Name: Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el Drosophila Antena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprende la técnica de inmunotinción de montaje completo para visualizar neuronas receptoras olfativas en antenas de Drosophila. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de diversificación neuronal mediante microscopía confocal.

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Este estudio fue apoyado por el programa apoyado por el MEXT para la Fundación para la Investigación Estratégica en las Universidades Privadas y JSP Young Scientist B subvención para HT Nos gustaría dar las gracias a Ohtake Norihito para editar los clips de vídeo.

1. Preparar plato Manzana <ol><li> Mezclar 12,5 g de agar, 125 ml de jugo 100% disponible en el mercado de la manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Microondas la mezcla durante 1 a 2 minutos y se vierte a la placa de cultivo de 3 cm de células. Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cruzamiento genético <ol><li> Utiliza el siguiente cruce genético representativo: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / CyO x w 1118 3. Protocolo de disección y la tinción <ol><li> Se anestesia la marcha y luego se corta la cabeza mosca vertical sujetándolo mediante un fórceps. </li><li> Coloque con cuidado la parte que contiene las antenas en una placa de manzana. </li><li> Cortar el tercer segmento de la antena con tijeras de disección finas. </li><li> Coloque 90 l de la solución de fijación (4% de paraformaldehído en 0,1% de PBST (PBS con 0,1% de Triton X-100)) a la mitad de una placa de cultivo con fondo de vidrio. </li><li> Transferir suavemente la antenn diseccionadoae con una aguja directamente a la solución de fijación. Si es necesario, sumergir físicamente las antenas en la solución usando la aguja. </li><li> Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Lavar las antenas en 0,4% de PBST (PBS con 0,4% de Triton X-100), 3x 10 minutos en cada uno, mantenerlos en el mismo plato. Utilice puntas amarillas de quitar y añadir solución PBST. Utilice 90 l de la solución de lavado en cada ocasión. NOTA: No coloque el plato en una coctelera durante inmunohistoquímica. Antes de la eliminación o la adición de la solución en el plato, llevar a todos las antenas en el centro de la cápsula, utilizando la aguja y agregar o quitar cuidadosamente la solución desde el borde del plato. </li><li> Bloquear las antenas con 90 l de 5% de suero de caballo normal en 0,1% de PBST durante 20 minutos a TA. </li><li> Después de retirar la solución de bloqueo, incubar las antenas con 90μl de anticuerpos primarios en 0,1% PBST que contenía 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C en un recipiente húmedo como se describe anteriormente <sarriba&gt; 8. </li><li> Lávese las antenas 6x 10 minutos en el 0,4% PBST. </li><li> Incubar las antenas con 90 l de anticuerpos secundarios en 0,1% PBST que contiene 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C. Lave 6x 10 minutos usando 0,4% PBST. </li><li> Para montar la antena, eliminar PBST de la placa de cultivo tanto como sea posible e introducir gradualmente dos concentraciones diferentes de glicerol a las antenas. En primer lugar añadir 40% de glicerol a la placa durante 1 a 2 minutos; luego quite esto y agregar 80% de glicerol. </li><li> Extraer con cuidado la antena (incluyendo el 80% de glicerol) de la placa de cultivo utilizando la punta amarilla y colocarlos en un portaobjetos. Con suavidad, coloque un cubreobjetos encima y sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas. Las antenas están ahora listos para ser fotografiado por microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La disección de la antena de Drosophila se describe es simple y fácil de realizar en un entorno de laboratorio. Para garantizar una disección éxito, es esencial utilizar las tijeras bien afiladas. Mientras que la inmunotinción la antena diseccionado, es importante incubar en un recipiente lleno de humedad para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo. La antena diseccionado tiene una tendencia a flotar en la solución. Uso de 0,1% de Triton en PBS durante la fijación y el bloqueo de pasos facilitará la...

El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de moléculas de olor y posteriormente enviar la información resultante a los centros superiores del cerebro. Esta entrada se utiliza para controlar con precisión los comportamientos animales fundamentales, como la alimentación y el apareamiento 1-6. Como cada tipo de neurona olfativa está asociado a un conjunto específico de los olores, la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN) s es esencial para la función del sistema olfativo adecuada 7. Genética de Drosophila, nos permite llevar a cabo la investigación solo nivel celular que implica mecanismos moleculares asociados al desarrollo de ORN y la función fisiológica 8-16. Whole inmunotinción monte de Drosophila antenas nos ha permitido comprender con mayor detalle los mecanismos moleculares implicados en la diversificación de las neuronas olfativas del receptor (ORN) s 7. Aquí le ofrecemos una amplia descripción de un método sencillo para achieve esto.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de disección Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio&nbsp;</td><td>Corporación MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ELAV</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridoma</td><td>7E8A10</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Ratón anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Dilución 1:400</td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Burro Anti-Rata IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Dilución 1:200</td></tr></tbody></table>

todo el montaje de immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; drosophila</em&gt; antena

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Las moléculas odoríferas se unen a sus receptores diana de una manera precisa y coordinada. Cada receptor reconoce una señal específica y transmite esta información al cerebro. Como tal, la determinación de cómo se transfiere la información olfativa en el cerebro, tanto la modificación de la percepción y comportamiento, investigación méritos. Curiosamente, hay más pruebas de que los factores de transducción celular y la transcripción están implicados en la diversificación de la neurona olfativa del receptor. Aquí les ofrecemos un conjunto robusto de montaje método de marcaje inmunológico para ensayar in vivo organización neurona olfativa del receptor. Usando este método, se identificaron todas las neuronas olfativas del receptor con el anticuerpo anti-ELAV, un marcador pan-neuronal conocido y Or49a-mCD8 :: GFP, una neurona olfativa del receptor expresa específicamente en Nba neurona utilizando anticuerpo anti-GFP.

