Name: Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprende a analizar imágenes de microscopía de fluorescencia de forma rápida utilizando la plataforma PhenoRipper. Este método automatizado identifica perfiles fenotípicos y reduce significativamente el tiempo de análisis en comparación con métodos tradicionales.

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Damos las gracias a Adam Coster y todos los demás miembros de los laboratorios Altschuler y Wu para la retroalimentación útil y discusiones. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01 GM085442 y CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) y la Fundación Welch I-1619 (SJA) y I-1644 (LFW).

1. Muestras Preparación y Imaging <ol><li> Cultivo celular <ol><li> Dividir culturas rutinaria y mantener al 20-70% de confluencia. Un día antes del experimento, crecer células HeLa en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, véase la Tabla de Materiales) y suplementado con 10% de FBS (suero bovino fetal) y 1x penicilina / estreptomicina. </li><li> En el día de experimento, las células de división cada vez mayor en la cultura (alrededor del 50% de confluencia). </li><li> Lavar las células con PBS (tampón fosfato salino), exponerlo a aproximadamente 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) durante unos segundos. Aspirar el exceso de tripsina / EDTA y mantener las células bañadas en una fina película de tripsina / EDTA en la campana a temperatura ambiente durante ~ 3 min. </li><li> Mecánicamente matraces de agitación dos veces y separar las células con medio de suero suplementado. Contar las células y se diluye hasta 5000 células/50 l de los medios de comunicación y la placa de inmediato 50 l / pocillo en una placa de fondo de cristal de 384 pocillos usando un robot de manejo de líquidos automatizado (sólo 30, asís de la placa se utilizan aquí). </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min para minimizar los efectos de borde en pozos 5. Después de la incubación RT, coloque las placas de un ° C / 5% de CO 2 incubadora a 37 durante la noche. </li><li> Cada fármaco se ensayó por duplicado. Añadir 25 l de fármaco a los pocillos correspondientes en la placa ya que contiene los medios de comunicación. </li><li> Fijar la placa con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS a 24 h después de tratamiento contra las drogas. </li></ol></li><li> La tinción Los anticuerpos específicos primaria, secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados aquí se listan en la Tabla de Materiales. <ol><li> Permeabilizar fijo células con 0,2% Triton X-100 solución en TBS (Tris-buffer salina) durante 3 minutos, y lavar con TBST (Tris-buffer salino + Tween 20) 3x. Añadir BSA (albúmina de suero bovino) solución al 5% en TBST para el bloqueo. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 horas y después lavar con TBST 3x. </li><li> Hacer DILUT anticuerpo primarioiones en 5% de BSA en TBST (véase la Tabla de Materiales) y añadir 10 l / pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se lava 3 veces con TBST. </li><li> Hacer dilutionin anticuerpo secundario 5% de BSA en TBST (véase la Tabla de Materiales) y añadir 10 l / pocillo. </li><li> Incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas y después se lava dos veces con TBST. </li><li> Preparar diluciones para Hoechst y phalloidin (véase la Tabla de Materiales) en PBS y añadir 10 l / pocillo. </li><li> Incubar la placa en la oscuridad durante 30 min a TA. </li><li> Después de 2 lavados TBST, placas de cubierta en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Adquirir imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia utilizando un objetivo de 20X con cámara 1x1 hurgar en la basura. Adquirir dieciséis imágenes para cada pozo, para un total de 480 imágenes (canales x3). </li></ol> 2. Análisis de Imágenes Descargue e instale PhenoRipper de phenoripper.org, y lanzar PhenoRipper para comenzar el análisis de imaGes. PhenoRipper actualmente soporta TIFF, PNG y JPEG y el resto de los formatos soportados por MATLAB (software microscopio normalmente ayudas a la exportación a TIFF). 