Name: Establecimiento de un In Vitro Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Aprende a establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica en rata mediante co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. Este método permite evaluar la integridad de uniones estrechas y mecanismos de transporte para investigar la entrega de fármacos al SNC.

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Apoyo financiero a VECT-HORUS se reconoce desde el Fonds Único Interministerial (FUI proyecto / MEDUL) y para Vect-HORUS y el laboratorio UMR7259 de la Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC y proyectos de colaboración PREVENTAD) . El laboratorio UMR7259 también reconoce el apoyo financiero del CNRS y de la Universidad Aix-Marseille.

1. Producción de rata astrocitos Para cada preparación utilice 10 ratas Wistar recién nacidos de ambos sexos. <ol><li> Sacrificar las ratas cortando cabezas con un par de tijeras y transferirlas de inmediato en un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar. Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y transferirlos inmediatamente en una placa de Petri que contenía tampón de disección en frío: HBSS suplementado con 1% albúmina de suero bovino (BSA bajo nivel de endotoxina), penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> Cortar los cerebros en un medio, para separar los 2 hemisferios cerebrales y transferirlos a una placa de Petri limpia con tampón de disección sobre hielo. Cortar el nervio óptico y eliminar las meninges bajo un microscopio estereoscópico. </li><li> Lavar las piezas corticales extensamente en 50 ml de tampón de disección en frío. </li><li> Coloque los trozos de corteza de 3 cerebros en un tubo Falcon de 15 ml y disociar la pipeta hacia arriba y hacia abajo de un golpele de veces con una pipeta desechable de 10 ml equipado con una punta azul en 6 ml de tripsina 0,05% - EDTA 0,02% durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 24 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y los siguientes antibióticos, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml, un medio llamado medio de células gliales (GCM), y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. Se seleccionaron lotes de FBS y validados para el crecimiento y la supervivencia de cutures de astrocitos. </li><li> Resuspender el sedimento que contenía las células disociadas en 10 ml GCM y la placa en un 75 cm 2 matraz T (T75). Cambie el medio del día siguiente para eliminar los restos celulares y el ADN. Vuelva a colocar los medios de cultivo dos veces por semana. </li><li> Después de 1 semana de la proliferación, agite suavemente las células gliales con un agitador orbital a 60 rpm durante 24 horas a 37 ° C en el GCM. Si el T75 no puede ser colocado en una incubadora con 5% de CO 2/95% de aire a 37 ° C atmósfera humidificada, complementar los medios de comunicación con HEPES 5 mM. Lavar las células dos veces para rquítelo las células microgliales no adherentes. </li><li> Tres semanas después de la siembra, se lavan las células dos veces con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 3 ml de tripsina cálida 0,05%-EDTA 0,02%, se incuba a 37 ° C y espere hasta que la capa de células se dispersa (por lo general 5 min). Inhibir la actividad de la tripsina añadiendo 10 ml de GCM, transferir la suspensión de células en un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 120 xg durante 8 minutos. </li><li> Resuspender el pellet de astrocitos en el 90% de SFB - 10% de DMSO, transferirlos a crioviales (2 x 10 6 células por criovial) y almacenar en nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Aislamiento de cerebro de rata Microvasos Nuestros procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Marsella y se ajustan a las normas nacionales y europeas (directiva de la UE N º 86/609). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. <ol><li> Para cada preparación y para una Experimenter, use de 3 cinco semanas de edad ratas Wistar. </li><li> Lunes de la primera semana, preparar 2 matraces T75 mediante el recubrimiento con colágeno de tipo IV y fibronectina, tanto a 1 g / cm 2 en el agua de cultivo estéril (10 ml por T75). Permitir a adherirse a 37 ° C hasta que la siembra de los microvasos. </li><li> La mañana del miércoles de la primera semana, la eutanasia a las ratas bajo un flujo cada vez mayor de CO 2 para inducir somnolencia, pérdida de la postura y la interrupción de la respiración, a continuación, seguido por una dislocación cervical. Rocíe las cabezas con etanol al 70%. Cortar las cabezas con un par de tijeras y transferirlos a un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar. </li><li> Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y los nervios ópticos, a continuación, transferirlos a una placa de Petri enfriada en hielo y se llena con tampón de disección en frío (HBSS suplementado con 1% de BSA, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml) . </li><li> Cortar los cerebros en medio para separar los 2 hemisferios cerebrales y el cerebro medio separado del deEbrain. Transfiera los prosencéfalos en una placa de Petri limpia en el hielo con tampón de disección. </li><li> Tomar un par de hemisferios en una nueva placa de Petri con tampón de disección fría para quitar cuidadosamente las meninges de los prosencéfalos bajo un microscopio estereoscópico con N ° 5 pinzas curvas. Luego, limpiar el interior del cerebro para eliminar el edredón de la mielina y obtener una cáscara de la corteza. Estos pasos no deben tomar más de 2 horas para la conservación de tejidos y la supervivencia celular. </li><li> Disociar la corteza de 3 cerebros en 6 ml de tampón de disección en frío en un homogeneizador Dounce de 7 ml por 10 golpes arriba y abajo con cada uno de 2 manos de mortero de diferentes autorizaciones, 71 micras seguido de 20 micras. </li><li> Divida la suspensión para