Name: Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a activar y medir la actividad del inflamasoma NLRP3 en células dendríticas humanas mediante la detección de IL-1β. Este método utiliza R848 y nigericina para evaluar la respuesta inmunitaria.

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Los autores desean agradecer a Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., y Meagan O&#39;Brien, MD por su apoyo y comentarios. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y completado con fondos del NIH subvenciones Ruth L. Kirschstein Premios Nacionales del Servicio de Investigación para individuales becas predoctorales (F31) para promover la diversidad en la Investigación en Salud, (AI089030) y SR1 (AI081848 ).

Declaración de Ética: se obtienen y se almacenan para la investigación con el consentimiento de los donantes de muestras de investigación. Todas las muestras deben ser codificadas o anónimos antes de su uso. Este protocolo sigue las directrices de nuestra Junta de Revisión Institucional. 1. La diferenciación de los monocitos de sangre periférica humana en células dendríticas derivadas de monocitos. Nota: capas leucocitarias humanas sirven como la fuente de las células de sangre periférica humana (PBMC) y se obtuvieron del Centro de Sangre de Nueva York (Nueva York, Nueva York). Los donantes de sangre son voluntarios sanos. El procedimiento de 5 días comienza con el forro de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en matraces de cultivo de tejidos 35,36. Diferencias notables de los protocolos publicados son los siguientes: <ol><li> Utilice 225 cm 2 frascos de cultivo de tejidos de poliestireno no pirogénicos con una tapa de filtro para adherir un total de 2x10 8 PBMCs por frasco en lugar de 10 cm de poliestireno placa de cultivo de tejidoss (58 cm 2) (paso 1). </li><li> Preparar los medios de comunicación con 5% de suero humano combinado (PHS; 30 ml) en 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampón 5 ml de HEPES 1 M, y 1,4 ml de 50 mg / ml de gentamicina (5% de PHS medios de comunicación) seguido por filtración a través un filtro de 20 mM. Añade un total de frasco de cultivo de 50 ml 5% PHS medios por 225 cm2 de tejido. </li><li> Lavar las células adheridas tres veces con 25 ml de RPMI-1640. Agitar enérgicamente durante 5 segundos durante cada lavado y aspirar las células no adherentes (paso 4). </li><li> Añadir 190 l de 400 UI / mu l de IL-4 y 380 l de 100 UI / l de GM-CSF por matraz (etapa 3) en el día 0, 2, y 4. Día 0 se define como el día PBMC se siembran inicialmente en el paso 1 (Paso 8). </li><li> Día de la Cosecha 5 moDCs a una concentración de 1x10 6 células / ml (paso 15). </li><li> Utilice moDCs inmediatamente en su estado de reposo. Pasos 17-22 nunca se llevan a cabo. Nota: Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resultados. </li><li> MoDCs alícuotas a una concentraciónción de 2x10 5 células / pocillo (200 l / pocillo de la 1x10 6 células / ml) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (western blot, ELISA, FACS) o sobre una chamberslide poli-L-lisina tratado (microscopía) para la experimentación . Nota: Hay por lo menos 4 condiciones: Completamente sin estimular (control negativo), el cebado sólo, sólo la activación, y cebado seguido de activación. Las condiciones pueden ser expandidos para incluir controles de diluyente para R848 y nigericina si se desea. Si el ensayo es aguas abajo del ICS, los duplicados son necesarios para los controles de isotipo. </li></ol> . 2 Cebado inflamasoma - Señal 1 <ol><li> Reconstituir liofilizado R848 en DMSO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640. </li><li> Añadir R848 a una concentración final 10 mM a los pocillos durante 18 horas apropiarse. Coloque las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3 Activar la NLRP3 inflamasoma -. Señal2 <ol><li> Reconstituir nigericina liofilizado en etanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir solución de trabajo a TA con RPMI-1640 antes de añadir a las condiciones apropiadas. </li><li> Añadir nigericina a una concentración final 20 mM y volver a la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 6 horas. No hay etapas de lavado se producen entre el cebado y durante la activación. Nota: la secreción de IL-1β se incrementa por la presencia de ionóforos de calcio, brefeldina clorofenilhidrazona A, monensina, dinitrofenol, o cianuro de carbonilo 37, 38. Por lo tanto, la adición de estos inhibidores de secreción no son recomendables cuando se analiza el cebado o actividad inflamasoma ya que altera la secreción de IL-1β. </li></ol> 4. IL-1ß Sample Collection <ol><li> Centrifugar la placa con las células y los sobrenadantes a 974 xg durante 3 min. </li><li> Sin alterar el sedimento celular, aspirar el sobrenadante y transferir a comoSeparadas fondo redondo de placa con el fin de medir la secreción de citoquinas de los sobrenadantes. Nota: Los sobrenadantes se pueden almacenar temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Lavar los pellets celulares tres veces con 200 l de 1x PBS a 974 xg durante 3 minutos para eliminar cualquier extracelular de IL-1β de las muestras celulares. Nota: Al lavar los sedimentos celulares de una placa de 96 pocillos, eliminar el lavado de placa por inversión rápida en una bandeja de recogida con el fin de no perturbar la muestra. </li></ol> 5. Medición de IL-1ß a partir de muestras celulares y el sobrenadante <ol><li> Intracelular de citoquinas tinción (ICS): El protocolo ICS se describe a continuación 39, 40. Nota: no suspender las células si el análisis de aguas abajo es la baciloscopia. Todos los lavados y aspiraciones deben hacerse sin alterar la capa de células / pellet (dependiendo del ensayo aguas abajo). <ol><li> Añadir 100 l de 5% de PHS medios en los pozos apropiados. Añadirvolumen apropiado (aproximadamente 1 μl/2x10 5 células, o 1 l / pocillo) de la etiqueta fluorescente α-CD11c y α-CD14 (marcadores de fenotipo; clon B-Ly6 y MφP9, respectivamente) o control de isotipo a las células durante 10 min a RT en la oscuridad. </li><li> Lavar tres veces con 1x PBS a 974 xg durante 3 min. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 100 l de PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Pausa Point: Lavar con 100 l de PBS 1x a 974 g durante 3 min y se almacena a 4 ° CO / N en 1 × PBS. </li><li> Añadir 100 l de tampón de permeabilización a las células durante 30 min. Nota: tampón de permeabilización se compone de 1x PBS con 0,3% de Triton X-100, y 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante la permeabilización. No moleste a las células adherentes al ensayo de aguas abajo es la baciloscopia. </li><li> Añadir el volumen adecuado (células de aproximadamente 62 ng antibody/2x10 5, aproximadamente el 2,5 l / pocillo) de α-IL-1β-FITC (clon 8516) o control de isotipo para2 horas en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar las células tres veces con 200 l de tampón de permeabilización a 974 xg durante 3 minutos en la oscuridad. </li><li> Opcional: Mancha con DAPI, añadir medio de montaje, y colocar cubreobjetos suavemente en la parte superior de un portaobjetos de vidrio. Permitir medio de montaje para curar O / N antes de la captura de imágenes de microscopía. </li><li> Adquirir los datos por FACS o microscopía. Nota: Comparar el isotipo para cada condición de la tinción adecuada al analizar por FACS o microscopía. <ol><li> FAC: Adquirir una muestra a la vez. Establezca el / puerta SSC FSC en las células vivas, seguidas por gating en CD11c + CD14 - células antes de analizar la tinción pro-IL-1β población moDC. </li><li> Microscopía: Ajuste el tiempo de exposición utilizando la muestra positiva tinción - R848 tratada. Utilice DAPI + pro-IL-1β + y DAPI + pro-IL-1β - para determinar el porcentaje de pro-IL-1β + moDCs expresan. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Página: inmunotransferencia se realiza para detectar pro-IL-1β. Nota: La técnica descrita a continuación combina técnica estándar inmunotransferencia, gradiente de gel de poliacrilamida 4-20%, y la detección fluorescente o quimioluminiscente 41, 42. <ol><li> Lisar células directamente en 10 l de tampón de lisis de desnaturalización (5 l β-mercaptoethanol/950 tampón de muestra de Laemmli l seguido por dilución de 1:01 con tampón de lisis celular). Se transfiere el lisado a 1,5 ml de tubos de Eppendorf. </li><li> Lisado de calor en una placa seca durante 10 minutos a 100 ° C. </li><li> Girar lisado a 20.800 xg en un minicentrifuge durante 1 min para concentrar el volumen de líquido. Punto Pausa: las muestras pueden ser congeladas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li><li> Cargue el volumen total en el gel de poliacrilamida. Ejecutar 140 V a través de la caja de gel de aproximadamente 1 hora, o hasta que el frente del colorante se sale de la parte inferior del gel. </li><li> Transferencia de la proteína desde el gel de poliacrilamida sobre un membr de PVDF Immobilon-FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear la membrana con 5% de BSA en solución salina tamponada de Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h. Nota: PVDF Immobilon-FL es el mejor para su uso con detección fluorescente. Se recomienda una membrana con una composición diferente para otras técnicas de detección para aumentar la relación señal a fondo. </li><li> Diluir anticuerpos primarios y secundarios en 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar las incubaciones de anticuerpos primarios a 4 ° CO / N mientras se agita y anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora mientras se agita. </li><li> Lavar la membrana 3 veces con TBS-T durante 5 minutos mientras se agita entre incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios y de nuevo entre incubaciones secundarias y de formación de imágenes. Nota: Las bandas se pueden detectar usando fluorescente o detección quimioluminiscente. Siga las instrucciones del fabricante para la detección. </li></ol></li><li> ELISA: Las muestras que se congelan para su almacenamiento es necesario que se equilibre a temperatura ambiente antes del análisis. Centrifugar las muestras en una centrífuga para consolidar de condensación de sobrenadanteación. Siga las instrucciones del fabricante para la medición de IL-1β. Nota: En este protocolo de IL-1β se mide específicamente; Sin embargo, la medición simultánea de TNFa, IL-6, y la citocina inmunomoduladora IL-10 se cebaron asegurar las condiciones apropiadas. </li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Las citocinas inflamatorias son integrales en la dirección de la respuesta inmune innata y adaptativa para combatir la infección viral. Secretada de IL-1β se ha demostrado que aumenta durante la infección por influenza 3, 43, 44. Los mecanismos precisos por los que estas citoquinas se procesan en respuesta al reconocimiento viral en células dendríticas humanas no se entienden completamente. Kits de aislamiento DC mieloides son costosos y requerir mucho tiempo. Kits de aislamiento y clasificación FAC puede inv...

