Name: Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprende a detectar y caracterizar células tumorales circulantes (CTC) en muestras de sangre humana y de xenoinjertos murinos usando el sistema CellSearch. Este protocolo mejora la selección de terapias dirigidas en oncología.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Ontario de Investigación del Cáncer (# 08NOV230), la Fundación Canadiense para la Innovación (# 13199), el cáncer de próstata Canadá, Janssen Oncología, el Programa Regional del Cáncer de Londres, y el apoyo de los donantes de John y Donna Bristol a través el London Health Sciences Foundation (ALA). LEL es apoyado por un Banting y Charles Best Frederick Canada Graduate Beca Premio de Doctorado. ALA es apoyado por un Premio al Investigador Nueva CIHR y un Premio Investigador Temprana del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.

Todos los estudios humanos descritas en este manuscrito se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Junta de Ética de Investigación Humana de la Universidad de Western. Se realizaron todos los estudios en animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por el Uso de Animales Subcomité Universidad Occidental. 1. Estándar CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando los CSS 1. Sangre humana Recolección y Preparación para el procesamiento en el Instrumento de preparación <ol><li> Utilizando técnicas estándar de flebotomía asépticas, dibujar un mínimo de 8,0 ml de sangre humana en un tubo CellSave 10 ml (en lo sucesivo referido como el tubo conservante CTC), que contiene ácido etileno diaminotetraacético (EDTA) y un conservante celular patentada. Invierta las 5x tubo para evitar que la sangre se coagule. Las muestras pueden ser procesadas inmediatamente o almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 96 horas. </li><li> DESMONTAJEreactivos e CSS de la nevera y permita que alcancen la temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Usando una pipeta desechable 10 ml y pipeta automatizada, recolectar 7,5 ml de sangre del tubo conservante CTC y dispensar lentamente la sangre en un tubo de procesamiento instrumento de preparación marcada de manera apropiada. </li><li> Añadir 6,5 ml de tampón de dilución a cada muestra. Mezclar por inversión de muestra 5x. Centrifugar la muestra a 800 xg durante 10 minutos con el freno en la posición &quot;off&quot;. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar todas las muestras de los pacientes en el sistema para su procesamiento. Las muestras deben ser procesadas dentro de 1 hora de preparación. </li></ol> 2. Preparación de control para el procesamiento en el Instrumento de Preparación <ol><li> Agite suavemente el frasco de control e invertir 5x para mezclar. </li><li> Retire con cuidado la tapa del frasco de control y colocar un tubo de procesamiento de instrumentos de preparación invertida en la parte superior del vial destapado. En un movimiento rápido, invierta lacontrolar vial, y verter el contenido en el tubo de procesamiento. Si bien invertida, chasquear suavemente los lados del vial de control para liberar el contenido restante. </li><li> Retire con cuidado el vial de control invertidos desde el tubo de procesamiento, garantizando que ningún líquido se pierde y coloque a un lado. Usando una pipeta de 1000 l, recoger el contenido restante del vial y de la tapa y la pipeta suavemente en el tubo de procesamiento. </li><li> Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar el control en el sistema para su procesamiento. </li></ol> 3. Escaneo de muestra en el instrumento de análisis <ol><li> Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para descargar todas las muestras del sistema. Sin apretar coronar cada cartucho dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, cierre bien el cartucho, coloque el dispositivo magnético plano, y incubate en la oscuridad durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación. </li><li> Encienda el instrumento de análisis e inicializar la lámpara. Una vez calentado (~ 15 min), cargue el cartucho de verificación del sistema en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de prueba del control de calidad. Siga las instrucciones en pantalla para llevar a cabo las medidas de control de calidad necesarios. </li><li> Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Prueba de paciente. Se mostrará toda la información guardada en el instrumento de preparación. Haga clic en Inicio para iniciar la exploración de la muestra. El sistema lleva a cabo un enfoque grueso y detección de bordes en el cartucho de dispositivo magnético. </li><li> Ajuste todos los bordes como sea necesario utilizando las teclas de dirección. Seleccione Aceptar. El sistema realizará una multa enfoque y empezar a escanear muestra. </li><li> Tras el control de la exploración