Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada
14 de marzo de 2014
Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.
El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias asociadas con ARNm en proceso de traducción. Esto se logra primero recolectando células de levadura cultivadas en condiciones que enriquecen las mitocondrias. El segundo paso consiste en lisar suavemente las células en presencia de cicloheximida.
A continuación, las mitocondrias se separan de los componentes solubles mediante centrifugación diferencial. El paso final consiste en la extracción de ARN de las mitocondrias y de las muestras de control. Finalmente, se utiliza el análisis northern para demostrar la pureza y calidad del ARN asociado a las mitocondrias.
La principal ventaja de esta técnica es que muchos tipos de ARN pueden aislarse en una sola preparación. Por lo tanto, se puede realizar un análisis comparativo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como el direccionamiento intracelular y la función de los orgánulos.
En este procedimiento, se purificarán mitocondrias a partir de 100 a 150 mililitros de células de levadura cultivadas hasta una DO600 de 1 a 1,5 a 30 grados Celsius en un medio de crecimiento no fermentable. Centrifugar las células a 3000 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lavar el sedimento con agua doblemente destilada; volver a centrifugar.
Después de desechar el sobrenadante, pese el botón celular. Típicamente se obtienen aproximadamente 0,6 gramos a partir de 100 mililitros de células. Resuspenda el botón en un mililitro de tampón DTT por cada 0,5 gramos de células.
Es importante tratar las células con un agente reductor para romper los enlaces disulfuro dentro de la pared celular, mejorando así la hidrólisis; incube las células durante 10 minutos a 30 grados Celsius con agitación suave. A continuación, centrifugue las células a 3000 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado.
En un mililitro de tampón xmal liasa por 0,15 gramos de células, no agitar en vórtex. Mida la DO a 600 nm de una alícuota de 10 microlitros de las células en 990 microlitros de agua y registre este valor. Añada xmal liasa recién preparada a las células para hidrolizar los polímeros de glucosa en los enlaces beta uno tres glucanos y generar esferoplastos.
A partir de este punto, los esferoplastos deben mantenerse en una solución isotónica para evitar la lisis; incubar las células durante 15 minutos a 30 grados Celsius con agitación suave. Para verificar la hidrólisis de la pared celular y la generación de esferoplastos, mezclar 10 microlitros de las células con 990 microlitros de agua y medir la DO 600. Se espera que los esferoplastos lisen debido a la diferencia osmótica, y la DO 600 debe ser al menos diez veces menor que el valor determinado antes de añadir xmaliasa. Si no es así, continuar la incubación con xmaliasa durante otros 15 minutos.
Re-suspender el PHE de Plast con 100 mililitros de medio de recuperación y transferir la esfera de plast a un matraz de Helen Meyer. Incubar durante una hora a 30 grados Celsius con agitación. Este paso de recuperación es necesario ya que la traducción se detiene y la localización del ARNm se interrumpe durante el tratamiento con XYs.
Después de una hora, añada 0,1 miligramos por mililitro de cicloheida y transfiera los esferoplastos a tubos cónicos de 50 mililitros previamente enfriados. La adición de cicloheida es importante para congelar la asociación de los ribosomas con los ARNm. De este modo, se mantiene la asociación dependiente de ribosomas del ARNm con las mitocondrias.
Centrifugar la esfera de plass a 3000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante y lavar dos veces con manitol frío. Reutilizar tampón.
Suspenda la esfera de plass con cuatro mililitros de tampón de manitol frío y transfiera la suspensión a un homogenizador tipo Dounce de capacidad de 15 mililitros equipado con un pistilo ajustado herméticamente. Rompa suavemente la esfera de plass con 15 movimientos y transfiera el lisado a un tubo de 13 mililitros. Centrifugue el lisado a 1.500 × g durante seis minutos a cuatro grados Celsius.
Para obtener un sedimento de núcleos y células no rotas. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo. Reserve un mililitro o el 25 % de la muestra como muestra no fraccionada o total.
Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un nuevo tubo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB. Para el análisis de sangre por western, el ARN se precipitará del resto de la muestra total para análisis por northern y microarreglos. Centrifugue el sobrenadante a 10.000 veces.
Gravedad durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Para obtener el sedimento de mitocondrias, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y manténgalo en hielo. Esta es la fracción citosólica.
Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un nuevo tubo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB. Para el análisis por inmunotransferencia, el ARN se precipitará del resto de la muestra citosólica para los análisis por hibridación y microarreglos. Lave el precipitado con tres mililitros de manitol, tampón y centrifugue nuevamente a 10.000 veces.
Centrifugar por 10 minutos a cuatro grados Celsius. Suspender nuevamente el precipitado con tres mililitros de tampón de manitol. Esta muestra contiene las mitocondrias y se denomina fracción mitocondrial.
Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un nuevo tubo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB para el análisis por inmunotransferencia. Para comenzar este procedimiento, añada a cada muestra un volumen de ocho molar guad dium, HCEL y dos volúmenes de etanol al 100 %, vortexee e incube durante al menos dos horas a menos 20 grados Celsius. Centrifugue las muestras a 10 000 veces la gravedad durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.
Deseche el sobrenadante. Tenga cuidado, ya que el precipitado podría ser inestable. Después de lavar el precipitado con etanol al 70%, suspenda el precipitado con 400 microlitros de agua libre de RNAsas y transfiera la muestra a un nuevo tubo eppendorf.
Precipite el ARN nuevamente añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar pH 5,2 y dos volúmenes de etanol al 100 %, vortexee e incube durante al menos dos horas a menos 20 grados Celsius. Centrifugue las muestras a 20.000 veces la gravedad durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.
Deseche el sobrenadante y lave con etanol al 70%. Seque el precipitado al aire y re suspenda con agua libre de RNAsas. Almacene las muestras de ARN a menos 80 grados Celsius.
Las muestras pueden utilizarse posteriormente para análisis de northern o de microarreglos. Para preparar el ARN para el análisis de microarreglos, primero resuspenda cada pellet de ARNm obtenido mediante HCl de guanidina y precipitación con etanol en 650 microlitros de agua libre de ARNasas y transfiéralo a un tubo con tapa de rosca. Luego, añada 650 microlitros de fenol ácido-cloroformo y vortexee vigorosamente; centrifugue a velocidad máxima durante dos minutos.
Transfiera 500 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Evite tomar la interfase, ya que contiene ADN. También tenga cuidado de no tomar fenol, el cual puede inhibir la reacción de transcripción inversa.
Elimine la heparina de la muestra de ARN mediante precipitación con cloruro de litio. Añada cloruro de litio hasta una concentración final de dos molar y deje incubar las muestras durante la noche a menos 20 grados Celsius al día siguiente. Derrita las muestras a cuatro grados Celsius y centrifugue a 20.000 veces.
Centrifugar durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Desechar cuidadosamente el sobrenadante y lavar el precipitado con etanol al 80 %, centrifugando. Nuevamente, desechar el sobrenadante, secar al aire y resuspender el precipitado en 150 microlitros de agua libre de RNAsas. Precipitar nuevamente cualquier residuo de cloruro de litio con 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar, pH 5,3, y tres volúmenes de etanol al 100 %, e incubar a menos 20 grados Celsius durante al menos dos horas.
Centrifugar a máxima velocidad durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Lavar cuidadosamente el pellet transparente con etanol al 80 % y secar al aire. Finalmente, resuspender el pellet en 25 microlitros de agua libre de RNAsas y conservar las muestras a menos 80 grados Celsius.
El éxito de este protocolo en separar una fracción que contiene mitocondrias de los componentes citosólicos se evalúa mejor realizando un análisis northern y un análisis western en muestras de las diferentes etapas de aislamiento. En este ejemplo, las muestras procedían de antes de la fraccionamiento o de la fracción total, la fracción citosólica y la fracción mitocondrial. Se realizó un análisis northern para los siguientes ARNm, COB y un ARN.
Que se transcribe dentro de las mitocondrias, un CO1 y ARNm que codifica una proteína que se importa a las mitocondrias. Un CT1, un ARNm que codifica la proteína de actina citosólica y SEC61, un ARNm que codifica una proteína residente del retículo endoplásmico. El panel inferior muestra una tinción con azul de metileno de la membrana del norte donde se detectan dos bandas prominentes de ARN: 25 s y 18 s.
