Name: Pruebas Drosophila El olfato con un ensayo del laberinto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de laberinto en Y para evaluar respuestas olfatorias en Drosophila melanogaster. Este método permite estudiar preferencias y aversiones a estímulos volátiles de forma reproducible.

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Agradecemos 4 evaluadores anónimos por su trabajo para mejorar el manuscrito. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Científica por su apoyo financiero a MBG y YG, y la Université de Bourgogne y el Ministerio francés de Investigación para MMS. La investigación en laboratorio YG es financiado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), la Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), el Conseil Régional de Bourgogne (Faber) y el CNRS.

1. Antes de empezar <ol><li> Utilizar una referencia de valores isogenized teniendo fenotipos conductuales estables y robustas. No existe una regla general para la elección de esta población, ya que todos los controles posibles pueden llevar heterogéneos alelos de fondo. </li><li> Utilice esta cepa de control para retrocruzar cada dos valores necesarios para los pasos posteriores. Este paso retrocruzamiento se representa típicamente por lo menos 5 cruces sucesivos de una sola hembra virgen (para permitir que sea posible entrecruzamiento entre cromosomas homólogos) a 2-3 machos de referencia isogénicas 5. Este paso es importante para homogeneizar el fondo genético entre las diferentes poblaciones de la mosca. </li><li> Mantener las poblaciones de Drosophila en una harina de maíz estándar (9%), levadura (10%), y el medio de agar (1,5%) complementado con antibióticos (0,4% de metil para-hidroxi-benzoato) en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas a 25 ° C. </li><li> Lograr experimentos quimiosensoriales en una habitación con temperatura controlada (25 º C) con luz roja lejana(Para eliminar la contribución de las señales visuales, y centrarse en las señales quimiosensoriales). Regularmente renovar el aire de la habitación a ventilar el área entre cada experimento. </li></ol> 2. Respuesta olfativa mediante un ensayo del laberinto <ol><li> Morir de hambre a las moscas de 16-18 horas a 25 ° C en tubos de vidrio que contienen una toalla de papel húmeda antes de la prueba. </li><li> Únase a un conector en forma de Y a dos viales de vidrio y un vial de plástico pequeña (carga vial). Utilice 1 ml puntas de pipeta que pasan a través de los tapones de espuma para unir el conector a los tres viales, y para obtener un laberinto Y cerrado herméticamente. Cortar los extremos estrechos de dos puntas de pipeta (~ 2 mm de diámetro, para evitar cualquier retorno de la marcha una vez que ha tomado su decisión) para formar dos viales &quot;atrapar&quot;, y un gran final de una punta de la pipeta para formar la &quot;carga&quot; tubo (Figura 1A). </li><li> Justo antes de la conexión de los viales &quot;atrapar&quot; (fig. 1B), coloque una ~ 6 mm de diámetro en el papel de filtrocada vial. Añadir 40 l de solución de odorante en una de papel de filtro, y 40 l de la correspondiente disolvente en el segundo papel de filtro. </li><li> Introducir diez 4-9 moscas de un día en el vial de &quot;carga&quot;. No utilice CO 2 anestesia durante esta transferencia, ya que tiene un fuerte efecto sobre el comportamiento 10. Más bien utilizar breve enfriamiento en hielo. La manipulación adecuada de las moscas anestesiadas es importante limitar el estrés en los temas tanto como sea posible. <ol><li> Lleve a cabo una serie de pruebas del laberinto a 25 ° C bajo luz roja lejana (el uso de bombillas LED para limitar la posible fuente de calor) para evitar los estímulos visuales tanto como sea posible. Tenga cuidado de alternar las orientaciones de los Y-laberintos (tubo odorante que contiene a la izquierda, oa la derecha, y el tubo de carga en el frente o en la espalda; Figura 1C). </li><li> Permita que transcurran varias horas para que las moscas entren en el vial que contiene la trampa odorizante o el disolvente. Cuente moscas después de 24 horas para aumentar la participatien un máximo de más de 80% y proporcionar el valor de índice olfativa máxima (Simonnet, comunicación personal). </li><li> Calcular el índice olfativa resultante usando la siguiente fórmula: (número en el tubo de olor - número en el tubo de disolvente) / número total de moscas cargados. </li></ol></li><li> Lave laberinto Y puesta a punto de la siguiente manera: remoje la desmantelado configuración en RBS 35 MD durante la noche. Enjuagar bien con agua del grifo. Por último, enjuagar con agua desionizada y dejar que se seque. </li></ol> 3. Análisis Estadístico de los Datos <ol><li> Lleve a cabo una prueba t, un ANOVA de una vía o un ANOVA de dos vías en función de los datos y variables. </li></ol>

