Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

El objetivo general de este procedimiento es aislar las mitocondrias asociadas con la traducción de ARNm de ARNm. Esto se logra cosechando primero células de levadura cultivadas en condiciones de enriquecimiento de mitocondrias. El segundo paso es cortar suavemente las células en presencia de cicloheide.

A continuación, las mitocondrias se separan de los componentes solubles mediante centrifugación diferencial. El paso final es la extracción del ARN de las mitocondrias y de las muestras de control. En última instancia, el análisis del norte se utiliza para mostrar la pureza y la calidad del ARN asociado a las mitocondrias.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar muchos tipos de ARN en una sola preparación. Por lo tanto, se puede hacer un análisis comparativo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como la orientación intracelular y la función orgánica.

En este procedimiento, las mitocondrias se purificarán de 100 a 150. Mililitros de células de levadura cultivadas a un OD 600 de uno a 1,5 a 30 grados centígrados en un crecimiento no fermentable. Medio. Centrifugar las celdas a 3000 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lavar el pellet con centrífuga de agua destilada doble nuevamente.

Después de desechar el sobrenadante, pese el pellet de la celda. Por lo general, se obtienen alrededor de 0,6 gramos de 100 mililitros de células. Resus suspende el pellet en un mililitro de tampón DTT por cada 0,5 gramos de células.

Es importante tratar las células con un agente reductor para romper los enlaces de sulfuro dentro de la pared celular, mejorando así la hidrólisis e incubar las células durante 10 minutos a 30 grados centígrados con una suave agitación. A continuación, centrifugar las células a 3000 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet.

En un mililitro de tampón de liasa xmal por cada 0,15 gramos de células no hay vórtice. Mida el diámetro exterior 600 de una alícuota de 10 microlitros de las células en 990 microlitros de agua y registre este valor. Agregue xmal liase recién preparado a las células para hidrolizar polímeros de glucosa en los enlaces beta uno tres glucanos y generar Sphero plast.

A partir de aquí, Sphero plast debe mantenerse en una solución isotónica para evitar la lisis, incubar las células durante 15 minutos a 30 grados centígrados con una agitación suave. Para verificar la hidrólisis de la pared celular y la esfera de generación de plastos, mezcle 10 microlitros de las celdas con 990 microlitros de agua y mida el OD 600 Se espera que las placas de Sphero piquen debido a la diferencia osmótica y el OD 600 debe ser al menos diez veces menor que el valor determinado antes de agregar xmal liase. De lo contrario, continúe la incubación con xmal liase durante otros 15 minutos.

Vuelva a suspender el PHE de Plast con 100 mililitros de medio de recuperación y transfiera la esfera de Plast a un matraz Helen Meyer. Incubar durante una hora a 30 grados centígrados con agitación. Este paso de recuperación es necesario ya que la traducción se detiene y la localización del ARNm se interrumpe durante el tratamiento con XY.

Después de una hora, agregue 0,1 miligramos por mililitro, cicloheide y transfiera el Sphero plast a tubos cónicos preenfriados de 50 mililitros. La edición de Cyclo Heide es importante para congelar la asociación de los ribosomas con los ARNm. Por lo tanto, se mantiene la asociación del ARNm dependiente de ribosomas con las mitocondrias.

Centrífuga, la esfera de plass a 3000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lávese dos veces con manitol frío. Buffer reus.

Suspenda la esfera de plass con cuatro mililitros de tampón de manitol frío y transfiera la suspensión a un homogeneizador de plumón de 15 mililitros de capacidad equipado con un mortero hermético. Rompa suavemente la esfera de plass con 15 golpes y transfiera el lisado a un tubo de 13 mililitros. Centrifugar el lisado a 1.500 veces la gravedad durante seis minutos a cuatro grados centígrados.

Para pellet los núcleos y las células intactas. Transfiera con cuidado la súper natina a un tubo nuevo. Reserve un mililitro o el 25% de la muestra como muestra no fraccionada o total.

Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un tubo nuevo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB. Para el análisis de sangre occidental, el ARN se precipitará a partir del resto de la muestra total para los análisis septentrionales y de microarrays. Centrifugar la supernatina 10.000 veces.

Gravedad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para granular las mitocondrias, transfiera la súper natina a un tubo nuevo y manténgala en hielo. Esta es la fracción citosólica.

Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un tubo nuevo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB. Para el análisis de Western blot, el ARN se precipitará a partir del resto de la muestra citosólica para análisis de norte y microarrays. Lavar el pellet con tres mililitros de manitol, tampón y centrifugar de nuevo 10.000 veces.

Gravedad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Reus suspende el pellet con tres mililitros de tampón manitol. Esta muestra contiene las mitocondrias y se denomina fracción de mitocondrias.

Transfiera 50 microlitros de esta muestra a un tubo nuevo y agregue 15 microlitros de cuatro XLSB para el análisis de Western blot. Para comenzar este procedimiento, agregue a cada muestra un volumen de ocho molares de guaddio, HCEL y dos volúmenes de vórtice de etanol al 100% e incube durante al menos dos horas a menos 20 grados Celsius. Centrifugar las muestras a 10.000 veces la gravedad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante. Tenga cuidado ya que el pellet puede ser inestable. Después de lavar el pellet con etanol reus al 70%, suspenda el pellet con 400 microlitros de agua libre de ARN y transfiera la muestra a un nuevo tubo de einor.