obtener el equivalente de 1 corteza en 1 ml de un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Se digiere la suspensión de 1 corteza con 1 ml de una solución enzimática que contiene una mezcla de colagenasas / dispasa (60 g / ml de R11; 0,3 U / ml), Tipo de DNasa I (35 g / ml - 20 K unidades / ml) y gentamicina (50 mg / ml) en un agitador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Mezclar el 1 digest ml de 1 corteza con 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X y separada por centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente el disco superior (mielina y el cerebro parénquima) y el sobrenadante a un tubo Falcon de 50 ml limpio y repetir la centrifugación. Mantenga el sedimento resultante contiene los microvasos cerebrales a 4 ° C. </li><li> Desechar con cuidado el disco superior y el sobrenadante. Resuspender ambos gránulos resultantes que contienen los microvasos cerebrales con 1 ml de HBSS frío 1X y transferir a un tubo Falcon de 50 ml limpio. </li><li> Lavar los microvasos mediante la adición de 20 ml de HBSS frío 1X y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Además digerir los microvasos de 1 corteza con 1 ml de la misma solución enzimática como se describe en el paso 2.9 durante 1 hora a 37 ° C en un SHaker. </li><li> A continuación, mezclar los microvasos digeridos de cada uno de los 3 cortezas en un tubo y separar aún más en dos tubos Falcon de 50 ml para obtener extraídos de microvasos el equivalente de uno y medio (1.5) de la corteza por tubo. Añadir 30 ml de tampón de disección en frío y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el sedimento de microvasos en 10 ml de DMEM/F12 complementado con 20% de plaquetas bovina plasma pobre en suero derivado, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 2 ng / ml), heparina (100 mg / ml), gentamicina (50 mg / ml) y HEPES (2,5 mM), llamado medio celular endotelial (ECM) suplementado con puromicina a 4 g / ml. </li><li> Tome los frascos T75 recubiertos 2 de la incubadora, aspirar el exceso de recubrimiento y placa los microvasos de cada tubo en un frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 corteza por matraz T75). </li></ol> 3. Purificación y proliferación de la Dirección Regional Primocultures <ol><li> Purificación: de miércoles a viernes, añadir puromycin a 4 g / ml a los medios de cultivo. Cambie el medio el jueves. El viernes, se lavan las células y añadir puromicina a 2 mg / ml hasta el lunes. </li><li> Proliferación: el lunes de la segunda semana, se lavan las células y añadir insulina, transferrina y suplemento selenita de sodio al medio de cultivo hasta que los cultivos alcanzan el 90% de confluencia el miércoles de la segunda semana. </li></ol> . 4 Diferenciación: Configurar el modelo in vitro acreditación <ol><li> Lunes de la segunda semana, preparar filtros (polietileno, 12 pozos, de tamaño de poro 1,0 m) por recubrimiento con una mezcla de colágeno tipo IV y fibronectina tanto en 0.5μg/cm 2 en el agua de cultivo estéril (500 l de mezcla en el compartimiento superior y 1,5 ml de agua de cultivo estéril en el compartimiento inferior). Deje que se adhieran a 37 ° C hasta que la Dirección Regional de la siembra. </li><li> Lunes de la segunda semana, cinco días antes de que el establecimiento de la co-cultura, descongele los astrocitos de crioviales a 37 ° C y la transferenciaen un Falcon de 15 ml con 10 ml GCM. Centrifugar la suspensión a 120 xg durante 8 minutos a TA. </li><li> Resuspender el pellet de astrocitos en GCM y la placa a una densidad de 30 x 10 3 células por cm 2 en placas de 12 pocillos. </li><li> Miércoles de la segunda semana, justo antes de la disociación de la Dirección Regional con tripsina, lavar dos veces el filtro pre-recubierto con medio DMEM/F12. Pre-llenar las cámaras con ECM: 1,5 ml en el compartimiento inferior y 0,5 ml en el compartimento superior. </li><li> Miércoles de la segunda semana, lavar dos veces la Dirección Regional con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 4 ml de tripsina cálida 0,05% - EDTA 0,02% de solución a 37 ° C por matraz T75 durante 30 segundos exactamente. Luego quite 3,5 ml de solución de tripsina y observar bajo el microscopio. Cuando la capa de células comienza a separarse de la matriz, ayudar a ellos golpeando suavemente el borde del matraz T75 hasta que todas las células están flotando. </li><li> Añadir 9 ml de ECM por matraz T75 y transferir a un tubo Falcon de 15 ml. Muy disociar suavemente la célulasuspensión pipeteando arriba y abajo 4 veces con una pipeta de 10 ml equipado con una punta amarilla (evitar la producción de burbujas en la solución). Contar las células en la suspensión (aproximadamente 3 x 10 6 cells/T75) y la placa inmediatamente en filtros de pre-revestidos y precargadas a una densidad alta (160 x 10 células de 3 / filtro, por tanto, aproximadamente 18 filters/T75) (Figura 8 ). El día siguiente (jueves), cambie dos veces el medio del compartimiento superior para eliminar los residuos celulares. </li><li> Jueves de la segunda semana, el día antes de la creación del co-cultivo, sustituir el medio de cultivo de astrocitos en 1,5 ml de medio de diferenciación (ECM con hidrocortisona a 500 nm), que se pueden complementar con 1/3 medio del compartimento basal acondicionado de un co-cultivo anterior (3 días de contacto entre las células endoteliales y astrocitos). </li><li> Viernes de la segunda semana se define como el día 0 de la diferenciación; reemplazar el medio de cultivo de la conta filtrosnando la Dirección Regional con medio de diferenciación. Transfiera los filtros DRECEI en los pocillos que contienen los astrocitos. En estas condiciones, los modelos in vitro se diferencian y expresan proteínas relacionadas de unión-plazo de 3 días. </li><li> Los modelos mantienen su diferenciación óptima durante 3 días más, entre el lunes y el miércoles de la tercera semana. </li></ol>

