula pequeña, y se puede aplicar de manera efectiva para la detección de inhibidores de la sensibilización heteróloga. Además, se ofrecen datos que permiten la utilización de este ensayo con invertir transfección de siRNA para la selección de la biblioteca siRNA amplia dirigida o genomas con sólo una pequeña modificación del planteamiento general.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L celdas</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Jamón' s F12 medios</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies 15070063</td><td></td><td></td></tr><tr><td>platos de 15 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Crioviales</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>placas de 384 pocillos tratadas con TC</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>Kit HTRF cAMP Dynamic 2</td><td>Cisbio Bioensayos</td><td>62AM4PEB</td><td></td></tr><tr><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prisma 6</td><td>Software GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirol</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpirida</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Tecnologías</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Libre de agua, DNasa y RNasa</td><td>MP Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>siRNA personalizado Control</td><td></td></tr><tr>de<td>siRNA no focalizado</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

inducido por fármacos sensibilización de adenilciclasa: racionalización ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y sirna aplicaciones de cribado

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilización de la adenilato ciclasa de señalización (CA) ha sido implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, por ejemplo el abuso de sustancias y la enfermedad de Parkinson. La activación aguda de / receptores unidos a O Gai inhibe la actividad de CA, mientras que la activación persistente de estos receptores da como resultado la sensibilización heteróloga de CA y aumento de los niveles de AMPc intracelular. Estudios anteriores han demostrado que esta mejora de la capacidad de respuesta de CA se observa tanto in vitro como in vivo después de la activación crónica de varios tipos de receptores / O-ligados Gai incluyendo D 2 de la dopamina y los receptores opioides μ. Aunque la sensibilización heteróloga de AC se informó por primera vez hace cuatro décadas, el mecanismo (s) que subyacen a este fenómeno siguen siendo ampliamente desconocidas. La falta de datos mecanicistas presumiblemente refleja la complejidad implicada con esta respuesta adaptativa, lo que sugiere que los enfoques no sesgada podrían ayudar a identificarción de las vías moleculares implicadas en la sensibilización heteróloga de CA. Estudios previos han implicado a la quinasa y la señalización Gbγ como componentes que regulan la sensibilización heteróloga de AC superpuestos. Identificar objetivos superpuestos únicos y adicionales asociados con la sensibilización de la CA, se requiere el desarrollo y validación de un ensayo de sensibilización cAMP escalable para un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores para estudiar la sensibilización son generalmente engorroso que implica el mantenimiento continuo de cultivo de células, así como una metodología compleja para la medición de la acumulación de AMPc que implica múltiples pasos de lavado. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo basado en células robusta que se puede utilizar para la selección de alto rendimiento (HTS) en un formato de 384 pocillos facilitaría los estudios futuros. El uso de dos modelos celulares receptor D2 de la dopamina (por ejemplo. CHO-D 2L y HEK-AC6 / D 2L), hemos convertido nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (&gt; 20 pasos 4-5 días) para un período de cinco step, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos. Este nuevo formato es susceptible de cribado molécula pequeña, y demostramos que este diseño de ensayo también se puede utilizar fácilmente para la transfección inversa de ARNip en previsión de selección de la biblioteca siRNA dirigidos.

Parte I. Desarrollo de un ensayo de sensibilización bien heterólogo 384 para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas usando un modelo de células disponibles comercialmente. Para el estudio de la sensibilización heteróloga en un modelo celular, hicimos una serie de mejoras que nos permitieron agilizar el ensayo en un formato &quot;mezclar y leer&quot;. Varias de las modificaciones principales se destacan a continuación y se describen con más detalle en la discu...

