La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

El objetivo general de este procedimiento es imprimir tres fibroblastos T tres en una superficie recubierta de suero. Esto se logra primero preadsorbiendo el suero en una superficie de cultivo de tejidos. El segundo paso consiste en imprimir una suspensión de fibroblastos en la superficie utilizando un microobservador de flujo continuo, seguido de la incubación de las células a 37 grados centígrados durante dos horas.

A continuación, las células impresas, así como las células sembradas a través de un cultivo celular estándar, se tiñen con yoduro de propidio y se visualizan bajo un microscopio invertido para su comparación. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para evaluar la viabilidad, la densidad y la morfología de las células en puntos temporales relevantes. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la impresión con alfileres, es que el cabezal de impresión forma un sello sobre la superficie, lo que permite imprimir las células mientras se sumergen en el medio celular.

Si bien la impresión sumergida de células es útil para la detección de nuevos candidatos a fármacos en cuanto a seguridad y eficacia, la impresión sumergida en general también es útil para otras aplicaciones. Por ejemplo, podemos analizar nuevos candidatos a fármacos frente a cortes de tejido, o podemos utilizarlo como modelo para sistemas de órganos. Por ejemplo, un modelo de profusión hepática.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque durante el cebado de la impresora y la impresión de células, el aire no puede entrar en las líneas o puede causar la muerte de las células. Para comenzar, descongele las tres células T tres durante dos o tres minutos en un baño de agua agitado a 37 grados centígrados. Vuelva a suspender las celdas en cinco mililitros de medio completo y centrifugue a 1500 Gs durante tres minutos.

Retire el sobrenadante celular sin alterar la pelletización de la celda. A continuación, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio y transfiera 10 microlitros de la suspensión de la célula a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. A continuación, agregue 10 microlitros de azul triam a la suspensión celular y agite con la punta de la pipeta pipeta 10 microlitros de las células teñidas en una cámara de hemocitómetro.

Antes de contar las celdas con un aumento de 10x, cuente las celdas vivas que se asemejan a pequeñas bolas blancas para cuatro de los nueve cuadrados grandes. Solo cuente las células vivas que no aparezcan de color azul oscuro de la tinción azul trippen. Calcule el número promedio de celdas por cuadrado grande, lo que da como resultado el número de celdas por 10,000 celdas por mililitro en la suspensión de celdas original.

A continuación, siembre las células a una densidad de 100.000 células por mililitro con un total de cinco mililitros en cada matraz T 25. Cultive las células entre el 70 y el 80% de fluidez antes de comenzar los experimentos. Para preparar la superficie de impresión, utilice un marcador para marcar un rectángulo del tamaño del cabezal de impresión en la parte inferior de un poliestireno tratado con cultivo de tejidos 12.

Pipetear 50 microlitros de suero fetal bovino en el área rectangular y extenderlo por toda la región. Con la punta, deje la placa de pocillo en una campana de bioseguridad estéril durante la noche para permitir que la mancha de suero se seque por completo. Para comenzar la impresión sumergida, enjuague el cabezal de impresión con agua destilada.

A continuación, llene una placa de Petri de 60 milímetros con agua destilada y acople el cabezal de impresión a la superficie, haga fluir agua destilada a través de cada una de las líneas durante dos minutos a 150 microlitros por minuto utilizando una bomba neumática. Luego desecha el agua de la placa de Petri y llénala con agua limpia. A continuación, mueva el cabezal de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua tres veces.

Acople el cabezal de impresión en el centro sobre el punto recubierto de suero en la placa de 12 pocillos preparada previamente. A continuación, cebe el cabezal de impresión con Prewarm. Medios completos a 300 microlitros por canal.

Si realiza varias impresiones, agregue un enjuague con lejía además del enjuague con agua entre impresiones. Proceda a imprimir las células suspendidas a una concentración de 50.000 células por mililitro en la superficie, y a 60 microlitros por minuto. 100 microlitros por canal.

Después de la impresión celular, coloque el cabezal de impresión a la izquierda acoplado contra la superficie y el colector en una incubadora de cultivo celular. Ajuste a 5% de dióxido de carbono y 37 a grados Celsius durante dos horas. Después de las dos horas de incubación, retire el cabezal de impresión y coloque la tapa en la placa de cultivo.

La hora a la que se retira el cabezal de impresión se considera el punto de tiempo de hora cero. A modo de comparación, también se realiza un cultivo celular estándar. Agregue un mililitro de medio precalentado a una de las placas de 12 pocillos con manchas de suero, luego tome un mililitro de la suspensión celular restante y pipetee en un solo pocillo de la placa de 12 pocillos.

Esto producirá un cultivo que contendrá 50.000 células en la placa. Coloque la placa de cultivo celular en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de las dos horas de incubación, comience a cronometrar la consistencia entre las muestras impresas y las de siembra.

Esto se considera el punto de tiempo de cero horas. Después de 0, 2, 24 y 48 horas, prepare las células de cada uno de los dos métodos para obtener imágenes mediante tinción con yoduro de propidio, que solo se incorpora al núcleo de las células muertas. Primero, enjuague suavemente las células tres veces con un mililitro de solución salina inflada con fosfato con calcio y magnesio para eliminar cualquier residuo.

A continuación, agregue un mililitro del medio de cultivo precalentado a cada recipiente de cultivo y luego un microlitro de yoduro de propidio. La solución madre incuba las células teñidas con yoduro de propidio a 37 grados Celsius durante 10 minutos antes de obtener imágenes de las células con un microscopio invertido con un aumento de 10x y 40x. Finalmente, deseche las células en un recipiente de riesgo biológico apropiado.

La línea celular de fibroblastos, NIH tres células T tres se imprimieron o sembraron en una superficie sumergida. Después de la impresión y la siembra, las células se visualizaron para evaluar la densidad y la morfología en puntos de tiempo relevantes. Las imágenes mostraron que las células poseen fenotipos casi idénticos en cada punto de tiempo y en cada aumento.

Sobre la base de estas cifras, se determinó que la impresión efectiva era mínima. La viabilidad celular se evaluó mediante una tinción de yoduro de propidio y reveló que la viabilidad de las células impresas no era significativamente diferente a la de las células asentadas para cada punto de tiempo. La principal diferencia entre los dos métodos de fijación de las células a la superficie es la densidad de las células.

La densidad de celdas impresas disminuye en el punto de tiempo de dos horas en más del 50% tanto en las celdas sentadas como en las impresas. Se justifican más estudios para determinar la causa de esta disminución. Sin embargo, las proporciones generales de densidad impresa en comparación con las semillas siguen siendo significativamente más altas.

La densidad de células impresas en la celda de flujo fue aproximadamente 10 veces más densa en cada punto de tiempo que las células sembradas considerando que las células se imprimieron a la misma densidad que la siembra, pero en un área más pequeña. En el punto de tiempo final, las celdas están a la misma densidad, lo que probablemente se deba a la motilidad de la celda y a las limitaciones de consumo de recursos. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en las áreas de descubrimiento de fármacos estudien los efectos de la toxicidad y eficacia de los fármacos en las células y el cáncer, las enfermedades cardíacas y otros campos de alta demanda.

Mediante el uso de la impresión de células sumergidas junto con otras tecnologías como la adherencia y la adhesión de células programables, podemos ampliar el alcance de la técnica a las células de suspensión para ampliar el descubrimiento de fármacos y el cribado del desarrollo. Después de ver este video, debería tener una sólida comprensión de cómo imprimir celdas utilizando nuestra técnica de impresión sumergida.