2.1 Carga de Datos <ol><li> No existe una convención de nombres / organización estándar para imágenes de microscopía, que pueden hacer la carga de imágenes y metadatos asociar (es decir anotación experimental como el tipo de tratamiento, así el número y así sucesivamente), la parte más difícil del flujo de trabajo. Elija uno de los métodos presentados (que se describe más adelante). <ol><li> PhenoLoader: Elija esta opción para semiautomática cargar datos cuando el nombre de archivo y / o estructura de directorio contienen información suficiente para agrupar imágenes como desee (por ejemplo, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png podría indicar que la imagen es del bien B16, las células se tratan con el fármaco cuyo identificador es 5, y la imagen captura la mancha DAPI nuclear - con esta convención de nomenclatura, todas las imágenes de pocillo A1 o tratados con drogas 5 podrían agruparse fácilmente). El asistenteguiar al usuario paso a paso para asociar los metadatos con grupos de imágenes y definir los marcadores de la siguiente manera: <ol><li> Haga clic en &quot;Estructura de archivos&quot; para acceder a la ventana PhenoLoader. </li><li> Haga clic en &quot;Definir Directorio raíz&quot; para seleccionar el directorio que contiene el conjunto de datos de imágenes. Luego filtrar los archivos que no se usan (los archivos no utilizados) para el análisis (opcional, se puede dejar vacío). </li><li> Haga clic en &quot;Definir marcadores&quot; para especificar los biomarcadores utilizados en el experimento y asociarlos con las imágenes. En concreto, haga clic en un archivo de imagen y seleccione una parte del nombre de archivo que identifica de manera única los biomarcadores. Por último, introduzca un nombre para cada biomarcador. </li><li> Haga clic en &quot;Definir Metadatos&quot; para asociar la información con cada imagen. En concreto, haga clic en un archivo de imagen y, a continuación, seleccione una parte del nombre del archivo la información de identificación de imagen (por ejemplo, &quot;B16&quot; para el nombre también). Una ventana solicitando un nombre de grupo (por ejemplo, &quot;Nosotrosll &quot;) se abrirá, escriba un nombre. Los miembros del grupo extraído del nombre del archivo se mostrará en la tabla del grupo (por ejemplo, la lista completa de los nombres también). Para agregar información adicional que no se presente en el nombre del archivo, haga clic en el&quot; (opcional) Siguiente &quot;. Haga clic en&quot; Agregar metadatos de grupo &quot;, introduzca el nombre del grupo adicional (por ejemplo,&quot; Medicamentos &quot;) y para cada valor del grupo predefinido (por ejemplo,&quot; Bueno &quot;), introduzca su valor (por ejemplo,&quot; taxol &quot;) . No hay límite para el número de grupos adicionales que se pueden agregar. </li><li> Por último, haga clic en &quot;Crear MetaDataFile&quot; para generar el archivo de metadatos y continuar con el análisis. Si un archivo de metadatos se ha generado con anterioridad, los pasos anteriores se pueden evitar mediante la carga directamente el archivo utilizando la opción &quot;Metadatos Archivo&quot; (descrito en 3 abajo). </li></ol></li><li> Plantillas de expresiones regulares Basada: Las expresiones regulares son un método estándar para hacer coincidir los patronesen el texto. Elija esta opción cuando el nombre de archivo y / o estructura de directorio contienen información suficiente para agrupar imágenes y la convención de nombres coincide con una de las plantillas pre-existentes. Las plantillas personalizadas basadas en expresiones regulares también se pueden definir y reutilizar de forma manual. Esta opción avanzada sólo se recomienda para usuarios familiarizados con las expresiones regulares. </li><li> Metadatos Archivo: Elija esta opción para personalización final. Definir y cargar un