La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

El objetivo general de este procedimiento es imprimir fibroblastos T3 sobre una superficie recubierta con suero. Esto se logra primero mediante la adsorción previa de suero sobre una superficie de cultivo de tejidos. El segundo paso consiste en imprimir una suspensión de fibroblastos sobre la superficie utilizando un microdispensador de flujo continuo, seguido de la incubación de las células a 37 grados Celsius durante dos horas.

A continuación, las células impresas, así como las células sembradas mediante cultivo celular estándar, se tiñen con yoduro de propidio y se visualizan bajo un microscopio invertido para su comparación. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para evaluar la viabilidad, densidad y morfología celular en los puntos de tiempo relevantes. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la impresión por punzón es que la cabeza de impresión forma un sello sobre la superficie, lo que permite imprimir las células sumergidas en medio celular.

Aunque la impresión sumergida de células es útil para evaluar nuevos candidatos a fármacos en cuanto a seguridad y eficacia, la impresión sumergida en general también resulta útil para otras aplicaciones. Por ejemplo, podemos analizar nuevos candidatos a fármacos frente a rebanadas de tejido, o podemos utilizarla como modelo para sistemas de órganos. Por ejemplo, un modelo de perfusión hepática.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque durante la preparación de la impresora y la impresión celular, no debe entrar aire en las líneas, ya que podría causar la muerte celular. Comience descongelando células NIH 3T3 durante dos a tres minutos en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius. Suspender nuevamente las células en cinco mililitros de medio completo y centrifugar a 1500 Gs durante tres minutos.

Retire el sobrenadante celular sin perturbar el botón celular. Luego, re suspenda las células en cinco mililitros de medio y transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros. A continuación, agregue 10 microlitros de azul de tripano a la suspensión celular y mezcle con la punta de la pipeta; transfiera 10 microlitros de las células teñidas a una cámara de hemocitómetro.

Antes de contar las células a 10 x de aumento, cuente las células viables que se asemejan a pequeñas esferas blancas en cuatro de los nueve cuadros grandes. Solo cuente las células viables que no presenten color azul oscuro debido a la tinción con azul de tripano. Calcule el número promedio de células por cuadro grande, lo que resulta en el número de células multiplicado por 10.000 células por mililitro en la suspensión celular original.

Luego siembre las células a una densidad de 100.000 células por mililitro con un total de cinco mililitros en cada frasco T25. Cultive las células hasta alcanzar entre un 70 y un 80 % de confluencia antes de comenzar los experimentos. Para preparar la superficie de impresión, utilice un marcador para delinear un rectángulo del tamaño de la cabeza de impresión en la parte inferior de un poliestireno tratado para cultivo de tejidos 12.

Pipetee 50 microlitros de suero bovino fetal en el área rectangular de la placa de pocillos y extiéndalos por toda la región. Con la punta, deje la placa de pocillos en una campana de seguridad biológica estéril durante la noche para permitir que la mancha de suero se seque completamente. Para comenzar la impresión sumergida, enjuague la cabeza impresora con agua destilada.

Luego, llene un plato de Petri de 60 milímetros con agua destilada y acople la boquilla de impresión sobre la superficie; haga fluir agua destilada a través de cada una de las líneas durante dos minutos a 150 microlitros por minuto utilizando una bomba neumática. A continuación, deseche el agua del plato de Petri y llénelo con agua limpia. Después, mueva la boquilla de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua tres veces.

Coloque el cabezal de impresión centrado sobre el punto recubierto con suero en la placa de 12 pocillos previamente preparada. A continuación, prepare el cabezal de impresión con 300 microlitros por canal de medio completo precalentado.

Si se realizan múltiples impresiones, agregue un enjuague con lejía además del enjuague con agua entre impresiones. Proceda a imprimir las células en suspensión a una concentración de 50.000 células por mililitro sobre la superficie, y a 60 microlitros por minuto. 100 microlitros por canal.

Después de la impresión celular, coloque la boquilla de impresión fijada a la izquierda contra la superficie y el manifold en una incubadora de cultivo celular. Ajuste a 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius durante dos horas. Después de la incubación de dos horas, retire la boquilla de impresión y coloque la tapa sobre el recipiente de cultivo.

El momento en que se retira la cabeza de impresión se considera el punto de tiempo cero. A modo de comparación, también se realiza un cultivo celular estándar. Añada un mililitro de medio precalentado a una de las placas de 12 pocillos con suero, luego tome un mililitro de la suspensión celular restante y pipetéelo en un solo pocillo de la placa de 12 pocillos.

Esto producirá un cultivo que contiene 50 000 células en la placa. Coloque la placa de cultivo celular en un incubador a 37 grados Celsius durante dos horas. Después de la incubación de dos horas, comience a medir el tiempo para asegurar la consistencia entre las muestras impresas y sembradas.

Este se considera el punto de tiempo cero. Después de 0, 2, 24 y 48 horas, prepare las células de cada uno de los dos métodos para su visualización mediante tinción con yoduro de propidio, que solo se incorpora al núcleo de las células muertas. Primero, enjuague suavemente las células tres veces con un mililitro de solución salina tamponada con fosfatos con calcio y magnesio para eliminar cualquier residuo.

A continuación, agregue un mililitro de medio de cultivo precalentado a cada recipiente de cultivo y luego un microlitro de yoduro de propidio. Incube la solución stock las células teñidas con yoduro de propidio a 37 grados Celsius durante 10 minutos antes de observar las células mediante un microscopio invertido con aumentos de 10 x y 40 x. Finalmente, deseche las células en un recipiente adecuado para residuos biológicos peligrosos.

La línea celular de fibroblastos, las células NIH 3T3, se imprimieron o sembraron sobre una superficie sumergida. Después de la impresión y siembra, las células se visualizaron para evaluar la densidad y la morfología en los puntos temporales relevantes. Las imágenes mostraron que las células presentan fenotipos casi idénticos en cada punto temporal y en cada aumento.

Según estos datos, se determinó que la impresión efectiva fue mínima. La viabilidad celular se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio y reveló que la viabilidad de las células impresas no difería significativamente de la de las células adheridas en cada punto temporal. La principal diferencia entre los dos métodos de fijación de las células a la superficie es la densidad de las células.

La densidad de células impresas disminuye en más del 50 % en el punto temporal de dos horas, tanto en células sembradas como en células impresas. Se requiere un estudio adicional para determinar la causa de esta disminución. Sin embargo, las proporciones de densidad impresa en general, en comparación con las sembradas, siguen siendo significativamente más altas.

La densidad celular impresa en la celda de flujo fue aproximadamente 10 veces mayor en cada punto temporal que la de las células sembradas, considerando que las células se imprimieron con la misma densidad que en el siembra, pero en un área más pequeña. En el punto temporal final, las células presentan la misma densidad, lo cual probablemente se deba a la motilidad celular y a las limitaciones por consumo de recursos. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que investigadores en áreas como el descubrimiento de fármacos estudien los efectos de la toxicidad y eficacia de medicamentos sobre células y enfermedades como el cáncer, enfermedades cardíacas y otros campos de alta demanda.

Al utilizar la impresión de células sumergidas en conjunto con otras tecnologías, como la adhesión celular programable, podemos ampliar el alcance de esta técnica hacia células en suspensión para ensayos expandidos de descubrimiento y desarrollo de fármacos. Después de ver este video, debería tener una comprensión sólida de cómo imprimir células utilizando nuestra técnica de impresión sumergida.