Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

El objetivo general de los siguientes experimentos es observar la actividad del inflamasoma en células dendríticas humanas in vitro utilizando ensayos simples de lectura de IL una beta. En primer lugar, añada R 8 48 a las células para inducir la expresión intracelular de pro IL uno beta. A continuación, añada nige para activar la formación de tres inflamasomas NLRP.

Eso, a su vez, desencadena la escisión de la IL pro una beta en la IL madura una beta antes de la secreción. A continuación, se recogen las muestras y se miden los resultados intracelulares pro IL una beta y los resultados extracelulares maduros de IL una beta obtenidos midiendo la secreción de IL una beta de células preparadas y activadas por inmunofluorescencia, western blot y eli. Una detección demuestra que el cebado de la EDC humana da lugar a la producción intracelular de pro IL una beta en las células R 8 48 cebadas y a la secreción de IL una beta de las células tanto cebadas como activadas con Nigerian juris.

Este método puede proporcionar información sobre el papel del inflamasoma NLRP tres en la respuesta de las células dendríticas humanas a los ligandos sintéticos. También se puede aplicar a otros sistemas diseñados para probar desencadenantes fisiológicos como bacterias, virus y enfermedades autoinflamatorias. Alícuota de 200 microlitros de células dendríticas derivadas de monocitos recién aisladas en su estado de reposo en una placa inferior redonda de 96 pocillos.

Comience con las cuatro condiciones estándar de control negativo no estimulado, solo cebado, solo activación y cebado seguido de activación. Luego, de acuerdo con el diseño experimental, incluya controles de diluyente para R 8 48 y nissina para los ensayos de tinción de citocinas intracelulares aguas abajo, incluya duplicados para los controles de isotipo para cebar el inflamasoma. ADD R 8 48, añadir una concentración final de 10 micromolares a los pocillos adecuados.

Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 18 horas. Luego, para activar el inflamasoma NLRP tres, agregue nige a una concentración final de 20 micromolares. Regrese los cultivos a la incubadora durante seis horas adicionales para recolectar las muestras, centrifugue la placa de cultivo a 974 veces G durante tres minutos sin alterar los gránulos de celdas.

Transfiera cada sobrenadante a una placa inferior redonda separada para medir la secreción de citocinas por EISA. Ahora lave los gránulos celulares tres veces con 200 microlitros de un XPBS para eliminar cualquier IL extracelular y un beta de las muestras celulares para su posterior análisis mediante una variedad de técnicas para la detección de Western blot de pro IL un beta lyce las células directamente en 10 microlitros de tampón de lisis desnaturalizante. Después de transferir los lisados a tubos de einor de 1,5 mililitros, calentar las muestras durante 10 minutos a 100 grados Celsius para la detección fluorescente por citometría de flujo de IL uno beta.

Agregue 100 microlitros de medio PHS al 5% a las muestras celulares y un microlitro de anticuerpos marcados con fluorescencia para los marcadores de fenotipo o el control de isotipo incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de tres lavados de PBS, fije las celdas con 100 microlitros de 4% de PFA durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón permeable durante 30 minutos, seguidos de 62 nanogramos de anti IL, un anticuerpo beta FSE o muestras de control de isotipo durante dos horas a 37 grados Celsius.

Lave las células tres veces con 200 microlitros de tampón permeable y vuelva a suspender en un XPBS. Envuelva las muestras en papel de aluminio y guárdelas a cuatro grados centígrados. Si detecta IL uno beta por microscopía tiñe las células con dappy, agregue montaña y coloque un cubreobjetos suavemente encima de un portaobjetos de vidrio.

Deje que la montaña se cure durante la noche antes de capturar imágenes de microscopía para la detección fluorescente mediante citometría de flujo. Adquiera datos una muestra a la vez. Ajuste las puertas dispersas hacia adelante y hacia los lados en las celdas vivas: Puerta siguiente en las celdas CD 11 C positivas, CD 14 negativas.

Finalmente, analizar la población de MODC en base a la tinción beta pro IL one en la adquisición de datos de microscopía. Ajuste el tiempo de exposición con la muestra tratada con tinción positiva R 8 48. A continuación, determine el porcentaje de pro IL uno beta que expresa MO dcs facilidad para la detección de Western blot.

Cargue el volumen total de la muestra en el gel de poliacrilamida. Funcione a 140 voltios hasta que el frente del troquel se escurra fuera del gel. Transfiera la proteína del gel de poliacrilamida a la membrana A-P-V-D-F immo en FL.

Bloquee la membrana con 5%BSA en TBST durante una hora. Incubar con el anticuerpo primario mientras se agita a cuatro grados centígrados durante toda la noche. Después de tres lavados de cinco minutos con TBST, incube con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora, después de tres lavados más con TBST, obtenga una imagen de la membrana al medir las citocinas secretadas por ELI SA para equilibrar las muestras a temperatura ambiente.

Spile las muestras para consolidar la condensación sobrenadante y siga las instrucciones del fabricante para la medición de IL one beta La tinción de citocinas intracelulares para pro IL one beta permite la microscopía y las lecturas de datos de las células dendríticas derivadas derivadas de monocitos CD 11 C C positivo CD 14 negativo. Ambas técnicas se pueden cuantificar en relación con un control de célula no primaria o en reposo, así como con un control de isotipo. El porcentaje de células de tinción pro IL una beta se multiplica por la mediana geométrica de esta población para proporcionar la intensidad fluorescente mediana.

El MFI es comparable a la cantidad de pro IL uno beta presente en las células de tinción positiva. Aquí. Las técnicas de inmunotransferencia se utilizan para medir pro IL una beta de los lisados celulares. Los datos cuantitativos se expresan en relación con un control celular interno como la beta tubulina, como se esperaba.

La inmunotransferencia para pro IL one beta en células NI tratadas con Nigeria revela una disminución de pro IL one beta. Esto se complementa con un aumento simultáneo de IL uno beta en sobrenadantes, medido por E ELI a solo un R 8 48, seguido de condiciones nigerianas de NI. La medición simultánea de otras citocinas inflamatorias, como T, NF, alfa, IL 10 e IL seis, asegura que Níger es específico en la secreción de IL uno, beta.

El nivel de cebado depende del tiempo y de la dosis. La experimentación adicional, como la medición de la concentración de proteínas ex extracelulares, la detección de quimioluminiscencia a partir de una generación beta madura I o el bloqueo del inflamasoma, ayudarían a determinar si la secreción beta de IO una α extracelular es la forma madura escindida y si la secreción de IO una beta es nlrp. Dependiente de la actividad inflamatoria.