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un ensayo de sensibilización basado en células y cíclico AMP en un solo día, para aplicaciones de cribado de alto rendimiento, incluido el cribado de bibliotecas químicas. Esto se logra primero descongelando y sembrando células criopreservadas previamente preparadas y listas para el ensayo. El segundo paso consiste en añadir compuestos de prueba o antagonistas a las células, seguido por la adición del fármaco sensibilizante de la adenilato ciclasa.A continuación, se añade un activador de la adenylyl ciclasa en presencia de un inhibidor de la fosfodiesterasa para estimular la acumulación de AMP cíclico. El paso final consiste en detener la reacción mediante fluorescencia homogénea de resolución temporal o detección de AMP cíclico por HTRF, reactivos en tampón de lisis, y luego medir la fluorescencia. En definitiva, el uso de células criopreservadas y la tecnología HTRF de AMP cíclico permite realizar un ensayo de sensibilización en un solo día para el cribado de moléculas pequeñas.Tuvimos por primera vez la idea de este enfoque cuando nos interesó utilizar la cribado de alto rendimiento para estudiar la sensibilización heteróloga mediada por receptores de una adenilato ciclasa. Dos técnicas clave utilizadas aquí incluyen el uso de células criopreservadas como reactivos listos para usar y el ensayo homogéneo de tiempo resuelto. Para kits de ensayo esenciales para medir el AMP cíclico, las metodologías básicas utilizadas aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en la señalización celular y el descubrimiento de fármacos mediante ensayos celulares. Para comenzar, cultive las células CHO-D2L en una placa de cultivo celular de 15 centímetros como se describe en el protocolo del texto, incube las células a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 90 al 95%, luego lave las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS, y recoga las células con tres mililitros de tampón de disociación celular tras una incubación de cinco minutos a 37 grados Celsius.Después de resuspender las células usando 12 mililitros del medio de cultivo, cuente las células mediante exclusión con azul de tripano. Centrifugue la suspensión celular a 500 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio de congelación. Después de diluir la suspensión celular para alcanzar la concentración celular deseada, alícuota un mililitro de la solución celular en cada vial criogénico. Incube los viales criogénicos en un recipiente para congelación celular a -80 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, transfiera los viales criogénicos a un tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Para sembrar células listas para ensayo, primero descongele rápidamente un vial criogénico de células en un baño de agua a 37 grados Celsius. Una vez descongeladas las células, transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de OptiMEM y mezcle invirtiendo el tubo de tres a cinco veces. Tras la centrifugación de las células a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de OptiMEM.Cuente las células utilizando la exclusión con azul de tripano para determinar la viabilidad celular antes de diluir las células viables según sea necesario. Y plaque óptimamente 10 microlitros de células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos tratada de 384 pocillos. Utilizando una pipeta multicanal.Realice diluciones seriadas de AMP cíclico y óptimo para generar una curva estándar para estimar la producción de AMP cíclico por las células. Añada 10 microlitros por pocillo de los patrones de AMP cíclico a la placa. Centrifugue la placa a 100 ×g durante 15 segundos a temperatura ambiente e incube a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5 %CO2 durante una hora.Para una prueba de cribado de moléculas pequeñas, primero diluya el fármaco de interés en el medio hasta seis veces la concentración final deseada. La dilución seriada puede realizarse utilizando pipetas manuales o una estación de manipulación de líquidos. Añada 2,5 microlitros por pocillo del compuesto de prueba o del vehículo que contiene tampón.Aplique la solución al lateral de los pocillos utilizando una pipeta multicanal y centrifugue la placa a 100 ×g durante 15 segundos. A temperatura ambiente para el tratamiento agonista prolongado, prepare una solución de 600 nanomolares de Quin parol y óptimo, luego añada 2,5 microlitros por pocillo de la solución de Quin parol 600 nanomolares al lateral de los pocillos. Utilizando una pipeta multicanal, centrifugue nuevamente la placa antes de incubarla a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5 %CO₂ durante dos horas.Durante la incubación de dos horas, prepare la solución de estimulación en