Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el Drosophila Antena

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar las neuronas receptoras olfativas utilizando la tinción de antenas de montaje completo. Primero anestesia a la mosca para cortarle la cabeza verticalmente. A continuación, coloque la cabeza de mosca disecada en un plato de manzana.

A continuación, corte el tercer segmento de la antena y colóquelo en la placa de cultivo con fondo de vidrio para realizar la inmunohistoquímica. Después de montar las antenas en un vaso deslizante, podemos visualizar los diversos tipos de neuronas receptoras olfativas a través de la microscópica confocal hi. Estamos trabajando en el sistema olfativo.

El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una gran variedad de otras moléculas. La amplia gama de neuronas olfativas distintas que existen dentro de este sistema permite la transmisión precisa y coordinada de información desde los receptores objetivo a las neuronas dentro del cerebro. Hoy vamos a describir la tinción de antenas de montaje completo para detectar la diversificación de estas neuronas receptoras olfativas.

Con el fin de garantizar un teñido exitoso de todo el montaje y la antena, es fundamental preparar un nuevo lote de fijador inmediatamente antes de comenzar el protocolo. Anestesiar la mosca y luego cortar la cabeza de la mosca verticalmente sujetando su cuerpo con pinzas. Ahora, coloque con cuidado la antena diseccionada en un plato de manzana.

Corta el tercer segmento de la antena con unas tijeras de disección fina. Coloque 90 microlitros de solución fijadora en el centro del plato. Con una aguja afilada, transfiera suavemente la antena diseccionada directamente a la solución fijadora.

Ahora deje que la fijación proceda sin interrupciones durante 40 minutos a temperatura ambiente para finalizar la fijación. Lave las antenas tres veces con PBST durante 10 minutos por lavado durante la extracción de la solución de lavado. Primero, lleva todas las antenas al centro del plato con una aguja.

A continuación, retira la solución del lateral del plato. La agitación durante la incubación es innecesaria. Para prepararse para la tinción, retire el último lavado de PBST y bloquee las antenas fijas llenando la cámara con 90 microlitros de suero de caballo al 5% en PBST al 0,1%, reemplace la solución de bloqueo con anticuerpos primarios diluidos en una mezcla de suero de caballo al 5%.

En el PBST, los anticuerpos primarios utilizados son el anti GFP de ratón, uno en 400, y el anti EOF de rata, diluidos a una concentración de uno en 200 para evitar que las muestras de antenas se sequen. Coloque un pañuelo húmedo en la tapa de la placa de cultivo y envuélvalo con la paraforma. A continuación, coloque la placa de cultivo en un recipiente de plástico que contenga pañuelos húmedos.

Incubar las antenas en los anticuerpos primarios durante 48 horas a cuatro grados centígrados después de 48 horas. Elimine los anticuerpos primarios no unidos con seis lavados en PBST durante 10 minutos por lavado. Similar al procedimiento de extracción del fijador descrito anteriormente.

Después de una hora de lavados con PBST, agregue una solución de anticuerpos secundaria diluida en una mezcla de suero de caballo al 5% En PBST en este ejemplo, los anticuerpos son SI dos IgG anti conejo y SI tres IgG anti rata. Cubra el recipiente con papel de aluminio a partir de este punto para evitar el fluoro. A continuación, el fotoblanqueo incuba la antena en el anticuerpo secundario durante 48 horas a cuatro grados centígrados.

En este punto, la antena ya está lista para el montaje para montar la antena. Retire la mayor cantidad posible de PBST de la placa de cultivo y comience a introducir gradualmente glicerol en las antenas. Posteriormente, agregue 40% de glicerol al plato durante uno o dos minutos, luego retírelo y agregue 80% de glicerol y déjelo durante cinco minutos.

La tinción fluorescente reveló las neuronas Elof positivas y las neuronas olfativas objetivo. Al combinar este procedimiento con otros métodos similares, incluida la generación de mosaicos genéticos de neuronas olfativas, esperamos iniciar la desdiversificación de las neuronas olfativas controladoras mecánicas y responder a otras preguntas científicas importantes.