Pruebas

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un ensayo sencillo de laberinto en Y para evaluar el olfato en Drosophila melon Gaster. Esto se logra primero mediante el ayuno de las moscas durante 16 a 18 horas, para que estén motivadas a explorar nuevos entornos con estímulos volátiles. El segundo paso del procedimiento consiste en armar el dispositivo del laberinto en Y que contiene las fuentes de olor sobre papel de filtro, como ácido acético en disolvente frente a disolvente solo.

El tercer paso consiste en introducir rápidamente y con suavidad las moscas en el vial de carga. Después de varias horas, el paso final es puntuar la ubicación de las moscas en el laberinto. En última instancia, los resultados pueden mostrar una respuesta hacia el odorante a partir de los datos obtenidos con el laberinto en Y.

Primero tuvimos la idea de este método cuando decidimos desarrollar una técnica sencilla y económica para evaluar la respuesta olfativa de los filos. Una ventaja de esta técnica frente a otras opciones es que permite a las moscas tomar una decisión sin someterlas a un estrés excesivo. Quien demostrará el procedimiento será Megan Simon, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para este protocolo, tenga lista una línea de moscas ISOinizada con fenotipos conductuales estables y robustos. Cualquier stock de este tipo puede servir como control de referencia para la prueba olfativa; para cada cepa genética que se utilice en el experimento, cruce la cepa con la cepa de referencia durante cinco generaciones.

Aparee hembras de la cepa experimental única con varios machos isogénicos para cada retrocruzamiento. Para experimentos olfativos, mantenga la Drosophila en un medio estándar de harina de maíz con un antibiótico, bajo un ciclo de luz de 12:12 y a 25 grados Celsius.

Los experimentos siempre deben realizarse a 25 grados Celsius y bajo luz en el espectro rojo lejano, no visible para Drosophila. También debe ser posible ventilar completamente la habitación entre experimentos antes de realizar el ensayo a la mañana siguiente. Al final del día, transfiera cohortes de 10 a 20 líneas experimentales a viales de vidrio con humedad proporcionada por una toalla húmeda.

Las moscas deben probarse en un período de 16 a 18 horas, o podrían morir debido a la deshidratación o al hambre al día siguiente. Arme el laberinto en forma de Y. Comience uniendo el conector en forma de Y a dos viales de vidrio mediante conectores de espuma con puntas de pipeta recortadas, que forman conductos cuya forma cónica hace que estos sean pasajes unidireccionales.

La tercera rama de la Y está unida a un tubo de carga elaborado a partir de la porción grande de una punta de pipeta y permite el paso desde el vial de carga hasta el punto de elección del laberinto. Más allá de cada túnel cónico hay un vial de vidrio, uno de los cuales debe cargarse con una sustancia odorífera. Estas cargas consisten en bolos de 40 microlitros absorbidos en cuadrados de papel de tissue de 28 milímetros.

La ubicación del odorante debe alternarse aleatoriamente para realizar primero la prueba. Enfríe. Coloque brevemente a las moscas sobre hielo, de modo que su movimiento se ralentice. Esto debe hacerse bajo luz infrarroja proveniente de bombillas LED y a 25 grados Celsius; suelte suavemente el grupo de moscas dentro del vial de carga y cargue el laberinto en Y con las moscas de prueba.

No utilice anestesia gaseosa. Es realmente fundamental transferir las moscas al vial de carga rápida y suavemente. De hecho, es la parte más difícil de este experimento porque las moscas deben despertar rápidamente antes de la difusión de las demás en la masa Y.

Debe permitirse que las moscas exploren el laberinto durante 24 horas, de modo que un número máximo de moscas se desplace a uno u otro frasco de vidrio. El número de moscas presentes en los diferentes tubos sirve para calcular el índice olfativo. Deben aplicarse métodos estadísticos estándar a este valor obtenido a partir del comportamiento de hasta 10 moscas.

Si 10 cohortes de moscas no proporcionan resultados consistentes, los ensayos pueden realizarse con 20 cohortes de moscas. Para limpiar los componentes del laberinto, sumérjalos desarmados en RBS 35 MD durante la noche. A continuación, enjuáguelos con agua del grifo y realice un enjuague final con agua DI antes de dejarlos secar al aire.

Respuestas estándar a un odorante. Mediante el uso del laberinto en Y se incluyen atracción, indiferencia o evitación. Por ejemplo, las moscas de los cantones evitan fuertemente el ácido acético al 10%, mientras que no evitan el ácido fenilacético al 10%.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este ensayo de onda representa un entorno artificial para las moscas. Siguiendo este procedimiento como método, se pueden realizar ensayos como la arena de compañeros de equipo o ensayos internos para confirmar las respuestas olfativas de las moscas y las diferentes condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar simplemente las respuestas olfativas de *Drosophila* utilizando el ensayo SW.