archivo de valores separados por comas (CSV) que contiene los nombres de archivo y los metadatos asociados a cada imagen. Un ejemplo del formato de archivo está disponible en la parte de descarga del sitio web (phenoripper.org). Sólo tiene que cargar el archivo a través de la interfaz para mostrar la información que contiene. </li></ol></li><li> Seleccione el campo de metadatos que definen las repeticiones en el experimento para evitar el muestreo redundante. Para los conjuntos de datos que contienen repeticiones (por ejemplo, todas las imágenes en un pozo deben ser similares), que las agrupa (por ejemplo, también) puede imprrendimiento ove. En la mayoría de los casos es razonable elegir la opción predeterminada &quot;Random (no sé)&quot;, que selecciona un subconjunto aleatorio. </li></ol> 2.2 Establecer parámetros de análisis Haga clic en &quot;Ajustar parámetros&quot; para definir los parámetros necesarios para procesar el conjunto de datos. Los parámetros a definir son en el panel de la izquierda. El panel derecho muestra una muestra de la fusión del conjunto de datos. Haga clic en las flechas izquierda / derecha para cambiar entre las diferentes imágenes. <ol><li> Intensidad Umbral: Elija un valor umbral adecuado para identificar más o menos las porciones celulares (en lugar de los antecedentes, las regiones no celulares) de imágenes. Un umbral se calculan previamente por PhenoRipper, pero se puede ajustar para mejorar el resaltado de las regiones celulares usando la barra de desplazamiento disponibles en la parte superior de la imagen. Si un umbral elegido no funciona a través de todas las imágenes, reducir el umbral a fin de incluir regiones no celular en lugar de dejar caer regiones celulares. </li><li> Bloque Size: Elija un tamaño de bloque apropiado (en píxeles) de la rejilla de la imagen. Los bloques de tamaño especificado se superponen a la imagen. Ajustar el tamaño de bloque para obtener un promedio de 20 a 30 bloques / célula. Para superponer la cuadrícula sobre la imagen, haga clic sobre la casilla de verificación situada delante del campo &quot;Tamaño de bloque&quot;. </li><li> Parámetros opcionales: Si las imágenes en escala de automóviles no se muestran los marcadores con intensidades relativas deseadas (por ejemplo, un color es saturada) o si los marcadores necesitan ser eliminado del análisis, utilice la opción &quot;Ajuste de Intensidad de canales&quot;. Para identificar las regiones celulares en un subconjunto de los marcadores utilizar los &quot;canales utilizados para Umbral&quot; opción. Opciones por defecto de los demás parámetros son generalmente adecuados, pero si es necesario, ajustar usando el menú &quot;Opciones avanzadas de análisis&quot;. </li><li> Ejecute el análisis pulsando &quot;PhenoRip&quot; en el panel principal de la aplicación. PhenoRipper identificará automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes. Perfiles fenotípicos serán generados porcada imagen basado en las fracciones de los diferentes tipos de bloques en el mismo. </li></ol> 3. Exploración de Resultados <ol><li> Explora las relaciones entre los perfiles fenotípicos de las imágenes utilizando el PhenoBrowser (Figura 1). La interfaz PhenoBrowser consiste en cuatro paneles: el panel superior izquierdo es una representación gráfica (gráfico de dispersión) de la relativa similitud entre las diferentes imágenes / condiciones, los dos paneles en las imágenes de muestra pantalla derecha de enfermedades específicas, y el panel final (gráfico de barras ) compara sus perfiles fenotípicos. </li><li> &quot;Descartar Marcos Vacíos&quot; utilizando el menú &quot;Procesamiento de datos&quot;. </li><li> Eliminar imágenes de mala calidad: En primer lugar, estudiar las imágenes individuales desactivar el agrupamiento en el menú &quot;Procesamiento de datos&quot;. A continuación, haga clic a través de los puntos atípicos en el gráfico de dispersión y deseche las imágenes de baja calidad (por ejemplo, fuera de foco, artefacto