Michel Khrestchatisky es director del laboratorio UMR7259, cofundador y asesor científico de la empresa de biotecnología VECT-HORUS.

Muchos medicamentos desarrollados para el tratamiento de Sistema Nervioso Central (SNC) no son capaces de llegar al parénquima cerebral en concentraciones terapéuticamente relevantes. La acreditación protege el tejido nervioso cerebral de la fluctuación de la composición del plasma, de los agentes patógenos, y mantiene la homeostasis del parénquima cerebral mediante la restricción de flujo no específica de iones, péptidos, proteínas e incluso las células dentro y fuera del cerebro 1. Características de BBB son inducidos y mantenidos por la proximidad íntima y la diafonía entre las células endoteliales de microvasos cerebro clase especializada y elementos vecinos de la unidad de neuro-glia-vascular (NGVU) tales como neuronas, células gliales (más precisamente astrocito END-pies), y pericitos ensheathed en la membrana basal, que se compone principalmente de colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina y proteoglicanos 2,3. Los pericitos cubren aproximadamente el 22 - 32% del endotelio en el nivel capilar y juegan un importantepapel en la regulación de la proliferación endotelial, la angiogénesis y procesos inflamatorios. Las células endoteliales forman una hoja continua que cubre la superficie interior de los capilares. Ellos están interconectados por TJs, que forman una estructura semejante a una correa en la región apical y que contribuyen a la celda de polarización. Los astrocitos regulan de BBB propiedades y son fuentes de factores reguladores importantes tales como el TGF-β, GDNF, bFGF e IL-6. Los astrocitos deficientes en GFAP con funcionalidad incompleta no son capaces de regular de BBB propiedades 4. Las neuronas no están directamente involucrados estructuralmente en la formación de la BBB, pero también regulan aspectos importantes de la expresión de la proteína y BBB funciones 5. Con el fin de estudiar más a fondo la estructura, fisiología y patología de la BBB, los modelos in vitro de la BBB se desarrollaron como herramientas de investigación. Células endoteliales de cerebro se han extraído de diversas especies de implementar en modelos de BBB in vitro basadoen cultivos de paso bajo las primarias de las especies bovina, porcina 6,7 8,9, 10,11,12 rata, ratón 13 y también humanos 14,15. Se sabe que estos modelos a imitar la acreditación in vivo, particularmente cuando se co-cultivaron con células gliales de rata o murino y / o pericitos 16,12, y / o los astrocitos derivados de células progenitoras neurales 17 y / o neuronas 18. Los modelos de laboratorio &quot;en&quot; a menudo se producen a partir de roedores, ya que permiten in vitro / in vivo en experimentos y comparaciones y / o el estudio de las células endoteliales del cerebro producidos a partir de modelos transgénicos 19. De nuevo desarrollo de modelos in vitro BBB también han sido diseñadas para ayudar a predecir la captación cerebral de los posibles candidatos a fármacos del SNC antes de la prueba in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelos in vitro de BBB se utilizan generalmente para comparar el transporte de fármacos con: i) la penetración conocido en el SNC o con lOW permeabilidad a través de la acreditación y no hay efectos centrales, y ii) la aparente Pe de los mismos medicamentos medidos en modelos animales de la misma especie. Los fármacos que pasan fácilmente la acreditación son en su mayoría lipófilo y cruzan las membranas celulares endoteliales del cerebro por mediada por lípidos difusión libre (cafeína, carbamazepina, etc.) Los medicamentos transportados negativamente, tal como digoxina, verapamilo o la ciclosporina A se extruyen de forma activa por transportadores de salida endoteliales del cerebro tales como la P-gp. Sin embargo, muchas de las moléculas terapéuticas de nuevo desarrollo son productos biofarmacéuticos, tales como proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales o siRNAs. La mayoría de ellos no cruzan la BBB debido a: i) la ausencia de transportadores específicos, y ii) la capa apretada de las células endoteliales, que impiden que las moléculas de alto peso molecular a partir de someterse a paso paracelular. Con estos límites, las estrategias de &quot;caballo de Troya&quot; han sido implementados utilizando vectores (anticuerpos, péptidos) contra los receptores conocidos en el BBB, involucrados in mediada por el receptor de transporte o transcitosis (RMT), tales como la transferrina (Tf) del receptor (TfR), el receptor de insulina (IR), o miembros de la del receptor de LDL (LDLR) relacionados con la familia del receptor (LDLR, LRP1). Tales receptores se han encontrado en aislados capilares del cerebro y en la acreditación in vivo 24,25. Los perfiles de transcripción para estos receptores, en particular los de la familia LDLR, se analizaron y se compararon entre las células endoteliales cerebrales y células endoteliales de cerebro co-cultivadas con astrocitos o en los capilares cerebrales directamente después de su extracción a partir de cerebro 26. Pardridge 24 abrió el campo con el anticuerpo OX-26 contra el receptor de transferrina (TfR), seguido por anticuerpos contra el receptor de la insulina y el receptor del factor de crecimiento de insulina 27,28. Con estos vectores basados ​​en anticuerpos, ArmaGen Technologies ha desarrollado una tecnología de plataforma Trojan horse molecular acreditación para entregar las drogas, incluyendo las proteínas, a través de la acreditación 29. Lala literatura es rica en datos que muestran la expresión de LRP1 en las células endoteliales del cerebro y su papel como receptor endocítica / carroñero potente. Análisis de transferencia Western sugirió que LRP1 se expresa en fracciones enriquecidas en los capilares del cerebro y en las células endoteliales capilares de cerebro de rata 30. Empresas como Angiochem LRP1 objetivo con vectores de péptidos derivados de la aprotinina que promueven la afluencia de drogas eficientes a través de la acreditación 31. Sin embargo, LRP1 también está involucrado en el transporte activo de Aß y su flujo de salida / autorización de parénquima cerebral a la sangre 32. Estos datos implican LRP1 en un transporte bidireccional través de la BBB en función de sus ligandos. biOasis desarrolla la tecnología de Transcend usando un melanotransferrina proteína para el transporte