<ol><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li>
<li>Silbering, A. F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionotropic+and+metabotropic+mechanisms+in+chemoreception%3A+%27chance+or+design%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design.</a> EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).</li>
<li>Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smell+of+love+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The smell of love in Drosophila.</a> Front. Physiol. 4, (2013).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478, 236-240 (2011).</li>
<li>Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+olfactory+behavior+in+Drosophila%3A+a+new+screen+yields+the+ota+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants.</a> Genetics. 123, 315-326 (1989).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459, 218-223 (2009).</li>
<li>Budick, S. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-flight+responses+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).</li>
<li>Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cAMP+transduction+pathway+modify+olfaction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).</li>
<li>Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetising+Drosophila+for+behavioural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anaesthetising Drosophila for behavioural studies.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).</li>
<li>Ai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flying+the+fly%3A+long-range+flight+behavior+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo laberinto Y se basa en un protocolo previamente descrito 9. Sin embargo, se introducen dos grandes diferencias. En primer lugar, utilizamos puntas de pipeta estrechos para evitar que las moscas de regresar una vez que deciden entrar en el vial que contiene el disolvente o el disolvente más el odorante. Estos consejos estrechos también son útiles para limitar la difusión de aroma en el laberinto. En segundo lugar, se utiliza un vial de carga menor a la fuerza a las moscas para entrar en el la...

Quimiorrecepción a través del gusto o el olfato es una modalidad sensorial clave para la supervivencia de los animales. Se da señales vitales necesarias para la detección de un peligro o de las fuentes de alimentos, así como para las interacciones sociales. También ayuda a los animales a encontrar un socio necesario el sexo para su reproducción. Durante más de 20 años, la investigación intensiva, incluyendo el premio Nobel de obra de Richard Axel y Linda Buck en 2004 &quot;por sus descubrimientos de los receptores odorantes y la organización del sistema olfativo&quot;, se ha llevado a cabo para revelar las bases moleculares y celulares de la olfacción 1,2. Uno de los modelos animales preferidos por los científicos para diseccionar la percepción olfativa es D. melanogaster. Este insecto comparte una estrategia de codificación de olor celular y molecular similar con mamíferos. La comunidad científica utiliza diversos paradigmas de comportamiento para estudiar el papel de los odorantes en esta mosca de la fruta. Estas pruebas incluyen ensayos multimodales como courtshipruebas p donde diversas modalidades sensoriales, incluyendo el olfato, son importantes para obtener el cortejo masculino 3. Otros ensayos también se han desarrollado para abordar el papel de los odorantes más específicamente; estos incluyen T-laberintos, Y-laberintos, ensayos de trampa, arenas de cuatro de campo y 4.5.6.7.8 viento túneles. En este artículo se presenta un ensayo del laberinto sencillo modificado, que proporciona respuestas olfativas robustas usando D. melanogaster. Nuestra puesta a punto utiliza-tips finales en contra de un método descrito anteriormente 9. Por lo tanto, nuestra laberinto Y tiene dos ventajas. En primer lugar, evita las subidas en el sistema una vez que la marcha ha hecho su elección. En segundo lugar, limita el intercambio de olores en todas las áreas de el laberinto. Esta última ventaja es importante, ya que de Drosophila son muy sensibles al flujo de aire que se utiliza a menudo para evitar la saturación odorante. Para ajustar el montaje experimental con un flujo de aire sería consume tiempo y costo. Por lo tanto, nuestro ensayo del laberinto representa un efciente y rápida para poner a prueba el rendimiento olfativo de Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Tubo de poliestireno</td><td>VWR europe</td><td>734-2255</td><td>30 x 25 mm&nbsp; Y-maze</td></tr><tr><td>Drosophila Tubo de borosilicato</td><td>Dijon verre</td><td></td><td>95 X 25 mm Y-maze Tapón</td></tr> de <tr><td>espuma</td><td>Dutscher</td><td>999038</td><td> Y-maze Conector</td></tr> en <tr><td>forma de Y</td><td>Europrix</td><td>11020605</td><td> Y-maze</td></tr><tr><td>100-1.000 &micro; l puntas</td><td>de pipeta Corning</td><td>4868</td><td>Conecte las siguientes puntas de pipeta al conector en forma de Y. Corte 2 puntas de pipeta a 65 mm del extremo ancho y conecte el extremo estrecho (con un &sim; Apertura de 2 mm) a 2 viales de prueba. Estas aberturas limitarán los cambios de sentido una vez que las moscas ingresen a los tubos que contienen los olores. Corte 1 punta de pipeta a 35 mm del extremo ancho y conéctela al vial de carga. Y-maze</td></tr><tr><td>Bombilla LED Rojo Lejano</td><td>Rubin-Lacaque</td><td>0RB180238</td><td>625-630 nm</td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45725</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fenilacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P16621</td><td></td></tr><tr><td>Sabores</td><td>sensibles a la levadura Harina de</td><td></td> maíz de Estrasburgo 1018880464 <td></td></tr><tr><td></td><td>eurogerm</td><td>Farine de ma&iuml; s</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Kalys</td><td>HP-697-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxi metil 4 benzoato</td><td>VWR International 25605293</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pruebas<em&gt; drosophila</em&gt; el olfato con un ensayo del laberinto