de los resultados debe ser validado utilizando los criterios definidos para las células enriquecidas en alto (CK + DAPI + CD45 - APC +) y baja (CK + DAPI + CD45 - FITC +) las concentraciones. A raíz de la muestra del paciente la exploración de los resultados debe ser revisado para CTCs capturadas utilizando los criterios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS 1. Preparación de marcadores definidos por el usuario y de instrumentos de inicialización <ol><li> Diluir el anticuerpo de interés utilizando primarios de bonos diluyente de anticuerpos a la concentración deseada en una taza de reactivo marcador usando la siguiente fórmula, en donde la concentración de trabajo es la concentración del anticuerpo después de la adición a la muestra y la concentración de valores es la concentración de anticuerpo en el taza de reactivo. Para múltiples muestras, ajustar los volúmenes de anticuerpos como se describe en la Tabla 1. Coloque la taza de reactivo marcador en la posición 1 en el cartucho de reactivo y LOAD cartucho sobre CSS. Stock Concentración = (concentración de trabajo x 850 mu l) / 150 l </li><li> Recoger la sangre, preparar muestras, y cargar el instrumento de preparación como se describe en el estándar por encima de CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando el protocolo de CSS. Para activar Además marcador personalizado, seleccione Definido por el usuario ensayo cuando se le solicite por el instrumento de preparación. Introduzca el nombre del marcador y seleccione Guardar. Como muestras se cargan en el instrumento, el operador se le solicitará que indique que debe recibir marcador personalizado seleccionando Sí o No, según sea necesario. </li></ol> 2. Escaneo Muestra de marcadores definidos por el usuario en el instrumento de análisis <ol><li> Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes con el CSS </strong&gt; protocolo. </li><li> Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Para inicializar el canal FITC, seleccione CellSearch CTC como ID Kit en la sección Protocolos de pruebas. Desde este menú, seleccione CTC Investigación, haga clic en el botón Editar y establezca el tiempo de exposición si lo deseas. Se recomienda que un tiempo de exposición de 1,0 segundos no ser excedido cuando utilizando el kit de CSS CTC como esto puede aumentar sangrado a través en otros canales fluorescentes utilizados para la identificación de CTC. </li></ol> 3. Adaptación del CSSProtocol estándar para su uso en modelos preclínicos del ratón ** Adaptado de Veridex ratón / rata CellCapture Kit (ya no está disponible en el comercio) 1. Ratón extracción de sangre y almacenamiento <ol><li> Antes de la recogida de sangre, se ejecutan ~ 30 l de EDTA 0,5 M de ida y vuelta a través de una aguja de 22 G, dejando una pequeña cantidad de EDTA en el cubo. </li><li>Reunir un mínimo de 50 l de la sangre del ratón de los ratones previamente inyectados con células tumorales humanas a través de rutas ortotópico, vena de la cola, o intracardiaca. Recoger sangre de la vena safena (para el análisis de CTC en serie) o por punción cardiaca (para el análisis de terminal de CTC). Retire la aguja y dispensar la sangre en un Microtainer con EDTA tubo de recogida de sangre de 1 ml. Mezclar por inversión o tubo suavemente flick evitar que la sangre se coagule. La sangre puede ser procesada inmediatamente o se almacenó a temperatura ambiente durante hasta 48 horas después de la adición de un volumen igual de CytoChex conservante celular. </li></ol> 2. CTC Enriquecimiento <ol><li> Retire reactivos CSS de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Transferir el equivalente de 50 l de sangre completa a un 12 mm x 75 mm flujo citometría de tubo. Añadir 500 l de tampón de dilución a cada muestra, lavando cualquier sangre que queda en los lados del tubo. Si es necesario, un breve centrifugado centrífugase puede utilizar para recoger cualquier sangre restante. </li><li> Vórtice suavemente el ferrofluido anti-EpCAM y añadir 25 l de cada muestra mediante la colocación de la punta de la pipeta directamente en la muestra. Añadir 25 l de reactivo Mejora captura y agitar suavemente para mezclar. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Coloque los tubos de muestra en el imán y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar. </li></ol> 3. CTC tinción <ol><li> Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 50 l de ácido nucleico Dye, 50 l de reactivo de tinción, 1,5 l de anti-ratón CD45-APC, 5,0 l de anti-humano HLA-Alexa Fluor 488, y 100 l de permeabilización Reactivo. Para múltiples muestras, estos reactivos se pueden mezclar previamente y 206,5 l de mezcla se pueden añadir a cada tubo. Vortex suavemente para mezclare incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Añadir 500 l de tampón de dilución, vórtice suavemente, tubos de muestra en lugar del imán, y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar. Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 350 l de tampón de dilución. Vortex suavemente para mezclar. </li></ol> 4. Magnética dispositivo de carga <ol><li> Con una punta de carga de gel, transferir cuidadosamente la totalidad del volumen del tubo de muestra en un cartucho en el dispositivo magnético. Comience en la parte inferior del cartucho y retirar lentamente la punta como se dispensa la muestra. </li><li> Una vez que la muestra ha sido transferida, sin apretar tapar el cartucho de dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho como se describe en la Sección 3.1 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes utilizando el CSS. </li><li> Pop las burbujas utilizando una aguja estéril 22 G atrapándolos entre el bisel y el borde del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, la tapa con firmeza el cartucho, coloque el dispositivo magnético plana, y se incuban en la oscuridad durante al menos 10 min. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación. </li></ol> 5. Escaneo de muestras separadas de forma manual en el instrumento de análisis <ol><li> Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes que utilizan el protocolo CSS. </li><li> Cargue la muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Borre los datos existentes en el botón datos dispositivo magnético haciendo clic en el botón de formato de muestra. Habilitar el canal FITC unnd establecer el tiempo de exposición a 1,0 seg como se describe en la sección 2.2 de la CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS. </li><li> Haga clic en la ficha Prueba de paciente y seleccione Editar para introducir la información de la muestra. Seleccione CellSearch CTC como ID Kit y CTC de Investigación como el Protocolo de prueba. Introduzca el resto de la información necesaria, como se indica como el asterisco. Guardar la información de la muestra y haga clic en Iniciar. </li></ol>

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<li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li>
<li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer%3A+The+effect+of+neoadjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li>
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<li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li>
</ol>

El autor (ALA) recibió fondos que fue proporcionado por Janssen Oncología, cuya compañía matriz Johnson &amp; Johnson también es propietaria de Janssen Diagnósticos LLC, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

A pesar del desarrollo de muchas nuevas tecnologías de CTC desde la introducción de la CSS en el año 2004, esta técnica sigue siendo la única tecnología clínicamente aprobada hoy en el mercado, por lo que se considera el estándar de oro actual para la detección y enumeración CTC. Este manuscrito ha demostrado que a pesar de la CSS tiene rigurosos estándares de control de calidad que puede estar sujeto a sesgos de interpretación y que la identificación de CTC en muestras de pacientes es muy diferente de la identificación...

En 2013 se estima que 580,350 personas morirán de cáncer y que los 1.660.290 nuevos casos de esta enfermedad se diagnostica sólo en 1 de los Estados Unidos. La mayoría de estas muertes se producen con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica 2. La actual falta de terapias efectivas en el tratamiento de metástasis y una comprensión limitada de la cascada metastásica hace que esta etapa de la enfermedad altamente letal. La presencia de células tumorales circulantes (CTC) en el torrente sanguíneo se ha demostrado que se correlaciona con la enfermedad metastásica 3. Estas células son muy poco frecuentes y su detección es indicativa de la supervivencia general en cáncer de mama metastásico 4, 5 de próstata y colorrectal 6 cáncer. En estos pacientes, la presencia de ≥ ≥ 3 (colorrectal) CTCs en 7,5 ml de sangre 5 (mama y próstata) o es un indicador de mal pronóstico en comparación con aquellos pacientes con menos o ningún CTCs detectables en el samvolumen e sangre. Además, el cambio en el número de CTC durante o después de la intervención terapéutica ha demostrado ser útil como un factor de predicción de la respuesta al tratamiento, a menudo antes de lo que las técnicas actualmente utilizadas 7-10. Se ha estimado que, en pacientes con cáncer metastásico, CTC se produce a una frecuencia de aproximadamente 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de la sangre y en los pacientes con enfermedad localizada, esta frecuencia puede ser aún más baja (~ 1 en 10 8). La naturaleza poco común de estas células puede hacer que sea difícil de detectar y analizar con precisión y fiabilidad CTC 11. Existen varios métodos (revisado previamente 12-14) se han utilizado para enriquecer