Se requiere Activación del sistema inmune innato para dirigir la respuesta inmune adaptativa durante la infección, la enfermedad y la vacunación 7. Las células dendríticas son el antígeno más potente que presenta células del sistema inmune innato; están especializados para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos, y la activación de citolítica CD8 + T-células 8-10 ingenuo CD4 + y. Para habilitar la detección de patógenos rápida del sistema inmune innato utiliza numerosos receptores de reconocimiento de patrón de la línea germinal codificada (PRR) que reconocen patógenos motivos conservados derivados o marcadores de acogida derivado de estrés celular y el daño. Receptores tipo Toll (TLRs) son los receptores de reconocimiento de patrones unidas a la membrana que reconocen ciertos patógeno fagocitado extracelular patrones asociados molecular (PAMP) y los patrones moleculares de peligro asociado (apaga). Por el contrario guiño como receptores (NLRs) son citosólicas y responder a una amplia gama de PAMP y DAMPS. Nod como receptores representar una segunda línea de defensa contra los patógenos que evaden superficie celular y PRRs endocítica. La interacción de los patógenos derivada, o &quot;peligro&quot; asociada, factores con TLR y NLR ligandos conduce a un estado de maduración de las DC que resulta en una mayor interacción DC con otras células inmunes y la promoción de las células T y activación de las células asesinas naturales 11. La interleucina-1β es un componente crucial de la defensa del huésped contra la infección. A partir del reconocimiento de un microorganismo, la citoquina altamente proinflamatorias, IL-1β, se secreta y funciona como un atrayente de quimioterapia y activador de las células inmunitarias innatas y adaptativas. In vivo de IL-1β es en gran parte responsable de la respuesta de fase aguda incluyendo fiebre y citoquina inflamatoria síntesis 12. La mayoría de NLRs contienen un dominio rico en leucina repetir el terminal C que se cree que funcionar en la detección de ligando, un dominio de unión de nucleótidos central (NACHT) que es importante para la oligomerización NLRP3, y un dominio efector terminal de N (PYD en NLRP3) que media la transducción de señales a través de objetivos de abajo interacciones proteína-proteína. La proteína NLRP3 define el complejo más intensamente estudiado inflamasoma. Esta proteína es un miembro de la familia de NLR y tiene la capacidad para formar un complejo de proteínas múltiples molecular compuesta de NLRP3, la PYCARD proteína adaptadora (también conocido como ASC), y el ICE. Después de la activación inflamasoma PYCARD une al terminal de dominios NLRP3 N y recluta a través de ICE (tarjeta) dominios de activación de caspasas y contratación de dominio. La interleucina-1 de la enzima convertidora se genera inicialmente como un zimógeno que contiene un motivo TARJETA en su extremo N-terminal. Resultados de formación inflamasoma en la unión de dos moléculas de ICE suficientemente cerca para inducir su activación autocatalítica. El complejo inflamasoma es necesaria para la activación de ICE por lo tanto lo que le permite convertir citoplásmica Pro-IL-1β para madurar citoquina. El éxito de la secreción de la IL-1β en los países en desarrollo requiere la detección de dos señales de peligro distintas e independientes. En primer lugar, TLR detección de PAMP, DAMPS, o la señalización de citoquinas (TNF o IL-1β) causa una regulación positiva de la expresión de la proteína citoplasmática pro-IL-1β. Se requiere una segunda frecuencia diferente, señal, para la formación de complejos inflamasoma aguas arriba de la maduración del ICE. Algunos inflamasoma estimular señales incluyen toxinas de los poros de la membrana bacteriana que forman (como nigericina), lisosomales interrumpir cristales (tales como cristales de urato monosódico, MSU) y ATP extracelular. El mecanismo ascendente que conduce a la activación NLRP3 inflamasoma por estos diversos activadores no está claro. Estudios de investigación de aguas arriba de señalización de la formación de inflamasoma propone que los eventos intracelulares, tales como la inducción de la hipopotasemia o especies reactivas de oxígeno (ROS) activan indirectamente la inflamasoma 13-28. Entre los diferentes activadores virales del inflamasoma NLRP3 es la influenza, que proporciona banto la señal primaria y secundaria requerida para la secreción de IL-1β 3, 29-33. Utilizando modelos knockout NLRP3 ratón se encontró que la secreción de IL-1β en los países en desarrollo es NLRP3 dependiente 32. Además, los ratones knockout NLRP3 atraídos menos leucocitos al sitio de la infección y experimentaron una mayor mortalidad 2, 5. Dos estudios recientes sugieren un mecanismo para la activación inflamasoma NLRP3 durante la infección por el virus de la influenza; primero, el cebado a través del reconocimiento de ARN viral por TLR7 o TLR8 (dependiendo de TLR expresión de la célula de responder) o a través de sensores de las bacterias comensales por otro TLR para inducir la expresión en favor de la IL-1β citoplásmica, seguido por una segunda señal, la activación de NLRP3 formación inflamasoma por la proteína viral del canal iónico M2 en la red trans del Golgi 33, 34. En este último paso, la activación del inflamasoma NLRP3 se logra mediante la alteración de la iónica intracelular &lt;em&gt; entorno que conduce a la producción de ROS, que es, simplemente, detectada por NLPR3 como una señal para formar el inflamasoma. Sin embargo, el mecanismo exacto de la activación aguas arriba inflamasoma de la actividad de ICE durante la infección por influenza sigue siendo poco clara. Este trabajo describe una técnica valiosa para el estudio de la inflamasoma NLRP3 en moDCs humanos que se puede utilizar como una base para la investigación adicional de la vía subyacente DC basado secreción de IL-1β en respuesta a TLR8 ligadura con R848 seguido por la activación de la inflamasoma por un pozo conocido activador de la NLRP3, nigericina. Las variaciones de este método se puede utilizar con otros tipos de células incluyendo, pero no limitados a: los monocitos, macrófagos, otros subconjuntos de DC, y células epiteliales.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R& D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>Adquirimos este artículo a través de nuestra farmacia local con receta</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares de sangre periférica</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>Las PBMC se aislaron de la sangre de donantes sanos Placas de cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos de 12 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R& D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC control</td> de <td>isotipo Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&beta;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>R& D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrana Immobilon-FL</td><td>Millipore</td> gradiente <td>de IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>4-12% gel de policrilamida</td><td>Bio</td><td>Rad 161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra Laemmli</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% solución estéril/filtrada</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>16% solución</td></tr><tr><td>Kit de matriz de perlas de citocinas inflamatorias humanas</td><td>BD 551811</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nigericina</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Almacén in situ</td>Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mL<a>Nunc EasYFlask 225 cm2, Tapón filtrante, 70 ml volumen de <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> trabajo, 30/Cs</a>Thermo <td></td></tr><tr><td></td><td> Científico</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; M Unidades de filtro desechables estériles</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-ratón IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Burro &alpha;-conejo IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Spectra escalera de proteínas multicolor de amplio rango</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS 10x</td><td>Bio Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine 10x</td><td>Bio Rad</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - 4</td><td>L Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de poliestireno de 8 cámaras portaobjetos de vidrio tratado para cultivo de tejidos</td><td>BD Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

