Name: La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a imprimir células sumergidas en superficies modificadas con suero utilizando un microspotter de flujo continuo. Este método permite evaluar viabilidad celular y morfología mediante microscopía de fluorescencia para cribado de fármacos.

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Los autores desean agradecer a Chris Morrow para la asistencia técnica. La financiación fue proporcionada por NIH SBIR (R43) conceder 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Preparación de células Cultura <ol><li> Almacene las poblaciones de células NIH/3T3 en nitrógeno líquido hasta que esté listo para su uso. </li><li> Preparar los medios de comunicación completa para células NIH/3T3 utilizando medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, tampón HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Descongelar las células durante 2-3 minutos en un baño de agua con agitación a 37 ° C. </li><li> Resuspender las células en 5 ml de medio completo y se centrifuga a 1500 xg durante 3 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante de células sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en 5 ml de los medios de comunicación y contar las células usando un hemocitómetro. <ol><li> Retire 10 l de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Añadir 10 l de azul de tripano a la suspensión celular y se agita con la punta de la pipeta. </li><li> Pipetear 10 l de las células teñidas en una cámara de hemocitómetro. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro a 10xmagnificación. <ol><li> Contar las células vivas (pequeñas bolas blancas) para 4 de los 9 cuadrados grandes. Sólo contar las células vivas que no aparecen de color azul oscuro de la mancha azul de tripano. </li><li> Calcular el número medio de células por cuadrado grande, lo que resulta en el número de células x 10 4 células / ml en la suspensión original de células. </li><li> Se siembran las células a una densidad de 1 x 10 5 células / ml con un total de 5 ml en cada matraz T25. </li></ol></li><li> Cultivar las células a entre 70% y 80% de confluencia antes de los experimentos iniciales. Actualizar medios cada 2-3 días o cuando sea necesario. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la superficie de impresión <ol><li> Marcar un rectángulo con el marcador en la parte inferior de una cultura-tratada de tejido de poliestireno (TCTPS) 12 placa así el tamaño de la cabeza de impresión (7 mm x 19 mm). </li><li> Añadir 50 l de suero fetal bovino en el área rectangular y se extendió por toda la región, con la punta. </li><li> Deje la placa de Petrien una estéril bioseguridad capó O / N para que el lugar de suero se seque por completo. Estas placas deben estar preparados no más de 2 días antes de su uso. </li></ol> 3. Impresión Sumergido <ol><li> Enjuague el cabezal de impresión con agua destilada. <ol><li> Llene un 60 mm placa de Petri con agua destilada y acoplar el cabezal de impresión en la superficie. </li><li> El flujo de agua destilada a través de cada una de las líneas durante 2 minutos a 150 l / min utilizando una bomba neumática. </li><li> Deseche el agua de la placa de Petri y llenarlo con agua limpia. </li><li> Mueva el cabezal de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua 3 veces. </li></ol></li><li> Acople el centro de la cabeza de impresión sobre el lugar de suero recubierto en la placa de pre-preparado 12. </li><li> Cebe el cabezal de impresión con medios completos pre-calentado, 300 l por canal. </li><li> Imprimir células suspendidas a una concentración de 50.000 células / ml sobre la superficie y 60 l / min, 100 l por canal. </li><li> Coloque el cabezal de impresión, izquierdo atracado en contra de lasuperficie, y el colector en una incubadora de cultivo celular establece en 5% de CO 2 y 37 ° C durante 2 h. </li><li> Después de la incubación de 2 horas, retire el cabezal de impresión y coloque la tapa en la placa de cultivo. El momento en el que el cabezal de impresión elimina se considera el punto de tiempo 0 h. </li></ol> 4. Cultivo Celular Estándar <ol><li> Añadir 1 ml de medio de pre-calentado a una de la placa TCTPS 12 pocillos sin suero manchado preparado en el paso 2. </li><li> Tomar 1 ml de la suspensión celular restante de la etapa 2 y la pipeta en un solo pocillo de una TCTPS placa de 12 pocillos. Esto producirá un cultivo que contiene 50.000 células en el plato. </li><li> Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Después de la incubación de 2 horas comenzar el tiempo; para mantener la coherencia entre las muestras impresas y de siembra, esto se considera el punto de tiempo 0 h. </li></ol> 5. Visualización Cultura <ol><li> Después de 0, 2, 24, y 48 células toman horas de cada uno de los dos métodos described arriba y la imagen usando un microscopio invertido estándar. <ol><li> Teñir las células con yoduro de propidio, una mancha fluorescente de color rojo que sólo se incorpora en el núcleo de las células muertas. <ol><li> Enjuague suavemente las células 3 veces con 1 ml de PBS con calcio y magnesio (PBS + +) para eliminar los residuos. </li><li> Añadir 1 ml de pre-calentado PBS + + para cada recipiente de cultivo. </li><li> Añadir 1 l de solución de yoduro de propidio de stock (1 mg / ml) a cada recipiente de cultivo. </li><li> Se incuban las células teñidas con yoduro de propidio a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Imagen de las células utilizando un microscopio invertido a 10x y 40x. </li></ol></li><li> Deseche las células en un contenedor de residuos sanitarios apropiados. </li></ol>