y detectar estas células mediante la explotación de las propiedades que los diferencian de los alrededores componentes sanguíneos. En general, la enumeración CTC es un proceso de dos partes que requiere tanto una etapa de enriquecimiento y una etapa de detección. Tradicionalmente, las etapas de enriquecimiento se basan en las diferencias en educación físicapropiedades de iCal de CTC (tamaño de la celda, densidad, capacidad de deformación) o en la expresión del marcador de proteína (es decir, molécula de adhesión celular epitelial [EpCAM], citoqueratina [CK]). Después de enriquecimiento, la detección de CTC puede llevarse a cabo en un número de maneras diferentes, la más común de las cuales son ensayos basados ​​en ácidos nucleicos y / o enfoques de citometría. Cada una de estas estrategias son únicos, tienen ventajas y desventajas, sin embargo todos ellos carecen de normalización; una necesidad para entrar en el entorno clínico. Por tanto, el sistema de CellSearch (CSS) se desarrolló para brindar un método estándar para la detección y enumeración de los CTC raras en la sangre humana utilizando microscopía de fluorescencia y técnicas basadas en anticuerpos 4-6. Esta plataforma es actualmente considerado el estándar de oro en la enumeración CTC y es la única técnica aprobado por los EE.UU. Food and Drug Administration (FDA) para su uso en la clínica 15. El CSS es una consistin plataforma de dos componentesg de, (1) el sistema de CellTracks AutoPrep (de aquí en adelante referido como el instrumento de preparación), que automatiza la preparación de muestras de sangre humana, y (2) la CellTracks Analyzer II (en lo sucesivo referido como el instrumento de análisis), que analiza estos muestras siguientes preparación. Para distinguir CTC de leucocitos contaminantes del instrumento de preparación emplea un anticuerpo mediada, enfoque separación magnética a base de ferrofluido y tinción de fluorescencia diferencial. Inicialmente, el sistema de etiquetas CTC usando anticuerpos anti-EpCAM conjugados con nanopartículas de hierro. La muestra se incuba a continuación en un campo magnético, y todas las células no marcadas son aspirados. Las células tumorales seleccionadas se resuspendieron, y se incubaron en una mancha de fluorescencia diferencial, que consiste en anticuerpos marcados de forma fluorescente y un reactivo de tinción nuclear. Finalmente, la muestra se transfiere a un cartucho magnético, llamado un magnest (en lo sucesivo, el dispositivo magnético), y SCanned usando el instrumento de análisis. El instrumento de análisis se utiliza para explorar muestras preparadas usando diferentes filtros de fluorescencia, cada uno optimizado para la partícula fluorescente apropiada, usando una lente objetivo de 10X. CTC se identifican como células que están obligados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, y 19), y la mancha nuclear 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Por el contrario, los leucocitos contaminantes se identifican como células que están obligados por anti-CD45-aloficocianina (APC) y DAPI. Después de la exploración, potenciales células tumorales informáticos definidos se presentan al usuario. A partir de estas imágenes, el usuario debe emplear métodos cualitativos a través de los parámetros definidos y tinción diferencial discutidos anteriormente para determinar qué eventos son los CTC. Además de proporcionar un método estandarizado para la enumeración de CTC, el CSS permite para la caracterización molecular de CTC basado en marcadores de proteínas de interés. Este interrogatorio cun ser realizadas a nivel de una sola célula, utilizando un isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal de fluorescencia no se requiere para la identificación CTC 16. Aunque esta plataforma proporciona la capacidad para la caracterización molecular, no está bien definido el proceso detallado de elaboración de protocolos y optimización. Tres marcadores disponibles comercialmente han sido desarrollados por el fabricante para su uso con el CSS, incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), y factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF-1R). Análisis de HER2, en combinación con el CSS, ha sido utilizado por varios grupos para ilustrar el potencial para la caracterización de CTC para informar la toma de decisiones clínicas y de cambiar las pautas de tratamiento potencialmente existentes. Por ejemplo, Fehm et al. 17 demostraron que aproximadamente un tercio de los pacientes con cáncer de mama con tumores HER2-primaria tenía HER2 + CTC. Además, Liu et al.18 informó recientemente que hasta el 50% de los pacientes con cáncer de mama HER + metastásico no tenía HER2 + CTC. Herceptin, un receptor HER2 interferir anticuerpo monoclonal demostrado beneficiarse en gran medida los pacientes cuyos tumores expresan suficientes