Name: Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprende a aislar ARNm asociados a mitocondrias en levadura mediante centrifugación diferencial. Este protocolo permite estudiar mecanismos de traducción localizada y funciones celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a los Dres. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines y Doron Rapaport ayuda y comentarios durante la creación de este protocolo. Este trabajo está financiado por la ISF (número de concesión 1193-1109).

1. Las mitocondrias Purificación Pesar el pellet de células. Aproximadamente 0,6 g se obtienen a partir de células 100 ml. <ol><li> Crecer 100-150 ml de células de levadura a OD 600 = 1-1,5 a 30 ° C en un medio de crecimiento no fermentable, como medio de crecimiento a base de galactosa, con el fin de enriquecer para las mitocondrias. </li><li> Centrifugar las células a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. </li><li> Lavar el precipitado con agua destilada dos veces y centrifugar de nuevo. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón por TDT 0,5 g de células. Es importante para el tratamiento de las células con un agente reductor con el fin de romper los enlaces disulfuro dentro de la pared celular, mejorando de este modo la hidrólisis. </li><li> Se incuban las células durante 10 min a 30 ° C con agitación suave. Mientras tanto, sopesar 6 mg zimoliasa por 1 g de células y suspender en tampón de Zymolyase. </li><li> Centrifugar las células a 3000 × g durante 5 min atemperatura t habitación y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de Zymolyase tampón por 0,15 g de células. No vórtice. </li><li> Mida OD 600 de 10 l alícuota de las células en 990 l de agua. </li><li> Añadir Zymolyase (paso 1,5) a las células para hidrolizar polímeros de glucosa en las β-1 ,3-glucano vínculos y generar esferoplastos. Desde este paso, esferoplastos se deben mantener en una solución isotónica a fin de evitar la lisis. </li><li> Se incuban las células durante 15 min a 30 ° C (para la actividad óptima de zimoliasa) con agitación suave. Para verificar la hidrólisis de la pared celular y la generación de esferoplastos, mezclar 10 l de las células con 990 l de agua. Se espera Esferoplastos para lisar debido a la diferencia osmótica y el OD 600 deben ser por lo menos 10 veces menor que el valor determinado en el paso 1.9. Si no, continuar la incubación con zimoliasa durante otros 15 minutos. </li><li> Centrifugar las células a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Dis cuidadosamentetarjeta el sobrenadante, el pellet como podría ser inestable. </li><li> Lave esferoplastos con Zymolyase Buffer y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender esferoplastos con 100 ml de medio de recuperación. Transferencia de esferoplastos a un matraz Erlenmeyer y se incuba durante 1 hora a 30 ° C con agitación. Esta etapa de recuperación es necesario ya que durante la traducción en el tratamiento Zymolyase está detenido y la localización del mRNA se interrumpe (Figura 1B). </li><li> Añadir 0,1 mg / ml de CHX y esferoplastos de transferencia a un tubo cónico de 50 ml previamente enfriado. Además CHX es importante para congelar asociación &#39;con los ribosomas ARNm. Por lo tanto, se mantiene ribosomas dependientes de ARNm asociación con las mitocondrias. </li><li> Esferoplastos se centrifuga a 3000 × g durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar dos veces con frío Manitol Buffer. </li><li> Resuspender esferoplastos con 4 ml de frío Manitol Buffer y transferirlos a un homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidad equipado con cierre bienmaja. Romper suavemente esferoplastos con 15 golpes y transferir el lisado a un tubo de 13 ml. </li><li> Centrifugar el lisado a 1.500 xg durante 6 min a 4 º C para sedimentar los núcleos y las células sin romper. </li><li> Transferir con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo. Ponga a un lado 1 ml (25%) de la muestra como una muestra no fraccionada (&quot;total&quot; de la muestra). Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4X LSB para el análisis de Western blot. El precipitado de ARN del resto de la muestra &quot;Total&quot; (Ver Protocolo 3, RNA precipitación). </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las mitocondrias. </li><li> Transferir el sobrenadante (~ 3 ml) a un nuevo tubo y se mantiene en hielo. Esta es la fracción &quot;citosólica&quot;. Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4x LSB para el análisis de Western blot. El precipitado de ARN del resto de la muestra &quot;citosólica&quot; (Ver Prot.Ocol 3, ARN precipitación). </li><li> Lavar el precipitado con 3 ml de manitol tampón y se centrifuga de nuevo a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado con 3 ml Manitol Buffer. Este ejemplo contiene las mitocondrias, y se refiere como fracción &quot;mitocondrias&quot;. Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4x LSB para el análisis de Western blot. </li></ol> 2. La extracción de RNA <ol><li> Añadir a cada muestra un volumen de M guanidinio-HCl 8 y dos volúmenes de etanol 100%. Agitar e incubar durante al menos 2 horas a -20 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. Ten cuidado ya que la pastilla puede ser inestable. </li><li> Lavar el precipitado con 70% de EtOH. </li><li> Resuspender el precipitado con 400 ml de agua libre de RNasa y transferir la muestra a un nuevo tubo Eppendorf. </li><li> Precipitar el ARN de nuevo mediante la adición de 0,1 volumen de 3 M acetato de sodioe pH 5,2 y dos volúmenes de EtOH al 100%. Agitar e incubar durante al menos 2 horas a -20 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y lavar con EtOH al 70%. </li><li> Secar el pellet y resuspender con RNasa libre de agua. Las muestras de ARN Almacenar a -80 ° C. Las muestras pueden ser utilizados para el análisis de Northern 19 o el análisis de microarrays 18 (Véase el Protocolo 3). </li></ol> 3. Preparación del ARN para el análisis de microarrays <ol><li> Resuspender el ARNm de la etapa 2.2 con 650 ml de agua libre de RNasa. </li><li> Para eliminar cualquier ADN residual o proteínas, añadir el mismo volumen (650 ml) de fenol ácido: cloroformo (5:1, pH 4.7) y agitar vigorosamente. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 min. </li><li> Transferir 500 ml de la fase superior (la fase acuosa) a un nuevo tubo. Evite tomar la interfase, ya que contiene el ADN. También tenga cuidado de tomar fenol, que puede inhibir la reacción de transcripción inversa. &lt;/ Li&gt; <li> La muestra de ARN contiene una cantidad significativa de heparina, que es un potente inhibidor de la transcriptasa inversa. Por lo tanto, para la RT-PCR o microarrays de etiquetado que tiene que ser eliminado. Retire la heparina por precipitación con LiCl: añadir LiCl a una concentración final de 2 M y se incuban las muestras durante la noche a -20 ° C. </li><li> Descongele las muestras a 4 ° C y se centrifuga a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Desechar con cuidado el sobrenadante y lavar el precipitado con etanol al 80%. Centrifugar de nuevo como se describe en el paso 3.5. </li><li> Desechar el sobrenadante, secar al aire y resuspender el precipitado en 150 ml de agua libre de RNasa. </li><li> Para eliminar cualquier residuo de LiCl, precipitar de nuevo con 0,1 volumen de acetato sódico 3 M pH 5,3 y 3 volúmenes de etanol 100%. Incubar a -20 ° C durante al menos 2 h. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad durante 20 minutos a 4 ° C. Lave cuidadosamente la bolita transparente con etanol al 80% y secar al aire. </li><li> Resuspender elpellet con 25 ml de agua libre de ARNasa y mantener las muestras a -80 ° C. </li><li> Siga los pasos para el etiquetado y la hibridación de ARN descrito en 18,20. </li></ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Los avances tecnológicos en las imágenes habían dado las herramientas de alta resolución para estudiar la localización del mRNA. Hoy en día, se puede medir el movimiento de incluso una sola molécula de ARNm en la escala de tiempo mseg 23-26. Sin embargo, los enfoques bioquímicos tradicionales, como el descrito anteriormente, también son informativos y son preferibles en algunos casos. Aislamiento bioquímica permite la purificación de un gran repertorio de los ARNm y proteínas, y por tanto es preferible que lo...