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</ol>

Los autores son los empleados y accionistas de Wasatch Microfluídica que produce reactivos y / o instrumentos utilizados en este manuscrito.

La tecnología de impresión 3D de microfluidos se describe aquí es el único capaz de microfluidically matrices de impresión de las células en un líquido lleno de bien, es decir, una superficie sumergida. Por la impresión sobre superficies sumergidas, de células microarrays se pueden producir que mantienen el fenotipo celular fisiológicamente relevante de las células, así como la capacidad de multiplexar las células en el fondo de un solo pozo Figura 4. Los resultados de este estudio muestran que...

Los avances recientes en la industria farmacéutica han conducido a un mayor interés en el uso de microarrays de celulares en el proceso de descubrimiento de fármacos para la detección de drogas y análisis cytotoxicological 1,2,3. El desarrollo de los ensayos in vitro de alto rendimiento y los métodos de detección utilizando microarrays de células facilitaría el desarrollo rápido y rentable de los candidatos de la droga, así como en el avance de la comprensión fundamental de la célula de 1,4. El enfoque tradicional para el cribado con células utiliza plataformas de placa de pocillos convencionales; Sin embargo este enfoque es limitado debido al alto costo, rendimiento limitado, y la capacidad limitada para obtener información cuantitativa sobre la función celular 1,5. Debido a estas limitaciones, la investigación en las tecnologías de microarrays celular está creciendo para la caracterización molecular biológica, la ingeniería de tejidos, y la detección de drogas 1,6. Las ventajas de los microarrays de celulares incluyen el uso de la muestra más pequeña, efectos mínimos deheterogeneidad fenotipo celular enmascarar la información, y lo más importante la capacidad de automatizar los ensayos para más aplicaciones de alto rendimiento 1,7,8. La industria farmacéutica utiliza actualmente ensayos de cribado basados ​​en células de alto rendimiento con cultivos monocapa de células 2D para la detección de drogas en placas de pocillos de microtitulación 9. Células de multiplexación en pocillos de placas de microtitulación ofrece el potencial para un mayor rendimiento con opciones de experimentación únicas. Además, las tecnologías actuales para microarrays de celulares permiten que las células se sequen que podría alterar dramáticamente el fenotipo de las células in vivo a partir de 10,11. Con el fin de superar estos problemas, el ACFM se ha diseñado y se muestra en la Figura 1. El diseño de los fluidos MFCA 3D permite a la punta del cabezal de impresión en la Figura 1 para ser rebajado en un baño y se comprime contra una superficie para formar un sello. La punta de silicona suave de la cabeza de impresión se comporta como unjunta y forma un sello reversible. La tecnología ACFM es adecuado de forma única para interactuar con las superficies sumergidas, que se requiere para ambos cultivos celulares y sistemas de corte de tejido, y es difícil o imposible con la mayoría de otros enfoques. Alfileres o impresión por chorro de tinta no va a funcionar, y los dispositivos de microfluidos en 2D no son adecuados para la deposición o la interconexión con grandes conjuntos de puntos discretos. Además, por la miniaturización y la localización de la experimento - el microarray celular - la ACFM supera los principales problemas asociados con ensayos de cribado basados ​​en células de alto rendimiento. El CFM utiliza redes de canal 3D para pequeñas muestras de fluido de volumen de ciclo más de los lugares críticos microscópicos en una superficie de 12,13. Al imprimir con flujo, biomoléculas, células, y otros reactivos se mantienen en un medio líquido durante todo el proceso de impresión, lo que permite la impresión de biomoléculas y células sensibles y sin exposición al aire, lo que dificulta las técnicas de impresión celda actual. También es posible imprimir directamente de material en bruto como hibridoma o sobrenadantes cumpliendo con un mecanismo de captura sobre la superficie de la matriz. El objetivo de este manuscrito es explicar en detalle la impresión sumergida de dos tipos de células sobre una superficie.