niveles de HER2, es un tratamiento comúnmente utilizado para los pacientes con tumores HER2 + primarias 19-21. Sin embargo, estos estudios sugieren que Herceptin puede estar siendo sub-óptima utilizada y que la caracterización de CTC puede ayudar en la predicción de la respuesta al tratamiento. En última instancia, la caracterización CTC puede tener el potencial de mejorar la atención personalizada. Investigación CTC es único en que ha utilizado en gran medida un enfoque de la cabecera-a de sobremesa. Este método, a diferencia de-sobremesa-al lado de la cama de investigación, que a menudo puede tomar años para impactar el cuidado del paciente, ha permitido a CTC rápida entrada en el ámbito clínico. Sin embargo, los médicos no se atreven a utilizar los resultados de los análisis de CTC en el tratamiento del paciente la decisión de tomaing debido a una falta de entendimiento de su biología subyacente. Por lo tanto adecuados modelos preclínicos de ratón de las técnicas de metástasis y análisis complementarios CTC se deben utilizar con el fin de investigar estas cuestiones pendientes. En general, hay dos tipos de modelos preclínicos utilizados para estudiar la cascada metastásica, (1) modelos de metástasis espontánea, que permiten el estudio de todos los pasos de la cascada metastásica, y (2) modelos de metástasis experimentales, que sólo permiten el estudio de las etapas posteriores en el proceso metastásico, tales como la extravasación y la formación de tumor secundario 22. Modelos de metástasis espontáneas, implican inyecciones de células tumorales en lugares ortotópico apropiadas (por ejemplo, inyección de células de cáncer de próstata en la glándula prostática para el estudio del cáncer de próstata). Después las células se les da tiempo para formar tumores primarios y metástasis espontáneamente a los sitios secundarios, tales como el hueso, pulmón, y los ganglios linfáticos. EnPor el contrario, los modelos experimentales de metástasis implican la inyección directa de células tumorales en el torrente sanguíneo (por ejemplo a través de la vena de la cola o la inyección intracardiaca para dirigirse a las células a lugares específicos) y, por tanto, se saltan los pasos iniciales de intravasation y difusión a los órganos secundarios 22. Hasta ahora la mayoría de los análisis de CTC en vivo en sistemas modelo se ha realizado usando ya sea 23 o adaptados técnicas CTC basado en citometría de origen humano (por ejemplo AdnaTest) 24. Aunque útil, ninguna de estas técnicas refleja adecuadamente enumeración CTC usando el CSS estándar de oro. Sobre la base de la aprobación clínica, la naturaleza estandarizada, y el uso generalizado de la CSS, el desarrollo de una técnica de captura y detección de CTC para el modelado in vivo que utiliza preparación de la muestra equivalente, procesamiento, y los criterios de identificación sería ventajoso como resultados serían comparables a los obtenido a partir de muestras de pacientes. Sin embargo, debido a la REQ volumenuirements del instrumento de preparación no es posible procesar pequeños volúmenes de sangre utilizando esta plataforma automatizada. . Además, el trabajo previo de Eliane et al 25 han demostrado que la contaminación de las muestras con células epiteliales del ratón (que también cumplen con la definición estándar CTC [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) puede dar lugar a errores de clasificación de ratón las células epiteliales escamosas como CTC. Para abordar estas cuestiones una técnica adaptada que permite la utilización de los reactivos del kit CSS CTC combinados con un procedimiento de aislamiento manual fue desarrollado. La adición de un antígeno leucocitario humano marcado con FITC (HLA) de anticuerpos para el ensayo permite que las células tumorales humanas para distinguirse de ratón células epiteliales escamosas. Este manuscrito describe la norma, desarrollada comercialmente y protocolo CSS optimizado para el procesamiento de las muestras de pacientes de sangre y las trampas más comunes que se pueden encontrar, entre ellos discrepanciasartículos camisetas que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC. Además, la personalización del ensayo CSS para examinar las características de la proteína de CTC capturados y una técnica de CSS adaptado comparable que permite el enriquecimiento y detección de CTC de pequeños volúmenes de sangre en modelos preclínicos de ratón de metástasis definidas por el usuario se describen.