Garantizar que tanto la disección y fijación se realizan con rapidez es un factor clave para lograr el éxito con este protocolo. El uso de finas tijeras y pinzas también es crucial. Después de la inmunotinción, las antenas fluorescentes marcadas se examinaron bajo un microscopio confocal. Normalmente nos tomamos secciones 1μm usando una lente de 20x. Hemos marcado Nba 7 ORNs utilizando Or49a-mCD8 :: GFP y contamos el número de Nba ORNs de tipo salvaje antena. El reportero mCD8-GFP se localiza membrana celular...

Aquí describimos el proceso de inmunotinción de montaje completo de antenas de Drosophila, lo que nos permite comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN).

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar las neuronas receptoras olfativas mediante la tinción de antenas enteras. Primero, anestesie la mosca para cortarle la cabeza verticalmente. A continuación, coloque la cabeza de la mosca diseccionada sobre una placa con manzana.Luego, corte el tercer segmento de la antena y colóquelo en un platillo de cultivo con fondo de vidrio para realizar inmunohistoquímica. Después de montar las antenas en un portaobjetos, podemos visualizar los diversos tipos de neuronas olfativas receptoras mediante microscopía confocal. Estamos trabajando en el sistema olfativo.El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de otras moléculas. La amplia gama de neuronas olfativas distintas que existen dentro de este sistema permite la transmisión precisa y coordinada de información desde los receptores diana hasta las neuronas dentro del cerebro. Hoy describiremos la tinción de preparaciones completas de antenas para detectar la diversificación de estas neuronas receptoras olfativas.Para garantizar una tinción exitosa de la antena en montaje completo, es fundamental preparar un lote fresco de fijador inmediatamente antes de comenzar el protocolo. Anestesiar la mosca y luego cortar verticalmente la cabeza de la mosca sujetando su cuerpo con pinzas. Ahora, colocar cuidadosamente la antena diseccionada sobre una placa de manzana.Corte el tercer segmento de la antena utilizando tijeras de disección finas. Coloque 90 µL de solución fijadora en el centro del recipiente. Con una aguja afilada, transfiera suavemente la antena diseccionada directamente a la solución fijadora.Ahora permita que la fijación transcurra sin interrupciones durante 40 minutos a temperatura ambiente para finalizar el proceso de fijación. Lave las antenas tres veces con PBST durante 10 minutos por lavado durante la eliminación de la solución de lavado. Primero, reúna todas las antenas en el centro del recipiente utilizando una aguja.Luego, retire la solución del lateral del plato. La agitación durante la incubación no es necesaria. Para preparar la tinción, retire el último lavado de PBST y bloquee las antenas fijadas llenando la cámara con 90 microlitros de suero de caballo al 5% en PBST al 0,1%. Reemplace la solución de bloqueo con los anticuerpos primarios diluidos en una mezcla de suero de caballo al 5%.En PBST, los anticuerpos primarios utilizados son ratón anti GFP uno en 400 y rata anti eof, diluidos a una concentración de uno en 200 para evitar que las muestras de antenas se sequen. Coloque un papel absorbente humedecido en la tapa de la placa de cultivo y envuélvala con parafina. Luego, coloque la placa de cultivo en un recipiente de plástico que contenga papeles absorbentes húmedos.Incubar las antenas en los anticuerpos primarios durante 48 horas a cuatro grados Celsius tras 48 horas. Eliminar los anticuerpos primarios no unidos mediante seis lavados en PBST durante 10 minutos por lavado. Similar al procedimiento previamente descrito para la eliminación del fijador.Después de una hora de lavados con PBST, añada la solución de anticuerpo secundario diluida en una mezcla de 5 % de suero de caballo en PBST; en este ejemplo, los anticuerpos son SI dos anti-IgG de conejo y SI tres anti-IgG de rata. A partir de este momento, cubra el recipiente con papel de aluminio para evitar la fotodegradación de los fluoróforos. A continuación, incube la antena en el anticuerpo secundario durante 48 horas a cuatro grados Celsius.En este momento, la antena ya está lista para su montaje. Retire la mayor cantidad posible de PBST de la placa de cultivo e introduzca gradualmente glicerol en las antenas. Posteriormente, agregue glicerol al 40 % en la placa durante uno o dos minutos, luego elimínelo y añada glicerol al 80 % y déjelo durante cinco minutos.La tinción fluorescente reveló neuronas positivas para Elof y las neuronas olfativas dirigidas. Al combinar este procedimiento con otros métodos similares, incluida la generación de mosáicos genéticos en neuronas olfativas, esperamos iniciar el estudio del control mecánico de la desdiversificación de las neuronas olfativas y responder otras preguntas científicas importantes.

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Investigación

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Neurociencia

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