Precipite el ARN nuevamente agregando 0,1 volumen de acetato de sodio de tres molares pH 5,2 y dos volúmenes de vórtice de etanol al 100% e incube durante al menos dos horas a menos 20 grados Celsius. Centrifugar muestras a 20.000 veces. Gravedad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante y lávese con etanol al 70%. Secar al aire el pellet y resus suspender con ARN libre de ARN almacenado en agua. Muestras a menos 80 grados centígrados.

Posteriormente, las muestras se pueden utilizar para análisis de norte o microarrays. Para preparar el ARN para el análisis de microarrays, primero se suspende cada pellet de ARNm obtenido de la precipitación de HCL y etanol con 650 microlitros de ARN libres de agua y se transfiere a un tubo de rosca en el extremo del orph. A continuación, añadir 650 microlitros de cloroformo de fenol ácido y centrifugar vigorosamente a máxima velocidad durante dos minutos.

Transfiera 500 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Evite tomar la interfase ya que contiene ADN. También tenga cuidado de evitar tomar fenol, que puede inhibir la reacción de transcripción inversa.

Eliminar la heparina de la muestra de ARN mediante precipitación de cloruro de litio. Agregue cloruro de litio a una concentración final de dos molares e incube las muestras durante la noche a menos 20 grados centígrados al día siguiente. Descongele las muestras a cuatro grados centígrados y centrifuga 20.000 veces.

Gravedad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche con cuidado el sobrenadante y lave el pellet con una centrífuga de etanol al 80%. Nuevamente, deseche el sobrenadante al aire seco y vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de ARN con agua libre para eliminar cualquier precipitado residual de cloruro de litio nuevamente con 0.1 volumen de acetato de sodio de tres molares pH 5.3 y tres volúmenes de etanol 100% incubar a menos 20 grados centígrados durante al menos dos horas.

Centrifugar a máxima velocidad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Lave cuidadosamente el pellet transparente con etanol al 80% y séquelo al aire. Finalmente, vuelva a suspender el pellet con 25 microlitros de ARN de agua libre y mantenga las muestras a menos 80 grados centígrados.

El éxito de este protocolo en la separación de una fracción que contiene mitocondrias de componentes citosólicos se prueba mejor mediante la realización de análisis del norte y del oeste en muestras de los diferentes pasos de aislamiento. En este ejemplo, las muestras eran anteriores al fraccionamiento o a la fracción total, la fracción citosólica y la fracción mitocondrial. Se realizó un análisis del norte para los siguientes ARNm, COB y ARN.

Que se transcribe dentro de las mitocondrias, A CO y ARNm que codifica una proteína que se importa a las mitocondrias. Una CT, un Mr.Nna que codifica la proteína actina citosólica y SEC 61 un M nna que codifica una proteína residente del RE. El panel inferior es una tinción de azul de metileno de la membrana norte donde se detectan dos bandas prominentes de ARN 25 s y 18 s.

Dado que la COB se transcribe dentro de las mitocondrias, su señal debe estar exclusivamente en las mitocondrias. Como se observó en este estudio. La aparición de COB en la fracción citosólica indicará la lisis de las mitocondrias durante la preparación.

ACO one codifica una proteína que se importa a las mitocondrias y aparece principalmente en la fracción mitocondrial. Una TC codifica una proteína citosólica y, por lo tanto, aparece principalmente en la fracción citosólica. La presencia de SEC 61 en la fracción mitocondrial indica la presencia de componentes del RE en esta fracción.

Las señales de los ARN aparecen en ambas fracciones indicando la presencia de ribosomas. Se realizó un análisis occidental para las siguientes proteínas, mitocondrias POR una A, proteína de membrana externa hx, K una A, proteína citosólica CUE one y proteína ER y RPL 39. Una proteína ribosómica como se esperaba, POR una señal, solo se detectó en la fracción mitocondrial.

Si se detectara una señal de POR en la fracción citosólica, sugeriría la disociación de los componentes mitocondriales durante la preparación. Además, como era de esperar, hx K one solo se detectó en la fracción citosólica. La fuerte señal CUE one en la fracción mitocondrial indica que cantidades significativas de material relacionado con RE están coaisladas en la fracción mitocondrial.

Esto puede ser el resultado de los contactos físicos conocidos entre el RE y las mitocondrias. La señal RPL 39 aparece en ambas fracciones, nuevamente, confirmando la presencia de ribosomas en ambas fracciones, excluyendo el paso de recuperación del procedimiento da como resultado la desaparición de los ribosomas de la fracción M, lo que afectará la asociación del ARNm con las mitocondrias. Además de verificar la calidad de la separación entre los componentes mitocondriales y citosólicos, es importante confirmar que el ARN o las proteínas de las muestras estén intactos y que no haya pérdidas graves de ARN o proteínas durante la preparación de la muestra.

Intactos, el ARN y las proteínas deben detectarse como bandas distintas en los análisis, como se muestra aquí. En el caso del ARNm de c CCP one, que codifica una proteína que se importa a las mitocondrias, la aparición de bandas más cortas o frotis adicionales indicará degradación. Las pérdidas graves darán lugar a una diferencia significativa entre la cantidad total y la cantidad relativa de señal, que no se observó, en conjunto.

Estos resultados validan este protocolo como un método eficaz para el aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos de todo el genoma como el análisis de RNA-Seq o proteómico para identificar las características clave y únicas de las funciones orgánicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el ARN asociado con las mitocondrias.