Las células eucariotas están organizados en compartimentos distintos que tienen funciones específicas. Para cumplir su función, cada compartimiento contiene un conjunto único de las proteínas que son esenciales para su actividad. Un posible mecanismo a través del cual estas proteínas se acercan a su compartimento es por 1,2 localizada traducción. En este proceso, la proteína se sintetiza en su destino por los ribosomas y mRNAs que se encuentran allí. Entre las ventajas probables de traducción adaptada aumentan la eficiencia de la focalización de proteínas, disminución de la necesidad de chaperones de la proteína, y permitiendo a los mecanismos de regulación específicos del sitio. Además, los ARNm y ribosomas localizados pueden ser un depósito aislado de la maquinaria de traducción en los casos de estrés celular, cuando se inhibe la traducción general. Las mitocondrias se convirtió en los últimos años un modelo central para estudiar traducción localizada. La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo, traducido en el citosol,e importado en el orgánulo. Varias líneas de evidencia indican que muchas de estas proteínas son producidas a través de un proceso de traducción local. Inicialmente, los estudios de microscopía electrónica y de fraccionamiento bioquímico detectan los ribosomas asociados con las mitocondrias 3-5. Estos estudios en los que luego corroboraron in vivo por el trabajo en los ARNm específicos, que se encontraron se importen solamente de una manera cotraduccional 6,7. Los estudios del genoma completo de los ARNm asociación con mitocondrias revelaron que una fracción significativa de los ARNm se localiza en las proximidades mitocondrias 8-10. Algunos de estos ARNm se caracterizaron además por fluorescencia in vivo métodos, como el pescado o MTag 9,11. Una interpretación sencillo de esta asociación es que estos mRNAs sirven como moldes para la traducción localizada. Los mecanismos por los que estos ARNm se acercan a las mitocondrias son desconocidos. Dominios no codificantes (más significantly 3 &#39;UTR), se mostró a participar en el ARNm asociación a la mitocondria 12. Estos dominios son probablemente para servir como un sitio de unión a las proteínas de unión al ARN que median su transporte. Los estudios en levadura revelaron que un miembro de la familia de proteínas PUM (Puf3) apoya asociación ARNm con mitocondrias 8,13. Un papel plausible para Puf3, que se basa en las funciones de otros miembros de la familia, es para inhibir la traducción mientras que el ARNm está en ruta 14. Por lo tanto, los ARNm pueden ser transportados en un estado no traducida, por las proteínas de unión de ARN que interactúan con regiones no codificantes. Por otra parte, un gran cuerpo de trabajo sugiere que el transporte se produce mientras se sintetiza la proteína. En particular, los inhibidores de la traducción, se mostró a afectar ARNm asociación 8,13. Además, características traducidas tales como el AUG, secuencia de direccionamiento mitocondrial (MTS) o regiones ORF se muestran para ayudar en la localización 8,11,15. Proteína Hsp70 familiar chaperone y receptor de la proteína en la membrana externa de la mitocondria también se muestran para apoyar asociación ARNm, lo que implica que más características codificada en proteínas son importantes para la localización del mRNA 16. Esto es consistente con un modelo en el que la proteína ribosoma-emergente sirve como elemento de reconocimiento para la orientación complejo proteína ARNm-ribosoma a la mitocondria 17. Traducción localizada cerca de la mitocondria fue estudiada por varios métodos, incluyendo la microscopía electrónica (para visualizar los ribosomas) 3, FISH 9, ARN verde (para detectar ARNm específicos) 11, y el fraccionamiento bioquímico (para detectar tanto el ARN y ribosomas) 10,18. Mientras que los métodos antiguos detectar la localización in vivo y pueden permitir la visualización de la dinámica de transporte, este último permite la detección de muchos ARNm diferentes en un solo experimento. Además, para los dominios de codificación de fraccionamiento bioquímico o no codificantes no necesitan ser colcados, por lo tanto, sus funciones específicas se puede evaluar. Fraccionamiento bioquímico ha sido utilizado con éxito durante muchos años, para el aislamiento de muchos diferentes compartimentos celulares. Sus directores y limitaciones están bien establecidos, y uno puede fácilmente modificar los protocolos existentes para diferentes propósitos. La instrumentación necesaria es estándar en muchos laboratorios, por lo que suele ser el primer método de elección para el estudio de la localización intracelular. Se describe un protocolo que se ha optimizado para el aislamiento de ARNm, mientras que los ribosomas están asociados con las mitocondrias. Por tanto, este protocolo es óptimo para los factores implicados en la traducción localizada cerca de las mitocondrias estudiando.