activación y medición de nlrp3 inflamasoma actividad usando il-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Los procesos inflamatorios resultantes de la secreción de interleucina (IL) -1 citocinas de la familia de las células inmunes conducen a la inflamación local o sistémica, remodelación y reparación de tejidos, y el control virológico 1, 2. La interleucina-1β es un elemento esencial de la respuesta inmune innata y contribuye a eliminar los patógenos invasores al tiempo que evita el establecimiento de la infección persistente 1-5. Inflamosomas son la plataforma de señalización clave para la activación de la interleucina 1 de la enzima convertidora (ICE o caspasa-1). El inflamasoma NLRP3 requiere al menos dos señales en los países en desarrollo para hacer que la secreción de IL-1β 6. Pro-IL-1β expresión de la proteína se limita en las células en reposo; por lo tanto, se requiere una señal de cebado para la transcripción de IL-1β y expresión de la proteína. Una segunda señal detectada por los resultados NLRP3 en la formación de la inflamasoma NLRP3 multi-proteína. La capacidad de las células dendríticas para responsabilidadd para las señales requeridas para la secreción de IL-1β se puede probar usando una purina sintética, R848, que es detectado por TLR8 en monocitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) a las células principales, seguido por la activación de la inflamasoma NLRP3 con la toxina bacteriana y ionóforo de potasio, nigericina. Monocitos DCs derivadas son fácilmente producidos en la cultura y proporcionan significativamente más células que purificados mieloide países en desarrollo humano. El método presentado aquí se diferencia de otros ensayos inflamasoma en que se utiliza en humanos in vitro, en lugar de ratón derivada, permitiendo así que los países en desarrollo para el estudio de la inflamasoma en la enfermedad humana y la infección.