tinción). </li><li> Explora los datos: Decidir los metadatos que define el terrenouna unidad básica de comparación (por ejemplo, para comparar las drogas, las imágenes con el mismo valor del campo de metadatos &quot;drogas&quot; deben ser agrupados juntos). Contraer todas las imágenes con el mismo valor de este campo de metadatos en un solo punto de datos con &quot;Agrupar por&quot;. Por ejemplo, la agrupación por la droga tendrá un promedio de las imágenes dentro de cada medicamento para producir un punto por drogas. Puntos cercanos (o lejanos) en el gráfico de dispersión reflejan las condiciones que provocan fenotipos celulares similares (o diferentes). Puntos de colores o etiquetas (menú de visualización de datos) basado en metadatos disponibles para ayudar interpretabilidad. La parcela en 3D se puede girar haciendo clic en la casilla de verificación &quot;rotativo&quot; y haciendo clic en el botón izquierdo y arrastrando el ratón sobre él. </li><li> Seleccione dos puntos diferentes para compararlos directamente. Los paneles de imágenes se mostrarán imágenes de muestra para cada punto, y el panel gráfico de barras mostrará los tipos de bloques cuyas frecuencias ocurrencia son más diferentes entre los dos puntos. </li><li> Inicie la clustergram en el menú &quot;Clustergram&quot; para ofrecer una visión más global de la relación entre los tipos de bloques y las condiciones experimentales. Al agrupar los dos tipos y condiciones de bloques, esta representación se destacan los fenotipos celulares que mejor distinguen a grupos de condiciones (Figura 5). </li></ol>

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<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
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<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El flujo de trabajo aquí descrito permite la caracterización y comparación de imágenes de microscopía fácil y rápido. En primer lugar, demostramos cómo este flujo de trabajo puede ayudar a la optimización de experimento, por ejemplo mediante la realización de controles de calidad de forma rápida en las imágenes de microscopía. A continuación, se demostró su potencial para el análisis de los datos de detección de alto rendimiento: hemos sido capaces de drogas del grupo en función de su mecanismo de acción. La agrupación ...

Durante la última década, los rápidos avances en la tecnología de imágenes han dado muchos laboratorios la capacidad de realizar la microscopía de alto rendimiento. Ahora, el reto se ha desplazado de una de las imágenes a una de análisis. ¿Cómo podemos caracterizar, comparar y explorar el torrente de complejos fenotipos aún sutiles generadas por una típica pantalla de proyección de imagen de alto rendimiento? Una serie de análisis de imagen e informática plataformas han dado los usuarios cajas de herramientas sofisticadas 1-3 para la extracción de información biológica de las grandes colecciones de imágenes. Sin embargo, muchos obstáculos persisten importantes en el análisis de los datos de las pantallas basadas en imágenes de alto rendimiento. Las dificultades involucradas con la elección de las caracterizaciones adecuadas de las imágenes y el ajuste fino de los parámetros algorítmicos (para el sistema de interés) a menudo resultan en largos tiempos de preparación, especialmente para los usuarios sin conocimientos de análisis de imagen. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales en unimagen n, es un cuello de botella importante en este sentido. La segmentación puede ser altamente sensible a los parámetros experimentales tales como el tipo de células, la densidad celular y bio-marcadores, y con frecuencia requiere ajuste repite para un gran conjunto de datos. Por estas razones, el análisis de imágenes es a menudo un paso independiente, el terminal realizada por especialistas en lugar de una parte integrada del flujo de trabajo experimental. Esto excluye el ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, una parte crucial del desarrollo del ensayo. Aquí se describe un flujo de trabajo alternativo que está optimizado para microscopía de fluorescencia de alto rendimiento y evita muchos de los problemas antes mencionados. Para ello, hacemos uso de PhenoRipper 4, una plataforma de software de código abierto para la exploración y el análisis de imágenes de microscopía rápido. Significativamente, PhenoRipper evita muchos de los desafíos que implica la segmentación celular por no tratar de identificar células individuales. En lugar de ello, PhenoRipper divide las imágenes en píxelesbloques de tamaño subcelular y caracteriza las imágenes en función de los bloques que contienen. Específicamente, PhenoRipper Perfiles de bloques, en términos de funciones de marcador que-a base de colocalización y automáticamente identifica 4 los tipos de bloques más representativos de las imágenes de entrenamiento. PhenoRipper continuación, asigna a cada bloque del tipo de bloque representante más similar, y, finalmente, caracteriza a las imágenes basadas en los tipos de los bloques que contienen. En comparación con los métodos más tradicionales sencillos basados ​​en células, este enfoque requiere sintonía fina mínima y experiencia. Como tal, los usuarios sólo tienen que configurar dos parámetros: el tamaño de bloque y una intensidad umbral (para descartar porciones no celulares de una imagen), ambos de los cuales se establece con información gráfica. Es importante destacar que el flujo de trabajo descrito aquí se ha mostrado 4 de escalar fácilmente a conjuntos de datos mucho más grandes, donde la velocidad y la puesta a punto mínima proporciona gran tiempo y las ganancias de fiabilidad. En la práctica, nos encontramos con que esta aplicacióncucaracha reduce el tiempo necesario tanto para la instalación y funcionamiento de múltiples órdenes de magnitud 4. La salida primaria de PhenoRipper es una representación visual de la imagen de similitud, que permite al usuario para identificar grupos de condiciones experimentales que causan que las células muestran fenotipos similares. Las agrupaciones PhenoRipper encuentra típicamente tienen &quot;interpretabilidad biológica&quot; comparables a los generados por, métodos basados ​​en células que consumen más tiempo 4. En la práctica, esto significa que, a menudo, en menos de media hora de la realización de una típica de 96 pocillos experimento microscopía de fluorescencia, un experimentador sin experiencia de análisis de imagen previa se puede obtener una lectura fiable sobre el rendimiento de su experimento. El experimentador puede entonces comenzar a explorar las relaciones entre las diferentes condiciones experimentales y relacionar estas relaciones con los fenotipos de imagen. Demostramos este flujo de trabajo aquí mediante el análisis de los efectosde medicamentos en clases mecanicistas distintos sobre células HeLa teñidas para marcadores de ADN y del citoesqueleto. Imágenes de las células tratadas con la misma clase de fármacos se agruparon, y las imágenes de mala calidad (artefactos de tinción, de las células de enfoque y así sucesivamente) aparecieron como los valores extremos, haciendo que sean fáciles de identificar y potencialmente descartar. Mientras que este flujo de trabajo es útil para un gran número de ensayos basados ​​en imágenes, está claro que hay muchas situaciones en las que un enfoque diferente podría ser potencialmente más informativo. Por ejemplo, la salida de PhenoRipper es principalmente una comparación relativa de patrones de fluorescencia a través de condiciones experimentales. Si se requiere una caracterización absoluta de un rasgo de células única específica en lugar (por ejemplo, el número de motas en una célula), se requeriría un análisis único-basado en células. Sin embargo, incluso en este tipo de situación, es probable PhenoRipper para detectar cambios en estos fenotipos de una sola célula y por lo tanto ser una herramienta útil para el ensayo de Optimización.