<table><tbody><tr><td>Microobservador de flujo continuo</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Medios base para células</td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Aditivo de medios celulares (pH de control)</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Aditivo de medios celulares</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Aditivo para medios celulares</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Tinción de células spara recuento</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Cámara de células para contar células</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Se utiliza para comprobar las células</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Se utiliza para recopilar imágenes</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (con calcio y magnesio)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Enjuague de las células antes del paso y antes de la tinción con PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Se utiliza para eliminar células de la superficie</td></tr></tbody></table>

la impresión sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo microspotter

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

La impresión de células para aplicaciones de microarrays presenta importantes desafíos, incluyendo el problema de mantener el fenotipo celular fisiológicamente relevante después de la impresión, una mala organización y distribución de las células deseadas, y la incapacidad de administrar fármacos y/o nutrientes a áreas específicas en el array. Nuestra tecnología de impresión microfluídica 3D es excepcionalmente capaz de sellar e imprimir matrices de celdas en superficies sumergidas de manera automatizada y multiplexada. El diseño de la fluidicidad 3D de la matriz de celdas microfluídicas (MFCA) permite que la punta del cabezal de impresión se baje a un pozo o plato lleno de líquido y se comprima contra una superficie para formar un sello. La punta de silicona suave del cabezal de impresión se comporta como una junta y es capaz de formar un sello reversible aplicando presión o retrocediendo. Otras tecnologías de impresión de células, como las impresoras de pin o de inyección de tinta, no pueden imprimir en aplicaciones sumergidas. La impresión en superficies sumergidas es esencial para mantener los fenotipos de las células y para monitorear estas células en una superficie sin alterar las características de la superficie del material. Al imprimir en superficies sumergidas, se producen micromatrices celulares que permiten el cribado de fármacos y la evaluación de la citotoxicidad en una multitud de áreas, como el cáncer, la diabetes, la inflamación, las infecciones y las enfermedades cardiovasculares.

Las células NIH/3T3 línea celular de fibroblastos se imprimieron o sembradas en una superficie sumergida. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 X 10 4 células por ml. Se sembraron las células usando técnicas de cultivo celular tradicionales. Las células se imprimieron utilizando un gran formato, cabezal de impresión de células de doce flujo donde los canales son más grandes (~ 500 micras) que el CFM utilizado para las proteínas y otras biomoléculas. Las células se sembraron impresos o sobre una su...

Esta tecnología de impresión microfluídica 3D imprime matrices de células en superficies sumergidas. Describimos cómo las matrices de células se entregan microfluídicamente en celdas de flujo 3D sobre superficies sumergidas. Al imprimir en superficies sumergidas, se produjeron microarrays celulares que permiten el cribado de fármacos y la evaluación de la citotoxicidad en una multitud de áreas.