de productos biológicos, tales como enzimas lisosomales y anticuerpos través de la bbb 33 mientras VECT-HORUS desarrolla vectores de péptidos que se dirigen a la LDLR 34. No se sugiere que los datos de la PRL y LDLR se pueden utilizar para el transporte de difErent moléculas tales como enzimas lisosomales 35,36 o complejos de nanopartículas través de la bbb 37. Nuestro campo de interés es la administración de fármacos para el SNC usando moléculas de vector y vectorizadas de drogas-candidatos para el tratamiento de enfermedades del SNC. En particular, la administración de fármacos a través de la acreditación tiene que ser considerado en el contexto de la neuroinflamación, un proceso que puede variar en su extensión, pero que es probablemente común a todas las lesiones y enfermedades del SNC, incluyendo la encefalitis, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, etc neuroinflamación se asocia con la acreditación inflamación y potencialmente con los cambios en la fisiología de la acreditación y la permeabilidad paracelular y teniendo en cuenta que el transporte transcelular se pueden amplificar en condiciones patológicas 38,39,40,41,42,43. Por ejemplo, el TNF-α, ajustar, y otras citoquinas modulan la inflamación, y los experimentos con modelos in vitro en BHE han demostrado que pueden alterar las propiedades paracelulares de the monocapa de células endoteliales 38,39,40 y que el TNF-α también conduce a un aumento en el transporte transcelular de las LDL 41, holotransferrin 42 y lactoferrina 43. Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar un optimizado y singénico de rata altamente reproducible acreditación modelo utilizando co-cultivos de células endoteliales cerebrales primarios y astrocitos. Utilizamos 5 semanas de edad y neonatales de ratas Wistar para la producción de las células endoteliales del cerebro y la producción de astrocitos, respectivamente. Un desafío fue establecer un protocolo que permite la producción de modelos BBB &quot;semanal reproducibles&quot;. Para alcanzar este objetivo, se llevó a cabo todos los pasos del protocolo de producción en días fijos de la semana, a partir de la producción de los microvasos cerebro el miércoles de la primera semana. Las disecciones se realizaron casi todas las semanas en los últimos 3 años. Para mejorar aún más la reproducibilidad de las culturas, se estableció un sistema de aseguramiento de la calidad. Todo reagents y productos químicos fueron referenciados en una base de datos (fecha de entrada, existencias, plazo de caducidad, etc.) El modelo se caracteriza después de un número de criterios, tales como la organización de las células endoteliales y la pureza, la TEER, LY permeabilidad, respuesta a agentes pro-inflamatorias, la expresión cualitativa y cuantitativa de las proteínas TJ, la funcionalidad de los transportadores de flujo de salida, tales como la P-gp, y receptores involucrado en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales tales como el TfR o el LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA fracción V baja endotoxina</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>Matraces T75</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV ratón (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg; C / 1 mes</td></tr><tr><td>Fibronectina humain plasma (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg; C / 1 mes</td></tr><tr><td>Tijeras de muelle Vannas, rectas (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, rectas (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, ancho de punta 0,8 mm</td><td>Pinzas</td> de Graefe <td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe, ancho de punta curva 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de colagenasas / dispasas (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg; C / 3 meses</td></tr><tr><td>DNasa I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero bovino a partir de plasma pobre en plaquetas (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg; C/ 1 año</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg; C / 6 meses</td></tr><tr><td>Heparina Sal Na de mucosa porcina Grado I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg; C/1 año</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C/ 6 meses</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>Inserto de celda colgante de polietileno para placas de 12 pocillos</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosidad: 1 y micro; m Superficie: 1,1 cm2</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1 año</td></tr><tr><td>Ratón anti-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clon TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Conejo anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Ratón anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Ratón anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clon V9, (58 &micro; g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Ratón anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Conejo anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Conejo anti-Ocludina&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 anticuerpos secundarios conjugados</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sal de dilitio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>TNF-alfa humano</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>Rata MCP-1 Kit ELISA</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg; C/-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ratón anti-P-glicoproteína</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clon C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fijación PFA 4% 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Conejo anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1.000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Clorhidrato de verapamilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Receptor de macroglobulina monoclonal anti-a2 (CD91, LRP1) contra la cadena b del aminoácido 4291-4344 dentro de una repetición de EGF</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro; g/ml)</td><td>1/5 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Ratón anti-LDLR</td><td>R& Sistemas D</td><td>AF2255 (200 &micro; g/ml)</td><td>1/50 - fijación PFA 4%</td></tr><tr><td>Transferencia de ratas-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg; C</td></tr></tbody></table>