Estas técnicas miden TLR8 cebado con R848. Tinción intracelular de citoquinas para pro-IL-1β permite microscopía y FAC lecturas de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas técnicas se pueden cuantificar con relación a un no imprimado, o de descanso, el control celular, así como un control de isotipo (Figuras 1 y 2). Porcentaje de células pro-IL-1β + tinción se multiplica por la mediana geométrica de esta población para proporcionar la intensidad de fluorescencia media (MFI). El IMF e...

Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

El objetivo general de los siguientes experimentos es observar la actividad del inflammasoma en células dendríticas humanas in vitro mediante ensayos sencillos de detección de IL-1β. Primero, añada R 848 a las células para inducir la expresión intracelular de pro-IL-1β. Luego, añada nige para activar la formación del inflammasoma NLRP3.Esto a su vez desencadena la escisión de la pro IL-1β en IL-1β madura antes de su secreción. A continuación, recoja las muestras y mida la pro IL-1β intracelular y la IL-1β madura extracelular, cuyos resultados se obtienen mediante la cuantificación de la secreción de IL-1β desde células previamente sensibilizadas y activadas, mediante inmunofluorescencia, inmunotransferencia (western blot) y ELISA. Un análisis de detección demuestra que la sensibilización de DCs humanas induce la producción intracelular de pro IL-1β en células sensibilizadas con R848, así como la secreción de IL-1β en células que han sido tanto sensibilizadas como activadas con Nigericina.Este método puede proporcionar información sobre el papel del inflammasoma NLRP3 en la respuesta de las células dendríticas humanas a ligandos sintéticos. También puede aplicarse a otros sistemas diseñados para probar desencadenantes fisiológicos como bacterias, virus y enfermedades autoinflamatorias. Aliquotar 200 microlitros de células dendríticas derivadas de monocitos recién aisladas en su estado de reposo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.Comience con las cuatro condiciones estándar de control negativo no estimulado, solo cebado, solo activación, y cebado seguido de activación. Luego, según el diseño experimental, incluya controles de diluyente para R 8 48 y nisin para ensayos posteriores de tinción intracelular de citocinas; incluya duplicados para los controles de isotipo para cebado del inflammasoma. AÑADA R 8 48, agregue una concentración final de 10 micromoles a los pozos adecuados.Coloque las células en un incubador a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante 18 horas. Luego, para activar el inflamasoma NLRP3, agregue nige a una concentración final de 20 micromolares. Devuelva las culturas al incubador durante seis horas adicionales; para recolectar las muestras, centrifugue la placa de cultivo a 974 veces G durante tres minutos sin perturbar los pellets celulares.Transfiera cada sobrenadante a una placa separada de fondo redondo para medir la secreción de citoquinas mediante EISA. Luego lave los pellet celulares tres veces con 200 microlitros de 1X PBS para eliminar cualquier IL-1β extracelular de las muestras celulares, destinadas a análisis posteriores mediante diversas técnicas. Lise las células directamente en 10 microlitros de tampón de lisis desnaturalizante para detección por inmunotransferencia de pro-IL-1β. Después de transferir los lisados a tubos de 1,5 mililitros, caliente las muestras durante 10 minutos a 100 grados Celsius para su detección fluorescente por citometría de flujo de IL-1β.Añada 100 microlitros de medio con PHS al 5 % a las muestras celulares y un microlitro de anticuerpos marcados con fluorescencia para los marcadores de fenotipo o control isotípico; incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de tres lavados con PBS, fije las células con 100 microlitros de PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, añada 100 microlitros de tampón permeabilizante durante 30 minutos, seguido de 62 nanogramos de anticuerpo anti IL-1β FSE o control