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD44-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD44-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de anticuerpo primario</td><td>de enlace Leica</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave Tubos de Conservante</td><td>Veridex</td><td>952820 (paquete de 20) 79100005 (paquete de 100)</td><td></td></tr><tr><td>Kit de control CellSearch CTC</td><td>Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>Kit CTC</td><td>CellSearch Veridex</td><td>7900001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de control CellSearch CXC</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>Kit CellSearch CXC</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de instrumentos</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck Cell Pconservtive (aka CytoChex)</td><td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>serológica</tr><tr><td>1.000 &micro; l Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 y micro; l Puntas</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta</tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>flujo</tr><tr><td>200 y micro; l Puntas</td><td></td><td></td><td></td>de carga de gel</tr><tr><td>200 y micro; l Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Aguja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 en Pipeta Pasteur Desechable</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>serológica automatizada</td></tr><tr><td>Tubo de extracción de sangre capilar (EDTA)</td><td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Analyzer II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>Incluye magnests y cartirdges</td></tr><tr><td>de verificación CellSearch AutoPrep System</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect Magnet&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla pequeña de látex</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (ctc) ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

La mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se produce con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica. Este estadio de la enfermedad altamente letal se asocia con la presencia de células tumorales circulantes (CTC). Estas células raras se han demostrado para ser de importancia clínica en cáncer de mama metastásico, de próstata, y cánceres colorrectales. El actual estándar de oro en la detección clínica CTC y enumeración es el sistema CellSearch aprobado por la FDA (CSS). Este manuscrito describe el protocolo estándar utilizado por esta plataforma, así como dos protocolos adaptados adicionales que describen el proceso detallado de la optimización de marcador definido por el usuario para la caracterización de proteínas de CTC paciente y un protocolo comparable para la captura de CTC en muy bajos volúmenes de sangre, utilizando el estándar reactivos CSS, para estudiar in vivo los modelos preclínicos de ratón de la metástasis. Además, las diferencias en la calidad de CTC entre la sangre de donantes sanos se dispararon con células de cultivo de tejidos en comparación con la sangre del paciente samples se destacan. Por último, varios artículos que se discrepantes que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC se describen. Tomados en conjunto, estos protocolos proporcionarán un recurso útil para los usuarios de esta plataforma de interesados ​​en la investigación preclínica y clínica relacionada con la metástasis y la CTC.

Enumeración Ensayo CTC estándar La sensibilidad y especificidad de la CSS ha sido bien documentado en la literatura. Sin embargo, para validar la recuperación de CTC equivalente, se dispararon (1000 LNCaP células de cáncer de próstata humano) y muestras de sangre humana no enriquecidos de donantes voluntarios sanos fueron procesadas en el CSS mediante el protocolo CSSCTC estándar. Como era de esperar, las muestras no enriquecidos estaban libres de CTCs, 0,00 ± 0,00%, y la recuperación de CTC se...

Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Este experimento tiene como objetivo la detección sensible, la enumeración y la caracterización de células tumorales circulantes procedentes de muestras de sangre de xenoinjertos humanos y de ratón. Primero, recolecte las muestras de sangre de seres humanos y/o modelos de ratón con cáncer y, mediante una selección positiva de células positivas para EpCAM, enriquezca las CTC en un fondo de leucocitos contaminantes. Luego, mediante tinción diferencial de CTC y leucocitos, identifique y enumere las CTC.Realice la caracterización molecular deseada de estas raras células tumorales circulantes en el laboratorio para ayudar en la selección de terapias dirigidas para pacientes con cáncer en el entorno clínico. Los resultados obtenidos mediante el sistema Cell Search demuestran que el análisis de CTC puede realizarse eficazmente tanto en muestras de sangre de pacientes humanos como en muestras de xenoinjertos de ratón. El desarrollo de protocolos adicionales definidos por el usuario para la caracterización de CTC en el sistema Cell Search podría en última instancia contribuir a la selección de terapias dirigidas para los pacientes.Además, ensayos de CTC comparables adaptados para su