establecimiento de un<em&gt; in vitro</em&gt; modelo de rata barrera hematoencefálica (bbb): un enfoque en la acreditación impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

La barrera hematoencefálica (BBB) ​​regula específicamente flujo molecular y celular entre la sangre y el tejido nervioso. Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar una singénico de rata altamente reproducible modelo in vitro de la BBB usando co-cultivos de células endoteliales de cerebro de rata primarios (DRECEI) y astrocitos para estudiar los receptores implicados en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales. Los astrocitos fueron aislados por disección mecánica después de la digestión con tripsina y se congelaron durante el co-cultivo posterior. DRECEI se aislaron a partir de cortezas de rata 5 semanas de edad. Los cerebros se limpiaron de meninges y la sustancia blanca, y se disociaron mecánicamente después de la digestión enzimática. A partir de entonces, el homogeneizado de tejido se centrifugó en albúmina de suero bovino para separar fragmentos de vasijas a partir de tejido nervioso. Los fragmentos de vasijas fueron sometidos a una segunda digestión enzimática de las células endoteliales gratuitas de su matriz extracelular. Las células contaminantes restantes, tales como pericitos fueron fás eliminado mediante siembra de los fragmentos de microvasos en medio que contenía puromicina. Luego se pasaron sobre filtros de co-cultivo con astrocitos cultivados en el fondo de los pocillos. DRECEI expresa altos niveles de unión estrecha (TJ) proteínas tales como ocludina, claudina-5 y ZO-1 con una localización típica en los bordes de la celda. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de las monocapas endoteliales del cerebro, lo que indica la estanqueidad de TJs alcanzó 300 ohmios · cm 2 en promedio. Los coeficientes de permeabilidad endotelial (PE) para lucifer amarillo (LY) fue altamente reproducible con una media de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Las células endoteliales del cerebro organizados en monocapas expresaron la eflujo transportador de la P-glicoproteína (P-gp), mostraron un transporte polarizado de rodamina 123, un ligando de la P-gp, y mostraron el transporte específico de transferrina-Cy3 y DiILDL través de la monocapa de células endoteliales. En conclusión, le ofrecemos un protocolo para la creación de un in vitroAcreditación modelo que es altamente reproducible debido a los métodos de control de calidad, y que sea adecuado para la investigación sobre de BBB transportadores y receptores.