<table><tbody><tr><td>DMEM, Alto contenido de glucosa</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td> Alto contenido de glucosa, marcador <td>de L-glutamina</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>Tinción de ADN, dilución 1:2.000 de 5 mg/ml de caldo de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Marcador faloidina-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Falotoxina conjugada, dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario &alfa;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primario Ab, ratón monoclonal, dilución 1:200</td></tr><tr><td>Secundario Antivody anti-Ratón TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Ab secundario conjugado, 0,5 mg en 1 ml PBS + 1 ml glicerol</td></tr><tr><td>Concentración de aldosterona</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de apicidina</td><td></td><td></td><td>utilizada: 20 &mu; M Concentración</td></tr><tr>de<td>colchicina</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,16 &mu; M Concentración</td></tr><tr>de<td>cortisol</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de dexametasona</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,2 &mu; Concentración de</td></tr><tr><td>docetaxel</td><td></td><td></td><td>M utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>concentración utilizada: 20 &mu; M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>concentración utilizada: 5 &mu; M Concentración</td></tr><tr>de<td>nocodazol</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,3 &mu; M Concentración</td></tr><tr>de<td>prednisolona</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>concentración utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de Scriptaid</td><td></td><td></td><td>utilizada: 70 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de taxol</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,3 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de tricomatina A</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,2 &mu; M</td></tr><tr><td>Concentración de vinorelbina</td><td></td><td></td><td>utilizada: 0,3 &mu; M</td></tr></tbody></table>

análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de imágenes

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

A pesar de los rápidos avances en microscopía de alto rendimiento, los ensayos basados ​​en imágenes cuantitativos siguen planteando retos importantes. Aunque una variedad de herramientas especializadas de análisis de imagen están disponibles, la mayoría de los flujos de trabajo basados ​​en análisis de imágenes tradicionales tienen empinadas curvas de aprendizaje (para el ajuste fino de los parámetros de análisis) y dan lugar a tiempos de respuesta largos entre las imágenes y el análisis. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales de una imagen, es un cuello de botella importante en este sentido. Aquí presentamos un suplente,-segmentación libre de células de flujo de trabajo basado en PhenoRipper, una plataforma de software de código abierto diseñado para el rápido análisis y exploración de imágenes de microscopía. El oleoducto que aquí se presenta está optimizado para imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de cultivos celulares y requiere mínima intervención del usuario. Al cabo de media hora, PhenoRipper puede analizar los datos de un experimento típico de 96 pocillos y generar perfiles de imagen. Los usuarios puedenluego explorar visualmente sus datos, lleve a cabo el control de calidad en su experimento, garantizar una respuesta a las perturbaciones y comprobar la reproducibilidad de repeticiones. Esto facilita un ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, que es crucial durante la optimización de ensayo. Este protocolo es útil no sólo como un análisis de primer paso para el control de la calidad, pero también puede ser utilizado como una solución de extremo a extremo, especialmente para el cribado. El flujo de trabajo descrito aquí se escala para grandes conjuntos de datos, tales como los generados por las pantallas de alto rendimiento, y se ha demostrado al grupo de condiciones experimentales por fenotipo con precisión en una amplia gama de sistemas biológicos. La interfaz PhenoBrowser proporciona un marco intuitiva de explorar el espacio fenotípico y relacionar propiedades de imagen en las anotaciones biológicas. En conjunto, el protocolo descrito aquí bajará las barreras para la adopción de un análisis cuantitativo de las pantallas de imagen basados.

Aquí hemos probado la capacidad de este flujo de trabajo para los medicamentos del grupo en función de su mecanismo de acción. Células HeLa fueron sembradas en 30 pocillos de una placa de 384 pocillos y se tiñeron para ADN / actina / α-tubulina. Los anticuerpos específicos primarios, anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales. Wells fueron tratados con 15 medicamentos que pertenecen a tres clases mecanicistas (inhibición d...