isotípico; incube las muestras durante dos horas a 37 grados Celsius.Lave las células tres veces con 200 microlitros de tampón permeable y resuspenda en un XPBS. Envuelva las muestras en papel de aluminio y almacénelas a cuatro grados Celsius. Si va a detectar IL-1β mediante tinción por microscopía, marque las células con DAPI, agregue montante y coloque cuidadosamente una lámina de cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio.Deje que la montaña se cure durante la noche antes de capturar imágenes de microscopía para la detección fluorescente mediante citometría de flujo. Adquiera los datos una muestra a la vez. Establezca las compuertas de dispersión directa y lateral en las células viables. A continuación, seleccione las células positivas para CD11C y negativas para CD14.Finalmente, analice la población de MODC basándose en la tinción de pro IL-1β en la adquisición de datos de microscopía. Establezca el tiempo de exposición con la muestra tratada con R-848 que presenta tinción positiva. Luego, determine el porcentaje de MODC que expresan pro IL-1β para la detección mediante inmunotransferencia.Cargue el volumen total de la muestra en el gel de poliacrilamida. Corra a 140 voltios hasta que el frente del colorante abandone el gel. Transfiera la proteína desde el gel de poliacrilamida a la membrana A-P-V-D-F immobilon FL.Bloquee la membrana con BSA al 5 % en TBST durante una hora. Incube con el anticuerpo primario bajo agitación a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de tres lavados con TBST de cinco minutos, incube con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora; tras tres lavados adicionales con TBST, image la membrana al medir citocinas secretadas mediante ELI SA, equilibrando las muestras a temperatura ambiente.Centrifugar las muestras para consolidar la condensación del sobrenadante y seguir las instrucciones del fabricante para la medición de la citocina intracelular IL-1β; la tinción para pro-IL-1β permite la microscopía y la obtención de datos a partir de células dendríticas derivadas de monocitos CD11c positivas y CD14 negativas. Ambas técnicas pueden cuantificarse en relación con un control de células no activadas o en reposo, así como con un control de isotipo. El porcentaje de células teñidas para pro-IL-1β se multiplica por la mediana geométrica de esta población para obtener la intensidad mediana de fluorescencia.El MFI es comparable a la cantidad de pro IL-1β presente en las células con tinción positiva. Aquí, se utilizan técnicas de inmunotransferencia para medir la pro IL-1β a partir de los lisados celulares. Los datos cuantitativos se expresan en relación con un control celular interno, como la tubulina beta, tal como se espera.El inmunotransferencia para pro-IL-1β en células tratadas con NI-Nigeragina revela una disminución de la pro-IL-1β. Esto se complementa con un aumento concurrente de IL-1β en los sobrenadantes, medido mediante ELISA utilizando un anticuerpo R848, seguido de las condiciones con NI-Nigeragina. La medición simultánea de otras citocinas inflamatorias, como TNF-α, IL-10 e IL-6, asegura que Nigericina sea específica para inducir la secreción de IL-1β.El nivel de cebado depende del tiempo y de la dosis. Experimentos adicionales, como la medición de la concentración de proteínas extracelulares, la detección de quimioluminiscencia procedente de la generación madura de IO-1β o el bloqueo del inflamasoma, ayudarían a determinar si la IO-1β extracelular es la forma madura y escindida, y si la secreción de IO-1β depende de la actividad del inflamasoma NLRP3.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un inmunoensayo simple para medir la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1 beta, en pacientes con fenotipos autoinflamatoria. Mediante la activación de las células en cultivos de sangre total con el patógeno patrones moleculares asociados, específicamente con lipopolisacárido, la secreción de citoquinas puede ser convenientemente evaluada en los sobrenadantes de sangre total.