óptimo según se describe en el protocolo del texto. Añada cinco microlitros por pocillo de la solución de estimulación al costado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal después de centrifugar la placa como antes, e incubar a temperatura ambiente durante una hora. La producción de AMP cíclico por las células se mide utilizando el kit dinámico de AMP cíclico dos según las instrucciones del fabricante: brevemente, reconstituya el anticuerpo contra AMP cíclico y el AMPD cíclico dos en agua destilada; diluya un alícuota del anticuerpo contra AMP cíclico y un alícuota de AMPD cíclico dos por separado en tampón de lisis, según las instrucciones del fabricante, para obtener soluciones de trabajo. Para detener la acumulación de AMP cíclico en la placa de 384 pocillos, añada 10 microlitros por pocillo de la solución de trabajo de anticuerpo contra AMP cíclico y 10 microlitros por pocillo de la solución de trabajo de AMPD cíclico dos.Utilizando una pipeta multicanal, centrifugar nuevamente la placa a 100 GS durante 15 segundos a temperatura ambiente antes de incubarla durante una hora a temperatura ambiente. Leer las placas en un lector de placas de fluorescencia utilizando una excitación de 337 nanómetros y medir las emisiones a 620 nanómetros y 665 nanómetros según las instrucciones del fabricante. Aplicar análisis ratiométrico para evaluar la curva patrón de AMP cíclico según las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores obtenidos, extrapolar la acumulación estimada de AMP cíclico en los pocillos de prueba mediante software de análisis de datos.Las células CHO D dos L criopreservadas se sembraron directamente en placas de ensayo de 384 pozos para demostrar que los ensayos de sensibilización pueden realizarse en formato de 384 pozos, reduciendo el número de pasos de más de 20 a cinco. Los estudios revelaron que un pretratamiento de dos horas con Quin Perol potenció de manera dependiente de la dosis la acumulación posterior de AMP cíclico estimulado por cuatro, lo cual es consistente con la sensibilización heteróloga. La segunda serie de experimentos exploró si este nuevo ensayo optimizado podía utilizarse para evaluar inhibidores de la sensibilización.Los resultados iniciales revelaron que el pretratamiento con haloperidol o Perone, antagonistas prototípicos del receptor D₂, previno completamente la sensibilización inducida por Quin parol en la acumulación cíclica de AMP estimulada por cuatro factores. A continuación, este método se utilizó para evaluar la potencia de una serie de antagonistas del receptor D₂, a fin de comprobar si estos compuestos inhibían la sensibilización de manera similar a los resultados previos. Estos estudios demostraron que los antagonistas del receptor D₂ inhibieron la sensibilización inducida por agonistas de forma dependiente de la dosis.El siguiente objetivo fue desarrollar un ensayo de sensibilización en placas de 384 pocillos que pueda utilizarse para realizar cribados escalables de bibliotecas de ARN de interferencia mediante transfección inversa, como se describe en el protocolo del texto. Los resultados revelaron que la exposición de las células al agonista Quin parole durante dos horas provocó un marcado aumento en la acumulación de AMP cíclico estimulado por cuatro skull. La acumulación incrementada de AMP cíclico tanto con 100 nanomolares como con 300 nanomolares de cuatro scullin fue superior a 15 veces en comparación con las células tratadas con el vehículo. La transfección inversa de GSS irna en células que expresan el receptor D dos bloquea la sensibilización inducida por el agonista en la adenilato ciclasa.Cuando se agregó el agonista del receptor D2, quinpirol, de forma cíclica, se estimuló y midió la acumulación de AMP cíclico mediante HTRF; la respuesta de sensibilización 15 veces mayor se redujo en un 94 %. Una vez dominado, todo este ensayo puede realizarse en menos de ocho horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento. También se pueden medir otras moléculas de señalización, como IP1 y pERK, con el fin de examinar vías adicionales de señalización del receptor.

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Bioingeniería

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El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

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Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

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Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

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Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado (Video) | JoVE Journal

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

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