Dado que COB se transcribe dentro de las mitocondrias, su señal debería estar exclusivamente en las mitocondrias, tal como se observó en este estudio. La aparición de COB en la fracción citosólica indicará la lisis mitocondrial durante la preparación.
ACO uno codifica una proteína que se importa a las mitocondrias y aparece principalmente en la fracción mitocondrial. CT uno codifica una proteína citosólica y por lo tanto aparece principalmente en la fracción citosólica. La presencia de SEC 61 en la fracción mitocondrial indica la presencia de componentes del RE en esta fracción.
Las señales de los ARN aparecen en ambas fracciones, lo que indica la presencia de ribosomas. Se realizó un análisis por inmunotransferencia para las siguientes proteínas: POR1 mitocondrial, proteína de membrana externa HXK1, proteína citosólica CUE1 y proteína del RE y RPL39. Como se esperaba, la señal de POR1, una proteína ribosomal, solo se detectó en la fracción mitocondrial.
Si se detectara una señal de POR en la fracción citosólica, sugeriría la disociación de componentes mitocondriales durante la preparación. Asimismo, como se esperaba, hx K uno solo se detectó en la fracción citosólica. La intensa señal de CUE uno en la fracción mitocondrial indica que cantidades significativas de material relacionado con el retículo endoplásmico se coaislan en la fracción mitocondrial.
Esto podría ser un resultado de los contactos físicos conocidos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias. La señal de RPL39 aparece en ambas fracciones, confirmando nuevamente la presencia de ribosomas en ambas fracciones; sin embargo, excluir el paso de recuperación del procedimiento provoca la desaparición de los ribosomas de la fracción M, lo que afectará la asociación de ARNm con las mitocondrias. Además de verificar la calidad de la separación entre los componentes mitocondriales y citosólicos, es importante confirmar que el ARN o las proteínas en las muestras se encuentran intactos y que no hay pérdidas severas de ARN o proteínas durante la preparación de las muestras.
El ARN y las proteínas intactos deben detectarse como bandas distintas en los análisis, como se muestra aquí. Para el ARNm de c CCP, que codifica una proteína que se importa a las mitocondrias, la aparición de bandas más cortas adicionales o manchas indicará degradación. Las pérdidas severas darán lugar a una diferencia significativa entre la cantidad total y la cantidad relativa de señal, lo cual no se observó en conjunto.
Estos resultados validan este protocolo como un método eficaz para el aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos a escala genómica como la secuenciación de ARN o el análisis proteómico con el fin de identificar características clave y únicas de las funciones organulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ARN asociado a las mitocondrias.
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Descripción general
Este artículo describe un procedimiento para aislar mitocondrias asociadas con ARNm en proceso de traducción en levadura. El método consiste en recolectar células de levadura, lisarlas y separar las mitocondrias de los componentes solubles mediante centrifugación diferencial.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Biología Molecular
- Neurociencia
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en el metabolismo celular.
- La traducción localizada de ARNm es importante para la función mitocondrial.
- Comprender la localización del ARNm puede revelar información sobre los procesos celulares.
- La levadura sirve como organismo modelo para estudiar la biología mitocondrial.
Objetivo del estudio
- Aislar mitocondrias junto con sus ARNm y ribosomas asociados.
- Investigar los mecanismos de localización del ARNm cerca de las mitocondrias.
- Proporcionar un protocolo aplicable bajo diversas condiciones de crecimiento.
Métodos Utilizados
- Recolección de células de levadura cultivadas en condiciones que enriquecen las mitocondrias.
- Lisis suave de las células en presencia de cicloheximida.
- Centrifugación diferencial para separar mitocondrias de los componentes solubles.
- Extracción de ARN de mitocondrias y muestras de control.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de mitocondrias asociadas con ARNm en proceso de traducción.
- Demuestra la pureza y calidad del ARN aislado mediante análisis northern.
- Información sobre la localización de los ARNm en relación con la función mitocondrial.
- Aplicaciones potenciales del protocolo en diversas condiciones experimentales.
Conclusiones
- El método descrito aísla eficazmente mitocondrias y ARNm asociados.