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

La detección de las señales del medio ambiente es esencial para los animales para asegurar su supervivencia. Para ello, utilizan señales ambientales tales como la visión, mecanorrecepción, el oído y chemoperception a través del gusto, por contacto directo oa través del olfato, el cual representa la respuesta a una molécula volátil que actúa en un mayor alcance. Moléculas químicas volátiles son señales muy importantes para la mayoría de los animales en la detección de peligro, una fuente de alimento, o para la comunicación entre individuos. Drosophila melanogaster es uno de los modelos biológicos más comunes para los científicos a explorar la base celular y molecular del olfato. Con el fin de resaltar las habilidades olfativas de este pequeño insecto, se describe un protocolo elección modificado basada en la prueba del laberinto en clásicamente utilizado con ratones. Los datos obtenidos con Y-laberintos dan información valiosa para comprender mejor cómo tratan los animales con su entorno permanentemente cambiante. Introducimos un protocolo paso a paso para estudiar laimpacto de los olores en mosca respuesta exploratorio utilizando este ensayo del laberinto.

Figura 1D muestra dos respuestas representativas utilizando este ensayo del laberinto. Cantón-S machos evitan fuertemente 10% de ácido acético diluido en agua destilada, mientras que no evitan significativamente ácido fenilacético 10%. Estos ensayos se basan en 10 varones por réplica colocados juntos en los viales de carga. Este protocolo a veces puede conducir a grandes errores estándar de la media. Si es necesario, es posible reducir este inconveniente mediante el uso de 20 hombres por repeticiones en...

Se presenta una prueba de elección para revelar la influencia de sustancias odoríferas en el comportamiento de Drosophila utilizando un ensayo del laberinto.