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo in vitro altamente reproducible de la barrera hematoencefálica de rata. Esto se logra eliminando los nervios ópticos, el cerebelo y las meninges bajo un microscopio estereoscópico, luego separando los dos hemisferios cerebrales y diseccionándolos para obtener un fragmento limpio de corteza. El segundo paso consiste en aislar los microvasos sanguíneos de la corteza mediante tratamiento enzimático y centrifugación dependiente de la densidad.A continuación, se siembran los microvasos y se incuban con puromicina para purificar las células endoteliales eliminando células contaminantes como parásitos. Los cultivos puros de células endoteliales de cerebro proliferan hasta que las células alcanzan una confluencia del 90 %. El paso final consiste en inducir la diferenciación de las células endoteliales cerebrales de rata colocando las células en la cámara superior de los filtros de inserto y cultivándolas en co-cultivo con astrocitos de rata que han sido previamente preparados y sembrados.Finalmente, la monocapa de células endoteliales cerebrales diferenciadas puede caracterizarse mediante la expresión de proteínas específicas de uniones estrechas y mediante el índice de permeabilidad de un compuesto de referencia a través de la monocapa de células endoteliales desde el compartimento superior. Los modelos in vitro de la BHE, como el aquí presentado, son útiles para explorar la distribución celular de moléculas clave y para desentrañar los mecanismos celulares y moleculares básicos del funcionamiento de la BHE. En particular, tales modelos permiten explorar los receptores de la BHE y su participación en el tráfico de endocitosis y transcitosis en nuestras manos.Los modelos in vitro de la BHE se utilizan principalmente para investigar el direccionamiento de receptores específicos mediante vectores peptídicos que desarrollamos. Para facilitar la administración de fármacos al SNC a través de la BHE, utilizamos un proceso denominado transcitosis mediada por receptores, también conocido como el enfoque del caballo de Troya. La descripción visual es fundamental, ya que las personas nuevas en este método requerirán habilidad en disección y un microscopio para actuar con suficiente rapidez y precisión durante el proceso de producción celular, a fin de mantener la supervivencia del tejido.Otro punto crítico es finalizar de forma prematura la zona frágil y la región del salmón tele para evitar la apertura de barreras durante los experimentos. Finalmente, esta idea mostrará detalles a lo largo del protocolo que marcarán la diferencia entre protocolos rojos y visualizados, demostrando que el procedimiento será realizado por mí y mi colega. Comience este procedimiento recubriendo dos frascos T75 con colágeno tipo cuatro y fibronectina a una concentración de un microgramo por centímetro cuadrado en agua estéril para cultivo, y déjelos adherir en el incubador a 37 grados Celsius hasta la siembra de microvasos.Dos días después, retire el cerebro del cráneo de tres ratas Vista de cinco semanas de edad y transfiera los cerebros a una placa de Petri con tampón de disección frío colocada sobre hielo. Diseque los cerebros sin el cerebelo ni los nervios ópticos. Luego, corte cada cerebro por la mitad para separar los dos hemisferios cerebrales bajo el microscopio estereoscópico.Realice otro corte para eliminar el mesencéfalo y transfiera los cuatro cerebros a una placa de Petri limpia sobre hielo con tampón de disección. Luego, transfiera un prosencéfalo a una nueva placa de Petri llena con tampón de disección frío. Sujételo con una pinza y desprenda cuidadosamente las meninges de los bordes del prosencéfalo.Posteriormente, gire el prosencéfalo y retire cuidadosamente las meninges sin romperlas. Asegúrese de que el prosencéfalo quede libre de meninges y corte la parte restante de los nervios ópticos. El objetivo de este paso es eliminar la capa de sustancia blanca para obtener una envoltura de corteza.Comience sujetando el prosencéfalo por el borde y luego arrastre cuidadosamente la pinza a lo largo de la superficie, teniendo cuidado de no romper la superficie de la corteza. A continuación, asegúrese de que el cerebro esté libre de meninges girándolo para verificar que no queden meninges residuales ni grandes vasos superficiales. A continuación, a partir de la extracción de los tres cerebros de su cráneo, el tiempo total para la disección no debe superar las dos horas para preservar el tejido y la supervivencia celular.Transfiera las cortezas de tres cerebros a seis mililitros de tampón de disección frío en un homogenizador tipo Dounce de siete mililitros y posteriormente disocie las cortezas con 10 movimientos ascendentes y descendentes utilizando el primer pistilo con mayor holgura, seguidos de 10 movimientos ascendentes y descendentes con el segundo pistilo de menor holgura. Luego, transfiera seis mililitros de la suspensión a un nuevo tubo cónico Falcon de 50 mililitros y lave el homogenizador Dounce con 24 mililitros de tampón de disección frío. Divida la suspensión en tres tubos Falcon para obtener el equivalente de una corteza por tubo. Posteriormente, centrifugue a 1000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.La observación del precipitado muestra un gradiente de color rosa, que representa la parte de microvasos de las cortezas. Deseche ahora el sobrenadante y homogenice el precipitado de una corteza con un mililitro de solución enzimática que contiene una mezcla de colagenasas dyse, ADN tipo uno y gentamicina. Coloque los tubos en un agitador durante 30 minutos a 37 grados Celsius.Luego, mezcle un mililitro del digestivo con 10 mililitros de BSA-HBSS al 25% una X, y vortexe suavemente los tubos; posteriormente, sepárelos mediante centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 Gs durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación dependiente de la densidad, el precipitado contiene los microvasos y el disco superior contiene la mielina, el parénquima cerebral y los microvasos residuales. Transfiera cuidadosamente el disco superior y el sobrenadante a tubos cónicos limpios de 50 mililitros.Tenga cuidado de no aspirar el pellet de microvasos; vortexe suavemente el tubo y repita la centrifugación dependiente de densidad durante la segunda centrifugación. Mantenga el pellet resultante que contiene los microvasos a cuatro grados Celsius. Después de la segunda centrifugación dependiente de densidad, deseche cuidadosamente el disco superior y la mezcla de sobrenadante, y resuspenda los pellets resultantes que contienen los microvasos provenientes de ambas centrifugaciones con un mililitro de HBSS frío uno x.A continuación, lave los microvasos con 20 mililitros de HBSS frío una vez y centrifugue a 1000 G durante cinco minutos. Luego deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder los microvasos. Homogenice el sedimento de microvasos procedente de una corteza con un mililitro de la misma solución enzimática, agitando suavemente los tubos en vórtex.Digiera aún más los microvasos durante una hora a 37 grados Celsius en un agitador. Después, mezcle los microvasos digeridos de las tres cortezas en un solo tubo. Nuevamente, separe la mezcla en dos tubos cónicos de 50 mililitros para obtener los microvasos extraídos del equivalente de una corteza y media por tubo.Luego, centrifugue a 1000 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente y justo antes de sembrar los microvasos, tome dos frascos T75 recubiertos del incubador y aspire el exceso de recubrimiento. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento de microvasos en un mililitro de ECM; complete cada tubo hasta 10 mililitros con ECM suplementado con cuatro microgramos por mililitro.Purificar micina para iniciar el proceso de purificación y sembrar los microvasos en el matraz. Luego, colocar los matraces en el incubador a 37 grados Celsius y 5 %CO₂ para permitir la adhesión de los microvasos a la matriz de colágeno-fibronectina y continuar con el proceso de purificación. Veinticuatro horas después del sembrado de los microvasos, lavar los restos celulares con ECM fresco y reemplazar el medio de cultivo con ECM suplementado con cuatro microgramos por mililitro de purimicina hasta el día cinco en el incubador a 37 grados Celsius y 5 %CO₂. Veinticuatro horas después del sembrado, las células endoteliales comienzan a migrar y extenderse sobre la matriz de colágeno-fibronectina. Al día cinco, para finalizar el proceso de purificación, lavar los restos celulares con ECM fresco y reemplazar el medio de cultivo con ECM suplementado con dos microgramos por mililitro.Puramycin durante tres días más para la proliferación. En el día ocho, lave las células y agregue insulina, transferrina y selenito de sodio. Suplemente el medio de cultivo hasta que los cultivos alcancen una confluencia del 90 % el día 10.El día ocho, prepare los filtros de tres placas de 12 pocillos recubriéndolos con una mezcla de colágeno tipo cuatro y fibronectina, ambos a 0,5 microgramos por centímetro cuadrado en agua estéril para cultivo. Comience agregando 1,5 mililitros de agua estéril para cultivo en el compartimento inferior.Luego, agregue 0,5 mililitros de la mezcla en el compartimento superior. Permita que la matriz se adhiera a 37 grados Celsius hasta la siembra de las células endoteliales el mismo día, cinco días antes del establecimiento del cultivo conjunto. Derrita los astrocitos provenientes de los viales de criopreservación a 37 grados Celsius y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros con 10 mililitros de medio de cultivo para gliocitos (GCM) y centrifugue.La suspensión a 120 G durante ocho minutos a temperatura ambiente. Luego, re-suspender el precipitado de astrocitos en GCM y sembrar a una densidad de 30.000 células por centímetro cuadrado. En las placas de 12 pocillos, colocar las placas de 12 pocillos en el incubador a 37 grados Celsius, 5 %CO2 el día 10 justo antes de la disociación de RBEC con tripsina.Lave el filtro pre-codificado con medio DMM F 12, rellene previamente las cámaras con ECM y devuélvalas al incubador hasta el momento del revestimiento con RBEC el mismo día. Lave las RBEC dos veces con DPBS sin calcio ni magnesio. Añada cuatro mililitros de solución tibia de tripsina-EDTA por matraz T 75 a 37 grados Celsius durante exactamente 30 segundos y retire 3,5 mililitros de la solución de tripsina-EDTA.Asegurándose de que siempre haya una capa de tripsina-EDTA cubriendo las células endoteliales. Luego, siga la desprendimiento de las células mediante observación bajo el microscopio. Cuando la capa celular comience a separarse de la matriz, golpee suavemente el borde del matraz T 75 hasta que todas las células estén flotando.Agregue tres mililitros de ECM a cada frasco T 75 y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. Repita este paso dos veces, enjuagando con medio para recuperar todas las células.Disociar muy suavemente la suspensión celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo cuatro veces con una pipeta de 10 mililitros equipada con una punta amarilla. Contar las células en la suspensión e inmediatamente sembrarlas al día siguiente en los filtros pre-codificados y previamente llenados a alta densidad. Cambiar el medio del compartimento superior dos veces para eliminar los restos celulares y así evitar la interrupción de la monocapa celular durante el reemplazo del medio.Incline ligeramente la placa y no acerque nunca la pipeta de aspiración demasiado, dejando siempre algo de medio sobre la monocapa celular, de forma similar a como se evita el secado de la monocapa celular durante el reemplazo del medio. Lave solo seis insertos a la vez. Veinticuatro horas después de la siembra, la monocapa celular debe estar en confluencia.Luego, el mismo día, un día antes del establecimiento del cultivo en co-cultivo, sustituya el medio de cultivo de los astrocitos por 1,5 mililitros de medio de diferenciación suplementado en el día 12, que se define como el primer día de diferenciación. Sustituya el medio de cultivo de los filtros que contienen las RBEC por medio de diferenciación. Posteriormente, transfiera los filtros de RBEC a los pocillos que contienen los astrocitos en estas condiciones.Los modelos in vitro diferencian y expresan proteínas relacionadas con uniones en tres días, y la diferenciación óptima dura tres días más. Aquí, la monocapa celular se inmunotincionó con mentona para revelar una monocapa de células endoteliales cerebrales confluente con morfología no solapada y células típicas con forma de huso con morfología endotelial, así como la expresión de proteínas de uniones estrechas denominadas zonula occludens-1 y ocludina. La integridad de la monocapa en el modelo de BBB se evaluó midiendo el transporte de amarillo de luciferina.Los resultados se expresan en permeabilidad o PE en 10 elevado a menos tres centímetros por minuto, y se considera que la barrera es permeable o abierta cuando el PE del LY es superior a 0,6 veces 10 a la menos tres centímetros por minuto. En las últimas décadas, muchas publicaciones y revisiones han proporcionado información sobre modelos estáticos y dinámicos in vitro de la BHE de diferentes especies. Sin embargo, dichos modelos siguen siendo difíciles de manejar y la reproducibilidad de la calidad de la barrera sigue siendo un objetivo fundamental.Después de ver este video, los científicos deberían tener una buena comprensión de cómo producir y caracterizar un modelo in vitro de la BHE.