- Este enfoque puede mejorar la comprensión de los mecanismos de traducción localizada.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para explorar más a fondo la biología mitocondrial.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los investigadores de biofármacos aislar ARNm y ribosomas asociados a mitocondrias en levaduras, lo que favorece estudios mecanicistas de la traducción localizada relacionada con la importación de proteínas mitocondriales. Al preservar las interacciones nativas entre ARN y proteínas mediante el tratamiento con cicloheximida y la centrifugación diferencial, el método proporciona un sistema confiable para reducir los riesgos asociados a hipótesis sobre la expresión génica específica de orgánulos. Este enfoque ofrece valor predictivo para la validación de dianas en biología mitocondrial y permite perfiles transcriptómicos o proteómicos escalables para identificar elementos reguladores que influyen en la producción de proteínas terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la localización de ARNm con la eficiencia de importación mitocondrial y el rendimiento funcional de proteínas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la evaluación directa de las asociaciones entre ribosomas, ARNm y mitocondrias en condiciones casi nativas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar características del ARNm que se correlacionan con una localización mitocondrial exitosa y un menor riesgo de expresión ectópica.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Prepara fracciones mitocondriales validadas para análisis posteriores mediante secuenciación de ARN o microarreglos, con el fin de identificar señales de localización y factores *trans*-actuantes.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras mediante un aislamiento en un solo paso de ARNm, ribosomas y proteínas, mejorando la reproducibilidad entre diferentes ensayos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para análisis comparativos bajo distintas condiciones genéticas o ambientales, apoyando el avance desde descubrimientos iniciales hasta candidatos prometedores en programas de dianas mitocondriales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los datos de localización de ARNm en fase de descubrimiento con la validación preclínica al permitir el aislamiento consistente de transcritos asociados a mitocondrias en diferentes sistemas modelo.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Se centra en la reducción predictiva de riesgos de dianas implicadas en la biogénesis mitocondrial mediante la confirmación del aislamiento conjunto de componentes del retículo endoplásmico y mitocondriales, lo que aporta información para evaluar su especificidad.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la identificación de biomarcadores traducibles mediante la validación por blot northern de la distribución de ARNm mitocondrial frente a citosólica, ayudando a clarificar el mecanismo de acción.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la comprobación de hipótesis en la validación de dianas y permitiendo lecturas ómicas escalables que orientan la identificación de compuestos prometedores y la toma de decisiones preclínicas.
- Biología del descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de ARNm asociados a mitocondrias para probar mecanismos de traducción localizada y regulación específica de orgánulos.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante análisis cuantitativo por hibridación ARN (northern) o microarrays del ARN aislado, proporcionando lecturas reproducibles para comparar la localización de ARNm en distintas condiciones.
- Análisis: Genera resultados cuantificables como ratios de enriquecimiento de ARN y métricas de pureza en la fraccionamiento, lo que permite a los equipos comparar condiciones y evaluar la consistencia técnica.
- Investigación traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica al ofrecer un método estandarizado para aislar material asociado a mitocondrias, destinado a validaciones funcionales posteriores en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización empresarial: Posiciona el protocolo como una capacidad de plataforma reutilizable en lugar de una técnica de uso único, favoreciendo la estandarización entre proyectos en programas de biología mitocondrial.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la observación directa de la co-localización de ARNm-mitocondria-ribosoma, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la expresión génica mitocondrial.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante un único procedimiento que aísla múltiples clases de macromoléculas, minimizando la variabilidad del flujo de trabajo.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar al permitir una evaluación temprana de la eficiencia de direccionamiento mitocondrial, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas del desarrollo de terapéuticos proteicos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos de localización del ARNm, que apoya el avance eficiente en términos de capital de dianas con evidencia sólida de asociación mitocondrial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular de levaduras, aislamiento de orgánulos y manejo de ARN para mantener la integridad de las muestras durante todo el procedimiento.
- Depende del acceso a equipos de centrifugación diferencial y a ambientes libres de RNasas para un aislamiento confiable de mitocondrias y ARN.
- Necesita una estandarización entre equipos de los parámetros de lisis y fraccionamiento para garantizar resultados consistentes entre laboratorios o proyectos.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a sistemas no pertenecientes a levaduras, ya que los pasos relacionados con la integridad de la pared celular y de la membrana son específicos del organismo.
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible aislamiento conjunto de material derivado del retículo endoplasmático debido a los sitios de contacto entre membranas conocidos, lo cual debe tenerse en cuenta durante la interpretación de los datos.