Pruebas<em&gt; Drosophila</em&gt; El olfato con un ensayo del laberinto

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un ensayo sencillo de laberinto en Y para evaluar el olfato en Drosophila melon Gaster. Esto se logra primero mediante el ayuno de las moscas durante 16 a 18 horas, para que estén motivadas a explorar nuevos entornos con estímulos volátiles. El segundo paso del procedimiento consiste en armar el dispositivo del laberinto en Y que contiene las fuentes de olor sobre papel de filtro, como ácido acético en disolvente frente a disolvente solo.El tercer paso consiste en introducir rápidamente y con suavidad las moscas en el vial de carga. Después de varias horas, el paso final es puntuar la ubicación de las moscas en el laberinto. En última instancia, los resultados pueden mostrar una respuesta hacia el odorante a partir de los datos obtenidos con el laberinto en Y.Primero tuvimos la idea de este método cuando decidimos desarrollar una técnica sencilla y económica para evaluar la respuesta olfativa de los filos. Una ventaja de esta técnica frente a otras opciones es que permite a las moscas tomar una decisión sin someterlas a un estrés excesivo. Quien demostrará el procedimiento será Megan Simon, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para este protocolo, tenga lista una línea de moscas ISOinizada con fenotipos conductuales estables y robustos. Cualquier stock de este tipo puede servir como control de referencia para la prueba olfativa; para cada cepa genética que se utilice en el experimento, cruce la cepa con la cepa de referencia durante cinco generaciones.Aparee hembras de la cepa experimental única con varios machos isogénicos para cada retrocruzamiento. Para experimentos olfativos, mantenga la Drosophila en un medio estándar de harina de maíz con un antibiótico, bajo un ciclo de luz de 12:12 y a 25 grados Celsius.Los experimentos siempre deben realizarse a 25 grados Celsius y bajo luz en el espectro rojo lejano, no visible para Drosophila. También debe ser posible ventilar completamente la habitación entre experimentos antes de realizar el ensayo a la mañana siguiente. Al final del día, transfiera cohortes de 10 a 20 líneas experimentales a viales de vidrio con humedad proporcionada por una toalla húmeda.Las moscas deben probarse en un período de 16 a 18 horas, o podrían morir debido a la deshidratación o al hambre al día siguiente. Arme el laberinto en forma de Y. Comience uniendo el conector en forma de Y a dos viales de vidrio mediante conectores de espuma con puntas de pipeta recortadas, que forman conductos cuya forma cónica hace que estos sean pasajes unidireccionales.La tercera rama de la Y está unida a un tubo de carga elaborado a partir de la porción grande de una punta de pipeta y permite el paso desde el vial de carga hasta el punto de elección del laberinto. Más allá de cada túnel cónico hay un vial de vidrio, uno de los cuales debe cargarse con una sustancia odorífera. Estas cargas consisten en bolos de 40 microlitros absorbidos en cuadrados de papel de tissue de 28 milímetros.La ubicación del odorante debe alternarse aleatoriamente para realizar primero la prueba. Enfríe. Coloque brevemente a las moscas sobre hielo, de modo que su movimiento se ralentice. Esto debe hacerse bajo luz infrarroja proveniente de bombillas LED y a 25 grados Celsius; suelte suavemente el grupo de moscas dentro del vial de carga y cargue el laberinto en Y con las moscas de prueba.No utilice anestesia gaseosa. Es realmente fundamental transferir las moscas al vial de carga rápida y suavemente. De hecho, es la parte más difícil de este experimento porque las moscas deben despertar rápidamente antes de la difusión de las demás en la masa Y.Debe permitirse que las moscas exploren el laberinto durante 24 horas, de modo que un número máximo de moscas se desplace a uno u otro frasco de vidrio. El número de moscas presentes en los diferentes tubos sirve para calcular el índice olfativo. Deben aplicarse métodos estadísticos estándar a este valor obtenido a partir del comportamiento de hasta 10 moscas.Si 10 cohortes de moscas no proporcionan resultados consistentes, los ensayos pueden realizarse con 20 cohortes de moscas. Para limpiar los componentes del laberinto, sumérjalos desarmados en RBS 35 MD durante la noche. A continuación, enjuáguelos con agua del grifo y realice un enjuague final con agua DI antes de dejarlos secar al aire.Respuestas estándar a un odorante. Mediante el uso del laberinto en Y se incluyen atracción, indiferencia o evitación. Por ejemplo, las moscas de los cantones evitan fuertemente el ácido acético al 10%, mientras que no evitan el ácido fenilacético al 10%.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este ensayo de onda representa un entorno artificial para las moscas. Siguiendo este procedimiento como método, se pueden realizar ensayos como la arena de compañeros de equipo o ensayos internos para confirmar las respuestas olfativas de las moscas y las diferentes condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar simplemente las respuestas olfativas de *Drosophila* utilizando el ensayo SW.

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