La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

El objetivo general de este procedimiento es imprimir fibroblastos T3 sobre una superficie recubierta con suero. Esto se logra primero mediante la adsorción previa de suero sobre una superficie de cultivo de tejidos. El segundo paso consiste en imprimir una suspensión de fibroblastos sobre la superficie utilizando un microdispensador de flujo continuo, seguido de la incubación de las células a 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, las células impresas, así como las células sembradas mediante cultivo celular estándar, se tiñen con yoduro de propidio y se visualizan bajo un microscopio invertido para su comparación. Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para evaluar la viabilidad, densidad y morfología celular en los puntos de tiempo relevantes. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la impresión por punzón es que la cabeza de impresión forma un sello sobre la superficie, lo que permite imprimir las células sumergidas en medio celular.Aunque la impresión sumergida de células es útil para evaluar nuevos candidatos a fármacos en cuanto a seguridad y eficacia, la impresión sumergida en general también resulta útil para otras aplicaciones. Por ejemplo, podemos analizar nuevos candidatos a fármacos frente a rebanadas de tejido, o podemos utilizarla como modelo para sistemas de órganos. Por ejemplo, un modelo de perfusión hepática.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque durante la preparación de la impresora y la impresión celular, no debe entrar aire en las líneas, ya que podría causar la muerte celular. Comience descongelando células NIH 3T3 durante dos a tres minutos en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius. Suspender nuevamente las células en cinco mililitros de medio completo y centrifugar a 1500 Gs durante tres minutos.Retire el sobrenadante celular sin perturbar el botón celular. Luego, re suspenda las células en cinco mililitros de medio y transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros. A continuación, agregue 10 microlitros de azul de tripano a la suspensión celular y mezcle con la punta de la pipeta; transfiera 10 microlitros de las células teñidas a una cámara de hemocitómetro.Antes de contar las células a 10 x de aumento, cuente las células viables que se asemejan a pequeñas esferas blancas en cuatro de los nueve cuadros grandes. Solo cuente las células viables que no presenten color azul oscuro debido a la tinción con azul de tripano. Calcule el número promedio de células por cuadro grande, lo que resulta en el número de células multiplicado por 10.000 células por mililitro en la suspensión celular original.Luego siembre las células a una densidad de 100.000 células por mililitro con un total de cinco mililitros en cada frasco T25. Cultive las células hasta alcanzar entre un 70 y un 80 % de confluencia antes de comenzar los experimentos. Para preparar la superficie de impresión, utilice un marcador para delinear un rectángulo del tamaño de la cabeza de impresión en la parte inferior de un poliestireno tratado para cultivo de tejidos 12.Pipetee 50 microlitros de suero bovino fetal en el área rectangular de la placa de pocillos y extiéndalos por toda la región. Con la punta, deje la placa de pocillos en una campana de seguridad biológica estéril durante la noche para permitir que la mancha de suero se seque completamente. Para comenzar la impresión sumergida, enjuague la cabeza impresora con agua destilada.Luego, llene un plato de Petri de 60 milímetros con agua destilada y acople la boquilla de impresión sobre la superficie; haga fluir agua destilada a través de cada una de las líneas durante dos minutos a 150 microlitros por minuto utilizando una bomba neumática. A continuación, deseche el agua del plato de Petri y llénelo con agua limpia. Después, mueva la boquilla de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua tres veces.Coloque el cabezal de impresión centrado sobre el punto recubierto con suero en la placa de 12 pocillos previamente preparada. A continuación, prepare el cabezal de impresión con 300 microlitros por canal de medio completo precalentado.Si se realizan múltiples impresiones, agregue un enjuague con lejía además del enjuague con agua entre impresiones. Proceda a imprimir las células en suspensión a una concentración de 50.000 células por mililitro sobre la superficie, y a 60 microlitros por minuto. 