Name: Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el Drosophila Antena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprende la técnica de inmunotinción de montaje completo para visualizar neuronas receptoras olfativas en antenas de Drosophila. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de diversificación neuronal mediante microscopía confocal.

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Este estudio fue apoyado por el programa apoyado por el MEXT para la Fundación para la Investigación Estratégica en las Universidades Privadas y JSP Young Scientist B subvención para HT Nos gustaría dar las gracias a Ohtake Norihito para editar los clips de vídeo.

1. Preparar plato Manzana <ol><li> Mezclar 12,5 g de agar, 125 ml de jugo 100% disponible en el mercado de la manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Microondas la mezcla durante 1 a 2 minutos y se vierte a la placa de cultivo de 3 cm de células. Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cruzamiento genético <ol><li> Utiliza el siguiente cruce genético representativo: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / CyO x w 1118 3. Protocolo de disección y la tinción <ol><li> Se anestesia la marcha y luego se corta la cabeza mosca vertical sujetándolo mediante un fórceps. </li><li> Coloque con cuidado la parte que contiene las antenas en una placa de manzana. </li><li> Cortar el tercer segmento de la antena con tijeras de disección finas. </li><li> Coloque 90 l de la solución de fijación (4% de paraformaldehído en 0,1% de PBST (PBS con 0,1% de Triton X-100)) a la mitad de una placa de cultivo con fondo de vidrio. </li><li> Transferir suavemente la antenn diseccionadoae con una aguja directamente a la solución de fijación. Si es necesario, sumergir físicamente las antenas en la solución usando la aguja. </li><li> Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Lavar las antenas en 0,4% de PBST (PBS con 0,4% de Triton X-100), 3x 10 minutos en cada uno, mantenerlos en el mismo plato. Utilice puntas amarillas de quitar y añadir solución PBST. Utilice 90 l de la solución de lavado en cada ocasión. NOTA: No coloque el plato en una coctelera durante inmunohistoquímica. Antes de la eliminación o la adición de la solución en el plato, llevar a todos las antenas en el centro de la cápsula, utilizando la aguja y agregar o quitar cuidadosamente la solución desde el borde del plato. </li><li> Bloquear las antenas con 90 l de 5% de suero de caballo normal en 0,1% de PBST durante 20 minutos a TA. </li><li> Después de retirar la solución de bloqueo, incubar las antenas con 90μl de anticuerpos primarios en 0,1% PBST que contenía 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C en un recipiente húmedo como se describe anteriormente <sarriba&gt; 8. </li><li> Lávese las antenas 6x 10 minutos en el 0,4% PBST. </li><li> Incubar las antenas con 90 l de anticuerpos secundarios en 0,1% PBST que contiene 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C. Lave 6x 10 minutos usando 0,4% PBST. </li><li> Para montar la antena, eliminar PBST de la placa de cultivo tanto como sea posible e introducir gradualmente dos concentraciones diferentes de glicerol a las antenas. En primer lugar añadir 40% de glicerol a la placa durante 1 a 2 minutos; luego quite esto y agregar 80% de glicerol. </li><li> Extraer con cuidado la antena (incluyendo el 80% de glicerol) de la placa de cultivo utilizando la punta amarilla y colocarlos en un portaobjetos. Con suavidad, coloque un cubreobjetos encima y sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas. Las antenas están ahora listos para ser fotografiado por microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
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<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La disección de la antena de Drosophila se describe es simple y fácil de realizar en un entorno de laboratorio. Para garantizar una disección éxito, es esencial utilizar las tijeras bien afiladas. Mientras que la inmunotinción la antena diseccionado, es importante incubar en un recipiente lleno de humedad para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo. La antena diseccionado tiene una tendencia a flotar en la solución. Uso de 0,1% de Triton en PBS durante la fijación y el bloqueo de pasos facilitará la...