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Este video describe un ensayo de permeabilidad para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica in vitro utilizando moléculas de fluoresceína de sodio.

Ensayo de permeabilidad de la barrera hematoencefálica: un ensayo in vitro para evaluar la permeabilidad del imitado de la barrera hematoencefálica a las moléculas trazadoras

Este video muestra un método para estudiar la permeabilidad a través de un modelo de barrera hematoencefálica (BBB) in vitro utilizando astrocitos y células endoteliales en un inserto de membrana, con FITC libre y ferritina cargada con FITC. La FITC-ferritina se unió a los receptores de las células endoteliales y cruzó la barrera de la membrana hacia la cámara inferior, mientras que la FITC libre mostró una permeabilidad restringida y permaneció en la cámara superior.

Estudio de la permeabilidad de FITC y FITC-ferritina a través de un modelo de barrera hematoencefálica in vitro

Se describe y valida un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica basado en un cocultivo de células endoteliales microvasculares y astrocitos con cerebro de rata. Este sistema demostró ser una herramienta válida para estudiar el efecto de la nanoformulación en la permeabilidad transbarrera de moléculas fluorescentes.

In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.

Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata

Este protocolo describe un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica humana (BHE). Las células endoteliales y los pericitos se siembran a cada lado de un filtro de inserción (compartimento sanguíneo), y los astrocitos se siembran en el pozo inferior (compartimento cerebral). El modelo caracterizado se utilizó para experimentos de transporte de nanopartículas.

Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

Aprende a establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica en rata mediante co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. Este método permite evaluar la integridad de uniones estrechas y mecanismos de transporte para investigar la entrega de fármacos al SNC.

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