utilidad en xenoinjertos de ratón mejorarán nuestra comprensión de la biología básica de estas células. Recolecte 7,5 mililitros de la muestra de sangre de un tubo conservador de CTC y dispénselos lentamente en un tubo de procesamiento. Añada 6,5 mililitros de tampón de dilución a cada muestra de sangre.Invierta cinco veces para mezclar y centrifugue a 800 veces G durante 10 minutos. Con el interruptor en la posición de apagado para la preparación del control, vortex suavemente el vial durante cinco segundos e inviértalo cinco veces para mezclar. Luego, retire la tapa superior con un tubo de procesamiento invertido y, con un movimiento rápido, transfiera la muestra.Golpee suavemente los lados del vial de control para lograr una transferencia máxima de la muestra. Retire con cuidado el vial de control invertido asegurándose de que no se pierda líquido. Recojla el contenido restante del vial y de la tapa y añádalo suavemente al tubo de procesamiento.Siga las instrucciones en pantalla del instrumento de preparación para cargar todas las muestras de control y de pacientes en el sistema para su procesamiento. Siga las instrucciones en pantalla del instrumento de preparación para descargar todas las muestras del sistema. Ahora, coloque las tapas de forma no ajustada en cada cartucho magnético y golpee suavemente para liberar las burbujas de los bordes.Luego, cierre firmemente el cartucho, coloque el dispositivo magnético en posición horizontal e incube en la oscuridad durante al menos 20 minutos. Encienda el instrumento de análisis e inicialice la lámpara. Coloque el cartucho de verificación del sistema en el instrumento de análisis.Seleccione la pestaña de prueba de control de calidad y siga las instrucciones en pantalla para realizar las medidas necesarias de control de calidad. A continuación, cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de prueba del paciente. Haga clic en iniciar para comenzar el escaneo de la muestra.Ajuste todos los bordes según sea necesario utilizando las teclas direccionales. Luego seleccione aceptar. Para preparar marcadores definidos por el usuario, diluya el anticuerpo de interés con el diluyente de anticuerpos primarios bond. Coloque el vaso del reactivo marcador en la posición uno del cartucho de reactivos y cargue el cartucho en el sistema de búsqueda celular para habilitar la adición de marcadores personalizados.Seleccione el ensayo definido por el usuario cuando lo solicite el instrumento de preparación. Ingrese el nombre del marcador y seleccione guardar. Una vez que finalice el procesamiento de la muestra, cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de configuración.Para inicializar el canal ZI, seleccione búsqueda de células CTC como el ID del kit en la sección de protocolo de prueba. En este menú, seleccione investigación CTC. Haga clic en el botón de edición y ajuste el tiempo de exposición según lo deseado.Recolecte un mínimo de 50 microlitros de sangre de ratón en un tubo microrecogedor de 1 mililitro con EDTA y mezcle mediante inversión para prevenir la coagulación. Para el enriquecimiento de CTC, transfiera el equivalente de 50 microlitros de sangre completa a un tubo para citometría de flujo. Añada 500 microlitros de tampón de dilución a cada muestra.Lave suavemente la sangre de las paredes del tubo, vortex el fluido anti chem completamente y añada 25 microlitros a cada muestra. Asimismo, añada 25 microlitros del reactivo de potenciación de captura. Vortex suavemente las muestras e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, coloque los tubos de muestra en el imán durante 10 minutos. Aspire cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo junto al imán y deseche; retire los tubos de muestra del imán y añada 50 microlitros de colorante de ácido nucleico. Añada 50 microlitros del reactivo de tinción, 1,5 microlitros de anti-US CD 45 A PC, 5,0 microlitros de anti-human HLA LOR 4 88 y 100 microlitros del reactivo permeabilizante. Vortex suavemente e incube en la oscuridad durante 20 minutos.A temperatura ambiente. Añada ahora 500 microlitros de tampón de dilución y vortex. Coloque suavemente los tubos de muestra en el imán durante 10 minutos.Aspire cuidadosamente el líquido residual y deseche. Luego, resuspenda los pellet en 350 microlitros de tampón de dilución y mezcle suavemente mediante vortex. Aspire la muestra en una punta de carga para geles y transfiérala al dispositivo magnético comenzando desde la parte inferior del cartucho y retirando lentamente la punta a medida que se dispensa la muestra.Después de eliminar las burbujas de aire, usando una aguja estéril de calibre 22, tape firmemente el cartucho, coloque el dispositivo magnético en posición horizontal e incube en la oscuridad durante al menos 10 minutos. Cargue la muestra en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de