El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de moléculas de olor y posteriormente enviar la información resultante a los centros superiores del cerebro. Esta entrada se utiliza para controlar con precisión los comportamientos animales fundamentales, como la alimentación y el apareamiento 1-6. Como cada tipo de neurona olfativa está asociado a un conjunto específico de los olores, la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN) s es esencial para la función del sistema olfativo adecuada 7. Genética de Drosophila, nos permite llevar a cabo la investigación solo nivel celular que implica mecanismos moleculares asociados al desarrollo de ORN y la función fisiológica 8-16. Whole inmunotinción monte de Drosophila antenas nos ha permitido comprender con mayor detalle los mecanismos moleculares implicados en la diversificación de las neuronas olfativas del receptor (ORN) s 7. Aquí le ofrecemos una amplia descripción de un método sencillo para achieve esto.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de disección Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio&nbsp;</td><td>Corporación MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ELAV</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridoma</td><td>7E8A10</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Ratón anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Dilución 1:400</td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Burro Anti-Rata IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Dilución 1:200</td></tr></tbody></table>

todo el montaje de immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; drosophila</em&gt; antena

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Las moléculas odoríferas se unen a sus receptores diana de una manera precisa y coordinada. Cada receptor reconoce una señal específica y transmite esta información al cerebro. Como tal, la determinación de cómo se transfiere la información olfativa en el cerebro, tanto la modificación de la percepción y comportamiento, investigación méritos. Curiosamente, hay más pruebas de que los factores de transducción celular y la transcripción están implicados en la diversificación de la neurona olfativa del receptor. Aquí les ofrecemos un conjunto robusto de montaje método de marcaje inmunológico para ensayar in vivo organización neurona olfativa del receptor. Usando este método, se identificaron todas las neuronas olfativas del receptor con el anticuerpo anti-ELAV, un marcador pan-neuronal conocido y Or49a-mCD8 :: GFP, una neurona olfativa del receptor expresa específicamente en Nba neurona utilizando anticuerpo anti-GFP.

Garantizar que tanto la disección y fijación se realizan con rapidez es un factor clave para lograr el éxito con este protocolo. El uso de finas tijeras y pinzas también es crucial. Después de la inmunotinción, las antenas fluorescentes marcadas se examinaron bajo un microscopio confocal. Normalmente nos tomamos secciones 1μm usando una lente de 20x. Hemos marcado Nba 7 ORNs utilizando Or49a-mCD8 :: GFP y contamos el número de Nba ORNs de tipo salvaje antena. El reportero mCD8-GFP se localiza membrana celular...

Aquí describimos el proceso de inmunotinción de montaje completo de antenas de Drosophila, lo que nos permite comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN).

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar las neuronas receptoras olfativas mediante la tinción de antenas enteras. Primero, anestesie la mosca para cortarle la cabeza verticalmente. A continuación, coloque la cabeza de la mosca diseccionada sobre una placa con manzana.Luego, corte el tercer segmento de la antena y colóquelo en un platillo de cultivo con fondo de vidrio para realizar inmunohistoquímica. Después de montar las antenas en un portaobjetos, podemos visualizar los diversos tipos de neuronas olfativas receptoras mediante microscopía confocal. Estamos trabajando en el sistema olfativo.El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de otras moléculas. La amplia gama de neuronas olfativas distintas que existen dentro de este sistema permite la transmisión precisa y coordinada de información desde los receptores diana hasta las neuronas dentro del cerebro. Hoy describiremos la tinción de preparaciones completas de antenas para detectar la diversificación de estas neuronas receptoras olfativas.Para garantizar una tinción exitosa de la antena en montaje completo, es fundamental preparar un lote fresco de fijador inmediatamente antes

whole-mount-immunolabeling-olfactory-receptor-neurons-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

Para entender cómo las formas complejas de células, como las dendritas neuronales, se obtienen durante el desarrollo, es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para examinar la organización de microtúbulos de las dendritas arborización dendrítica neurona sensorial, la tráquea, músculos y...

Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo

Este video muestra un protocolo detallado de inmunotinción para visualizar defectos fenotípicos en los cuerpos de hongos de cerebros de Drosophila mutantes. El protocolo consiste en el uso de anticuerpos contra Fas2, una proteína implicada en la guía axonal que facilita el correcto desarrollo morfológico y funcional del cuerpo del hongo.

Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC)...

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Los cilios de las neuronas sensoriales olfativas contienen proteínas de la cascada de transducción de señales, pero un análisis espacial detallado de su distribución es difícil en las criosecciones. Describimos aquí un enfoque optimizado para el marcaje de montaje completo y la visualización en la cara de las proteínas ciliares.

Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.

Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

Aprende la técnica de inmunotinción de montaje completo para visualizar neuronas receptoras olfativas en antenas de Drosophila. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de diversificación neuronal mediante microscopía confocal.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el

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