<table><tbody><tr><td>Extracto</td><td></td><td></td><td></td>de levadura</tr><tr><td>BactoPeptona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td></td><td></td><td>No lo haga en autoclave Galactosa</td></tr><tr><td>Medio</td><td></td><td></td> de crecimiento <td>Para el enriquecimiento mitocondrial, debe utilizar cualquier fuente de carbono no fermentable, como Medio de crecimiento a base de galactosa esterilizado 1% Extracto de levadura, 2% Bactopeptona, 2% Galactosa</td></tr><tr><td>0,1 M Tris-HCl, pH 9,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl, pH 7,6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> TDT <td>de 10 mM 0,1 m TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Hacer fresco cada vez</td></tr><tr><td>1,2 M de sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr> 4 <tr><td>mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; m filtro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase Buffer</td><td></td><td></td><td>1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filtre este búfer (0.2 &#956; m) y mantener a temperatura ambiente para su uso futuro</td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td></td><td></td><td>20.000 U/g</td></tr><tr><td>Medio de recuperación</td><td></td><td></td> Medio <td>de crecimiento a base de galactosa suplementado con 1 M Sorbitol</td></tr><tr><td>0,1 mg/ml Cicloheximida (CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,6 M Manitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mg/ml Heparina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM Fenilmetanosulfonilo de fluoruro (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de manitol <td>0,6 M Manitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Agregar fresco: 0,5 mg/ml de heparina, 0,1 mg/ml CHX y 1 mM (PMSF). Filtre este tampón y utilícelo helado</td></tr><tr><td>8 M de guanidinio-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% y 70% de etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sodio, pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M solución</td><td></td><td></td><td></td>madre de LiCl</tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6,8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoetanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Azul <td></td><td></td><td></td>de<td>bromofenol</td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glicerol, 20% &#946;-mercaptoetanol y 0.02% azul de bromofenol</td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas de 15 ml de capacidad equipado con un mortero</td><td></td><td></td><td></td> ajustado</tr></tbody></table>