100 microlitros por canal.Después de la impresión celular, coloque la boquilla de impresión fijada a la izquierda contra la superficie y el manifold en una incubadora de cultivo celular. Ajuste a 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius durante dos horas. Después de la incubación de dos horas, retire la boquilla de impresión y coloque la tapa sobre el recipiente de cultivo.El momento en que se retira la cabeza de impresión se considera el punto de tiempo cero. A modo de comparación, también se realiza un cultivo celular estándar. Añada un mililitro de medio precalentado a una de las placas de 12 pocillos con suero, luego tome un mililitro de la suspensión celular restante y pipetéelo en un solo pocillo de la placa de 12 pocillos.Esto producirá un cultivo que contiene 50 000 células en la placa. Coloque la placa de cultivo celular en un incubador a 37 grados Celsius durante dos horas. Después de la incubación de dos horas, comience a medir el tiempo para asegurar la consistencia entre las muestras impresas y sembradas.Este se considera el punto de tiempo cero. Después de 0, 2, 24 y 48 horas, prepare las células de cada uno de los dos métodos para su visualización mediante tinción con yoduro de propidio, que solo se incorpora al núcleo de las células muertas. Primero, enjuague suavemente las células tres veces con un mililitro de solución salina tamponada con fosfatos con calcio y magnesio para eliminar cualquier residuo.A continuación, agregue un mililitro de medio de cultivo precalentado a cada recipiente de cultivo y luego un microlitro de yoduro de propidio. Incube la solución stock las células teñidas con yoduro de propidio a 37 grados Celsius durante 10 minutos antes de observar las células mediante un microscopio invertido con aumentos de 10 x y 40 x. Finalmente, deseche las células en un recipiente adecuado para residuos biológicos peligrosos.La línea celular de fibroblastos, las células NIH 3T3, se imprimieron o sembraron sobre una superficie sumergida. Después de la impresión y siembra, las células se visualizaron para evaluar la densidad y la morfología en los puntos temporales relevantes. Las imágenes mostraron que las células presentan fenotipos casi idénticos en cada punto temporal y en cada aumento. Según estos datos, se determinó que la impresión efectiva fue mínima. La viabilidad celular se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio y reveló que la viabilidad de las células impresas no difería significativamente de la de las células adheridas en cada punto temporal. La principal diferencia entre los dos métodos de fijación de las células a la superficie es la densidad de las células.La densidad de células impresas disminuye en más del 50 % en el punto temporal de dos horas, tanto en células sembradas como en células impresas. Se requiere un estudio adicional para determinar la causa de esta disminución. Sin embargo, las proporciones de densidad impresa en general, en comparación con las sembradas, siguen siendo significativamente más altas.La densidad celular impresa en la celda de flujo fue aproximadamente 10 veces mayor en cada punto temporal que la de las células sembradas, considerando que las células se imprimieron con la misma densidad que en el siembra, pero en un área más pequeña. En el punto temporal final, las células presentan la misma densidad, lo cual probablemente se deba a la motilidad celular y a las limitaciones por consumo de recursos. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que investigadores en áreas como el descubrimiento de fármacos estudien los efectos de la toxicidad y eficacia de medicamentos sobre células y enfermedades como el cáncer, enfermedades cardíacas y otros campos de alta demanda.Al utilizar la impresión de células sumergidas en conjunto con otras tecnologías, como la adhesión celular programable, podemos ampliar el alcance de esta técnica hacia células en suspensión para ensayos expandidos de descubrimiento y desarrollo de fármacos. Después de ver este video, debería tener una comprensión sólida de cómo imprimir células utilizando nuestra técnica de impresión sumergida.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Impresión por microcontacto se utiliza ampliamente a las proteínas de patrones y otras moléculas en las superficies de material. Se demuestra los pasos básicos de este proceso, los patrones de estampación de la fibronectina sobre el cristal.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Una descripción de los métodos utilizados para convertir una impresora HP Deskjet 500 en un bioprinter. La impresora es capaz de procesar las células vivas, lo que provoca poros transitorios en la membrana. Estos poros se pueden utilizar para incorporar pequeñas moléculas, incluyendo fluorescente G-actina, en las células impresos.

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Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

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Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

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