Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una plataforma de análisis de imágenes para analizar y explorar rápidamente imágenes de microscopía fluorescente. Esto se logra primero sembrando células en una placa, agregando perturbaciones a cada pocillo e incubando la placa. A continuación, las imágenes se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia automatizado, y las imágenes se cargan semiautomáticamente en la plataforma de análisis de imágenes del extractor de fenotipos utilizando la herramienta de carga de fenotipos.

Después de establecer los parámetros de análisis, el extractor de fenotipos identifica automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes y genera perfiles fenotípicos para cada imagen que se pueden explorar con el navegador de fenotipos. En última instancia, el gramo final del grupo muestra las relaciones entre diferentes condiciones y características de la imagen, lo que permite la comparación de fenotipos complejos pero sutiles generados por la pantalla de imágenes de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes que requieren la identificación automatizada de células individuales es que es mucho más rápida y fácil de usar.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como cómo afectan los diferentes fármacos a los procesos celulares. Este procedimiento comienza con el cultivo celular y la fijación celular como se describe en el protocolo de texto: tiñe las células fijadas utilizando los anticuerpos primarios específicos, los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia y otras tinciones fluorescentes que se pueden encontrar en el protocolo de texto. Después de la tinción celular, adquiera imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia.

En este ejemplo, usamos un aumento de 20x con una cámara uno por uno. Benning. Adquirimos 16 imágenes para cada pozo para un total de 480 imágenes. Para analizar imágenes, primero, descargue e instale pheno ripper de pheno ripper.

org y lanzar Pheno Ripper. Para comenzar el análisis de imágenes para cargar semiautomáticamente imágenes y metadatos asociados, haga clic en Estructura de archivos para acceder al cargador de fenotipos en el cargador de fenotipos. Seleccione el directorio que contiene el conjunto de datos de la imagen y especifique la extensión de archivo de las imágenes si es necesario.

Filtre los archivos que no se utilizan para el análisis. Haga clic en definir marcadores para especificar los biomarcadores utilizados en el experimento y asociarlos con las imágenes. En concreto, haga clic en un archivo de imagen y, a continuación, seleccione una parte de la ruta del archivo que identifique de forma única los biomarcadores.

Por último, introduzca un nombre para cada biomarcador. El siguiente paso es hacer clic en definir metadatos. Para asociar información con cada imagen, haga clic en un archivo de imagen y, a continuación, seleccione una parte de la ruta del archivo que identifique la información de la imagen.

Aparecerá una ventana que solicitará el nombre de un grupo. Introduzca un nombre. Los miembros del grupo extraídos del nombre del archivo se mostrarán en la tabla del grupo.

Esta información se puede utilizar durante la visualización de los resultados del análisis. Para agregar información adicional que no está presente en el nombre del archivo, haga clic en el botón Agregar información adicional, luego seleccione Agregar grupo de metadatos e ingrese el nombre del grupo adicional. Seguido de cada valor para el grupo predefinido, no hay límite para el número de grupos adicionales que se pueden agregar.

Finalmente, haga clic en crear archivo de metadatos para generar una anotación legible por pheno ripper de los datos, seleccione el campo de metadatos que define las réplicas en el experimento para evitar el muestreo redundante. En el caso de un conjunto de datos que contiene réplicas, agruparlas puede mejorar el rendimiento. A continuación, haga clic en establecer parámetros para definir los parámetros necesarios para procesar el conjunto de datos.

Los parámetros a definir se encuentran en el panel izquierdo. Aparecen las pantallas del panel derecho. Muestra del conjunto de datos.

Haga clic a la izquierda o a la derecha. Las flechas para cambiar entre diferentes imágenes son elegir un valor de umbral apropiado para identificar aproximadamente las partes celulares de las imágenes. Un umbral es precalculado por el extractor de fenotipos, pero se puede ajustar para mejorar el resaltado de las regiones celulares utilizando la barra de desplazamiento disponible en la parte superior de la imagen.

Si un umbral elegido no funciona en todas las imágenes, reduzca el umbral para incluir regiones no celulares en lugar de eliminar regiones celulares. A continuación, elija un tamaño de bloque adecuado medido en píxeles para subdividir la imagen en una cuadrícula de bloques. Ajuste el tamaño del bloque para obtener un promedio de 20 a 30 bloques por celda para superponer la cuadrícula sobre la imagen.