aislamiento de arnm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo y deben ser importados en el orgánulo. Import puede ocurrir mientras que la proteína se sintetiza cerca de las mitocondrias. El apoyo a esta posibilidad se deriva de estudios recientes, en los que se muestran muchos mRNAs que codifican proteínas mitocondriales estar localizado en las proximidades mitocondrias. Junto a las manifestaciones anteriores de asociación ribosomas &#39;con la membrana externa, estos resultados sugieren un proceso de traducción localizada. Dicha traducción adaptada puede mejorar la eficiencia importan, suministran sitios únicos de regulación y reducir al mínimo los casos de expresión ectópica. Diversos métodos han sido utilizados para caracterizar los factores y elementos que median la traducción localizada. Estándar entre ellos es de fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Este protocolo tiene la ventaja de aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Estos pueden ser caracterizados por diversas molecular y bimétodos ochemical. Además, transcriptómica y proteómica métodos se pueden aplicar al material resultante, por ende facilitaría ideas de todo el genoma. La utilización de la levadura como organismo modelo para tales estudios tiene las ventajas de velocidad, los costos y simplicidad. Además, las herramientas genéticas avanzadas y supresión cepas disponibles facilita la verificación de los factores de candidatos.

Este protocolo permite la separación de una fracción que contiene mitocondrias-a partir de componentes citosólicos. La mejor manera de probar su éxito es para llevar a cabo análisis de Northern y análisis de Western (Figura 1) a las muestras de las diferentes etapas de aislamiento. Tres parámetros para la calidad de aislamiento se derivan de estos análisis. En primer lugar, si el ARN o proteínas en las muestras están intactos - éstos serán detectados como bandas distintas en los análisis. Eventos de deg...

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias asociadas con ARNm en proceso de traducción. Esto se logra primero recolectando células de levadura cultivadas en condiciones que enriquecen las mitocondrias. El segundo paso consiste en lisar suavemente las células en presencia de cicloheximida.A continuación, las mitocondrias se separan de los componentes solubles mediante centrifugación diferencial. El paso final consiste en la extracción de ARN de las mitocondrias y de las muestras de control. Finalmente, se utiliza el análisis northern para demostrar la pureza y calidad del ARN asociado a las mitocondrias.La principal ventaja de esta técnica es que muchos tipos de ARN pueden aislarse en una sola preparación. Por lo tanto, se puede realizar un análisis comparativo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como el direccionamiento intracelular y la función de los orgánulos.En este procedimiento, se purificarán mitocondrias a partir de 100 a 150 mililitros de células de levadura cultivadas hasta una DO600 de 1 a 1,5 a 30 grados Celsius en un medio de crecimiento no fermentable. Centrifugar las células a 3000 × g durante cinco minutos

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Las mitocondrias han especializado los ribosomas que divergieron de sus contrapartes bacterianas y citoplasmáticas. Aquí mostramos cómo mitoribosomes puede obtenerse su compartimiento nativo en las células HEK. El método implica el aislamiento de las mitocondrias de las células de suspensión y consiguiente depuración de mitoribosomes.

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Transformación mitocondrial en Baker

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprende a aislar ARNm asociados a mitocondrias en levadura mediante centrifugación diferencial. Este protocolo permite estudiar mecanismos de traducción localizada y funciones celulares.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Explorar más videos