Aquí se describe un flujo de trabajo para el análisis rápido y colecciones de imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando PhenoRipper, una plataforma de análisis de imagen recientemente desarrollado explorar.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una plataforma de análisis de imágenes para analizar y explorar rápidamente imágenes de microscopía fluorescente. Esto se logra primero sembrando células en una placa, agregando perturbaciones a cada pocillo e incubando la placa. Luego se adquieren imágenes mediante un microscopio de fluorescencia automatizado, y las imágenes se cargan semiautomáticamente en la plataforma de análisis de imágenes pheno ripper utilizando la herramienta pheno loader.Después de establecer los parámetros de análisis, pheno ripper identifica automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes y genera perfiles fenotípicos para cada imagen, que pueden explorarse utilizando el pheno browser. En última instancia, el gramograma final muestra las relaciones entre diferentes condiciones y características de las imágenes, lo que permite comparar fenotipos complejos pero sutiles generados por la pantalla de imágenes de alto rendimiento. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes que requieren la identificación automatizada de células individuales es que es mucho más rápida y fácil de usar.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como cómo diferentes fármacos afectan los procesos celulares. Este procedimiento comienza con el cultivo celular y la fijación de células según se describe en el protocolo de tinción del texto; tiña las células fijadas utilizando anticuerpos primarios específicos, anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos y otras tinciones fluorescentes que se pueden encontrar en el protocolo de tinción del texto. Después de la tinción celular, adquiera imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia epiescopia.En este ejemplo, utilizamos una magnificación de 20x con una cámara uno por uno Benning. Adquirimos 16 imágenes para cada pocillo, para un total de 480 imágenes. Para analizar las imágenes, primero descargue e instale pheno ripper desde pheno ripper.org e inicie pheno ripper. Para comenzar el análisis de imágenes y cargar de forma semiautomática las imágenes y los metadatos asociados, haga clic en estructura de archivos para acceder al cargador de fenotipos (pheno loader). Seleccione el directorio que contiene el conjunto de datos de imágenes y especifique la extensión de archivo de las imágenes si es necesario.Filtre los archivos que no se utilizan para el análisis. Haga clic en definir marcadores para especificar los biomarcadores utilizados en el experimento y asociarlos con las imágenes. En particular, haga clic en un archivo de imagen y luego seleccione una porción de la ruta del archivo que identifique de forma única a los biomarcadores.Finalmente, ingrese un nombre para cada biomarcador. El siguiente paso consiste en hacer clic en definir metadatos. Para asociar información con cada imagen, haga clic en un archivo de imagen y luego seleccione una parte de la ruta del archivo que identifique la información de la imagen.Aparecerá una ventana que solicitará un nombre de grupo. Ingrese un nombre. Los miembros del grupo extraídos del nombre del archivo se mostrarán en la tabla de grupos.Esta información puede utilizarse durante la visualización de los resultados del análisis. Para agregar información adicional no presente en el nombre del archivo, haga clic en el botón de agregar información adicional, luego seleccione Agregar grupo de metadatos e ingrese el nombre del grupo adicional. A continuación, ingrese cada valor para el grupo predefinido; no hay límite en el número de grupos adicionales que pueden agregarse.Finalmente, haga clic en crear archivo de metadatos para generar una anotación legible por pheno ripper de los datos; seleccione el campo de metadatos que define los réplicas en el experimento para evitar muestreos redundantes. Para un conjunto de datos que contiene réplicas, agruparlas conjuntamente puede mejorar el rendimiento. A continuación, haga clic en establecer parámetros para definir los parámetros necesarios para procesar el conjunto de datos.Los parámetros a definir se encuentran en el panel izquierdo. El panel derecho muestra los resultados. Ejemplo del conjunto de datos.Haga clic en la flecha izquierda o derecha para cambiar entre diferentes imágenes y elegir un valor de umbral apropiado para identificar aproximadamente las porciones celulares de las imágenes. Un umbral es precalculado por pheno ripper, pero puede ajustarse para mejorar el resaltado de las regiones celulares utilizando la barra de desplazamiento disponible en la parte superior de la imagen.Si un umbral elegido no funciona en todas las imágenes, reduzca el umbral