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Se describe el uso de la tecnología IMAGESTREAM...

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Este video muestra un método para detectar la activación del inflamasoma NLRP3 en macrófagos utilizando sondas reporteras fluorescentes. Las células se tratan con ionóforos de potasio y glicina para inducir el ensamblaje del inflamasoma y la activación de la caspasa-1. Las sondas reporteras fluorescentes visualizan la caspasa-1 activada y las células se tiñen con un tinte fluorescente para la visualización de los núcleos.

Detección de la activación del inflamasoma mediante microscopía de fluorescencia

Este video muestra una técnica para estudiar la formación de inflamasomas que contienen el dominio de pirina 3 (NLRP3) de la familia de receptores similares a NOD en macrófagos primarios mediante inmunofluorescencia. Los macrófagos se preparan primero con lipopolisacárido bacteriano (LPS) para regular al alza la expresión de la proteína NLRP3. La exposición de los macrófagos a la nigericina, un ionóforo de potasio, conduce a la activación de NLRP3 y a la formación de inflamasomas, que se...

Una técnica in vitro para estudiar la formación de complejos inflamasomas en macrófagos

Este protocolo presenta un método eficiente y fiable para transfectar humanos THP-1 macrófagos con siRNA o ADN plásmido por electroporación con una alta eficiencia de transfección mientras se mantiene alta la vitalidad celular y la capacidad de los macrófagos completo para la diferenciación y polarización.

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

MALT1 regula la inmunidad innata pero cómo esto ocurre sigue siendo mal definida. Utilizamos el inhibidor selectivo de la paracaspase del MALT1 MLT-827 a desentrañar la contribución de MALT1 al innato señalización corriente abajo de los receptores de lectina-como Toll-like o tipo C, demostrando que MALT1 regula la producción de citocinas mieloide y aguas abajo de los receptores de lectina-como de tipo C, selectivamente.

Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad

Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF--B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Aprende a activar y medir la actividad del inflamasoma NLRP3 en células dendríticas humanas mediante la detección de IL-1β. Este método utiliza R848 y nigericina para evaluar la respuesta inmunitaria.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

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