configuración. Para borrar los datos existentes, haga clic en el botón formatear muestra.Seleccione la búsqueda de células CTC como identificación del kit y CTC research como el protocolo de prueba. En este menú, asegúrese de que se haya seleccionado el tiempo de exposición adecuado. Seleccione la pestaña de prueba del paciente y luego seleccione editar.Para ingresar la información de la muestra, introduzca la información restante necesaria según se indica. Luego guarde la información de la muestra y haga clic en iniciar para validar. La recuperación de células tumorales circulantes, células de cáncer de próstata humano agregadas artificialmente y muestras de sangre humana sin agregar provenientes de donantes voluntarios sanos se procesaron en el sistema Cell Search utilizando el protocolo estándar de CTC de Cell Search.Como era de esperar, las muestras no enriquecidas estuvieron libres de células tumorales circulantes. La recuperación de CTC en las muestras enriquecidas fue del 86,9 %. Estas imágenes de la galería de búsqueda celular obtenidas de muestras enriquecidas son de calidad óptima y las CTC son fáciles de distinguir de las no CTC. La identificación de CTC resulta ligeramente más difícil en pacientes con cáncer, con muchas células que aparecen más pequeñas en tamaño y que son menos fácilmente distinguibles de las no CTC.Además, al revisar muestras de pacientes, seis categorías de eventos presentaron elementos comúnmente discordantes entre observadores. Estos son eventos pequeños, eventos positivos en ZI, tinción tenue de citokeratina o manchado difuso, imágenes pixeladas, paso de citokeratina y dpi grande o no superpuesto. Debe considerarse la selección del kit de CTC al desarrollar marcadores definidos por el usuario utilizando una línea celular conocida por demostrar una positividad del 98 ± 4 % para los marcadores de células madre cancerosas CD44.El kit CTC basado en FCI clasificó solo al 69,3 % de las CTC como positivas para CD44. Sin embargo, utilizando el kit CX C basado en PE, el 98,8 % de las CTC se clasificaron como positivas para CD44. La optimización adecuada de cualquier marcador definido por el usuario requiere validación mediante líneas celulares con alta densidad de antígeno, baja densidad de antígeno y negativas para el marcador de interés, a fin de garantizar la sensibilidad y especificidad del ensayo. Este experimento evalúa la sensibilidad y especificidad del protocolo adaptado de búsqueda de células murinas.Como era de esperar, las muestras enriquecidas con CTC no presentaron CTC utilizando ambos ensayos y la recuperación de CTC. Mediante el kit adaptado para ratón y el sistema automatizado estándar, se obtuvieron imágenes comparables; las obtenidas mediante el protocolo manual adaptado para ratón no difirieron de las observadas con la técnica automatizada estándar.La adición de HLA tipo E a este ensayo garantiza que las células tumorales humanas puedan distinguirse fácilmente de las células epiteliales escamosas de ratón, la dilución seriada de muestras de sangre de ratón enriquecidas y la correlación entre el número esperado de células frente al número de células recuperadas. Confirme que esta técnica es tan sensible como el protocolo estándar de CSS para el aislamiento de un bajo número de CTC. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el enriquecimiento automatizado y manual de CTC a partir de muestras de sangre xenógrafas tanto humanas como de ratón.Además, debería tener una comprensión más profunda de los pasos necesarios para diseñar y optimizar protocolos de caracterización de CTC para su uso en combinación con el sistema de búsqueda de células.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Este video describe el ensayo de inmunofluorescencia de células tumorales circulantes (CTC), una técnica para caracterizar los biomarcadores en células tumorales circulantes en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Este ensayo podría usarse para monitorear los cambios dinámicos del tumor y la respuesta inmunitaria, que pueden reflejar la respuesta a la quimioterapia, la radiación y los posibles tratamientos de inmunoterapia.

Ensayo de inmunofluorescencia CTC: una técnica para caracterizar las células tumorales circulantes

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para el aislamiento de células tumorales circulantes versátiles

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Aprende a detectar y caracterizar células tumorales circulantes (CTC) en muestras de sangre humana y de xenoinjertos murinos usando el sistema CellSearch. Este protocolo mejora la selección de terapias dirigidas en oncología.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica (Video) | JoVE Journal

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

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