para incluir regiones no celulares en lugar de excluir regiones celulares. A continuación, elija un tamaño de bloque adecuado medido en píxeles para subdividir la imagen en una cuadrícula de bloques. Ajuste el tamaño del bloque para obtener un promedio de 20 a 30 bloques por célula y superponer la cuadrícula sobre la imagen.Haga clic en la casilla de verificación delante del campo de tamaño de bloque. Si las imágenes con escala automática no muestran marcadores con las intensidades relativas deseadas o si es necesario eliminar marcadores del análisis, utilice la opción de ajustar la intensidad del canal para identificar regiones celulares en un subconjunto de marcadores. Seleccione los canales utilizados para la opción predeterminada de umbral.Las opciones de otros parámetros suelen ser adecuadas, pero si es necesario, ajústelos. Usando las opciones de análisis avanzado, ejecute el análisis presionando pheno rip en el panel principal de la aplicación. Pheno ripper identificará automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes.Se generarán perfiles fenotípicos para cada imagen en función de las fracciones de los diferentes tipos de bloques presentes en ella. Explore las relaciones entre los perfiles fenotípicos de las imágenes utilizando el navegador de fenotipos. La interfaz del navegador de fenotipos consta de cuatro paneles.El panel superior izquierdo es una representación gráfica de la similitud relativa entre diferentes imágenes y condiciones experimentales. Los dos paneles de la derecha muestran imágenes de ejemplo de las condiciones seleccionadas. El panel final compara los perfiles fenotípicos de las condiciones seleccionadas. Primero, desactive la agrupación en el menú de procesamiento de datos para examinar las imágenes individuales. A continuación, haga clic en los puntos atípicos del diagrama de dispersión y descarte las imágenes de baja calidad. Decida qué campo de metadatos define una unidad básica de comparación.Por ejemplo, para comparar fármacos, agrupe juntas las imágenes con el mismo valor del campo de metadatos fármaco. Cada punto representa ahora un fármaco individual utilizando el menú de visualización de datos; coloree o etiquete los puntos según los metadatos disponibles para facilitar la interpretación. La distancia entre los puntos refleja la similitud fenotípica relativa de las condiciones experimentales correspondientes.Los puntos más cercanos indican mayor similitud. El gráfico tridimensional es rotatable seleccionando la casilla de rotación. Arrastre el ratón sobre el gráfico manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón.Seleccione dos puntos diferentes para compararlos directamente. Los paneles de imagen mostrarán ejemplos de imágenes para cada uno, y el panel del gráfico de barras mostrará los tipos de bloques que mejor distinguen a los dos puntos. Inicie el cluster gram desde el menú de cluster gram para obtener una vista más global de la relación entre los tipos de bloques y las condiciones experimentales, agrupando tanto los tipos de bloques como las condiciones.Esta representación resalta los fenotipos celulares que mejor distinguen grupos de condiciones. Se utilizó Pheno ripper para analizar células HeLa teñidas fluorescentemente para ADN, Actina y alfa tubulina, e imágenes obtenidas tras el tratamiento con histona desacetilasa, fármacos que inhiben el microtúbulo y que dañan el ADN. El umbral del primer plano de estas imágenes se estableció en un 5 % y el tamaño del bloque en 20 píxeles. El análisis de este conjunto de datos tomó aproximadamente 10 minutos en un ordenador de escritorio estándar.Se utilizó la interfaz del navegador pheno para explorar los resultados. Las similitudes fenotípicas relativas entre las imágenes se visualizan mediante escalado multidimensional. Cada punto representa una sola imagen, coloreada según el mecanismo de acción del fármaco correspondiente.Este gráfico muestra que los perfiles fenotípicos pueden utilizarse para agrupar fármacos según su mecanismo de acción. Los artefactos de imagen, como la tinción de poros y los cuadros vacíos, fueron fáciles de identificar ya que se destacaban claramente como valores atípicos. Un dendrograma de los datos relaciona este agrupamiento con los perfiles fenotípicos aquí presentados.Cada fila representa un fármaco individual y cada columna un tipo de bloque. Los valores de escala de grises reflejan los perfiles fenotípicos. Un valor más claro indica una fracción mayor de ese tipo de bloque; el agrupamiento jerárquico separa en gran medida los diferentes fármacos según su clase. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfilado IRA. Esto ayudará a responder preguntas adicionales, como cómo diferentes genes afectan rutas similares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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