Haga clic en la casilla de verificación frente al campo de tamaño de bloque. Si las imágenes escaladas automáticamente no muestran marcadores con las intensidades relativas deseadas o si es necesario eliminar marcadores del análisis, utilice la opción ajustar intensidad de canal para identificar regiones celulares en un subconjunto de marcadores. Seleccione los canales utilizados para el valor predeterminado de la opción de umbral.

La elección de otros parámetros suele ser adecuada, pero si es necesario, ajústelos. Usando las opciones de análisis avanzadas, ejecute el análisis presionando pheno rip en el panel principal de la aplicación. El extractor de fenotipos identificará automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes.

Se generarán perfiles fenotípicos para cada imagen en función de las fracciones de los diferentes tipos de bloques que contiene. Explore las relaciones entre los perfiles fenotípicos de las imágenes utilizando el explorador de fenotipos. La interfaz del navegador pheno consta de cuatro paneles.

El panel superior izquierdo es una representación gráfica de la similitud relativa entre diferentes imágenes y condiciones experimentales. Los dos paneles de la derecha muestran imágenes de muestra de las condiciones seleccionadas. El panel final compara los perfiles fenotípicos de las condiciones seleccionadas.

En primer lugar, desactive la agrupación en el menú de procesamiento de datos para examinar imágenes individuales. A continuación, haga clic en los puntos atípicos en el diagrama de dispersión y descarte las imágenes de baja calidad. Decida qué campo de metadatos define una unidad básica de comparación.

Por ejemplo, para comparar medicamentos, agrupe imágenes con el mismo valor del campo de metadatos fármaco. Cada punto ahora representa un solo medicamento utilizando el menú de visualización de datos, el color o los puntos de la etiqueta en función de los metadatos disponibles para ayudar a la interpretabilidad. La distancia entre puntos refleja la similitud fenotípica relativa de las condiciones experimentales correspondientes.

Los puntos más cercanos sugieren más similitud. El trazado tridimensional se puede rotar seleccionando la casilla de verificación giratoria. Arrastre el ratón sobre el gráfico mientras mantiene pulsado el botón izquierdo del ratón.

Selecciona dos puntos diferentes para compararlos directamente. Los paneles de imagen mostrarán imágenes de muestra para cada uno y el panel de gráfico de barras mostrará los tipos de bloques que mejor distinguen los dos puntos. Inicie el cluster gram desde el menú cluster gram para proporcionar una vista más global de la relación entre los tipos de bloques y las condiciones experimentales agrupando los tipos de bloques y las condiciones.

Esta representación pone de relieve los fenotipos celulares que mejor distinguen los grupos de afecciones. El Pheno ripper se utilizó para analizar células hela que se tiñeron con fluorescencia para ADN Acton y alfa tubulina y se obtuvieron imágenes después del tratamiento con histona desacetilasa, inhibiendo la orientación de los microtúbulos y los fármacos que dañan el ADN. El umbral de primer plano de estas imágenes se estableció en 5% y el tamaño de bloque en 20 píxeles, el análisis de este conjunto de datos tomó aproximadamente 10 minutos en una computadora de escritorio estándar.

Se utilizó la interfaz del navegador fenotipo para explorar los resultados. Las similitudes fenotípicas relativas entre las imágenes se visualizan mediante el escalado multidimensional. Cada punto representa una sola imagen coloreada por el mecanismo de acción de su fármaco.

Este gráfico muestra que los perfiles fenotípicos se pueden utilizar para agrupar los fármacos por su mecanismo de acción. Los artefactos de imagen, como la tinción de poros y los fotogramas vacíos, fueron fáciles de identificar, ya que se destacaron como valores atípicos claros. Un gramo de grupo de los datos relaciona esta agrupación con los perfiles fenotípicos aquí.

Cada fila representa un solo medicamento y cada columna un tipo de bloque. Los valores de la escala de grises reflejan los perfiles fenotípicos. Un valor más claro indica una fracción más alta de ese tipo de bloque, la agrupación jerárquica separa en gran medida los diferentes medicamentos por clase de medicamento.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la elaboración de perfiles de IRA. Esto ayudará a responder preguntas adicionales, como cómo los diferentes genes afectan a vías similares.