Name: Secuencial En vivo Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a rastrear células madre osteogénicas endógenas durante la reparación de fracturas óseas mediante microscopía intravital secuencial. Este método permite visualizar la migración, proliferación y diferenciación celular in vivo.

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Damos las gracias a C. Park por leer el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIAMS en Número Award y un Premio K01AR061434 Leukemia &amp; Lymphoma Society Fellowship (5127-09) para DP y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud a CPL y DTS El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Los ratones y precondicionamiento Nota: Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts. Toda la cirugía debe realizarse en condiciones estériles utilizando material estéril en autoclave. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomate), fueron compraron de Jackson Laboratories. ratones osteocalcina-GFP fueron proporcionados por el Dr. Henry Kronenberg. Para el análisis cuantitativo de OSPC migración y proliferación in vivo, se utilizaron + (solo color-reportero) ratones Mx1-Cre + Rosa-YFP. Para un seguimiento más detallado de su diferenciación en osteoblastos osteocalcina + maduros, utilizamos trigénico Mx1-Cre + Rosa-Tomate + OCN-GFP +ratones. <ol><li> Para marcar las células Mx1 + in vivo, preparar ácido poliinosínico-policitidílico (PIPC, 2,5 mg / ml) en solución de PBS estéril e inyectar 200 l por 20 g de Mx1-Cre + reportero de ratón por vía intraperitoneal una vez cada dos días durante 10 días. </li><li> Para eliminar las células Mx1 + hematopoyéticas residentes, irradiar ratones con una sola dosis de 9,5 Gy. Después de 24 horas de irradiación, las células de tipo salvaje de trasplante de médula ósea (1x10 6 células / ratón) por vía intravenosa 16. Nota: Puesto que las células Mx1-inducibles incluyen las células hematopoyéticas y los osteoclastos hematopoyéticos derivados, la eliminación de las células hematopoyéticas + Mx1 mejora la calidad de imagen y cuantificación de células osteogénicas + Mx1. </li><li> Después de trasplante de médula ósea, para observar a los animales cuatro a seis semanas con el fin de lograr una repoblación con éxito de células de donantes de médula. </li></ol> 2. Moutilizar Preparación <ol><li> Anestesie ratón mediante inyección intraperitoneal de 50 l de ketamina / xilazina (100 mg / kg, xilazina 12 mg / kg de peso corporal) mediante un procedimiento aprobado por la IACUC. Nota: La duración del efecto puede ser prorrogado por una dosis adicional de ketamina / xilazina. </li><li> Determine si el ratón está totalmente anestesiado por la falta de respuesta a los pies y / o pellizcos de cola. (Opcional) Cuando se anestesia el ratón, asegurar una máscara de gas isoflurano sobre la nariz con cinta adhesiva. Ajuste el nivel de isoflurano para asegurar que el animal está completamente sedado. </li><li> Corte el pelo del cuero cabelludo utilizando un condensador de ajuste eléctrico o tijera pequeña. Retire los fragmentos de cabello y esterilizar la piel expuesta con un 70% algodón con alcohol. Aplique el gel lacrimógenos para evitar la deshidratación de la córnea. </li></ol> 3. Lesiones Microfractura <ol><li> Después de asegurarse de que el animal está completamente sedado, hacer una sola incisión en forma de L inversa para abrir la piel del cuero cabelludo. En pocas palabras, hacer una primera incisión transversal (menos de 1 cm) InicioÌón de una oreja a otra oreja. Gire ~ 60 ° y continuar incisión hacia la nariz hasta ~ 2-3 mm de distancia de la nariz. Nota: Esta incisión minimiza la formación de tejidos de la cicatriz por encima del área a explorar. </li><li> Separe los colgajos de piel tirando hacia los lados con unas pinzas. Ambos huesos frontales y la intersección de las suturas coronal y sagital deben ser claramente expuestos. </li><li> Limpie la superficie abierta por el lavado con PBS estéril y de limpieza suave con gasa o algodón hisopos estériles hasta que se eliminen todos los pelos residuales. </li><li> Para generar microfracturas en la bóveda craneal, sostenga la cabeza del ratón con una mano y una aguja de 30 G con la otra mano. Hacer un micro-punción (~ 0,2 mm de diámetro de la herida con &lt;1 mm de profundidad) en el hueso frontal izquierdo, cerca de la intersección de las suturas coronal y sagital, insertando la punta de una aguja de 30 G con una presión suave y movimiento de torsión. Precaución: Es fundamental para evitar que la aguja penetre en el cerebro, lo que minimiza bleeding y el daño tisular. </li><li> Cambie a una aguja más grande (20 o 25 G) y ensanchar el orificio de punción girando la aguja (~ 0,5 mm de diámetro). </li><li> Repita el paso 3.3 a 3.5 para generar segunda punción en el hueso frontal contralateral. </li><li> Limpie hacia fuera los puntos lesionados por goteo continuo de PBS hasta que el sangrado se detenga. Nota: El sangrado en los sitios de fractura va a interferir con la imagen apropiada e inducir la formación de cicatrices. </li><li> Aplique una gota de solución salina fisiológica estéril o 2% de Methocel en el cráneo para evitar que se sequen. Nota: No permita que la superficie del cráneo se seque, lo que reducirá la claridad de la imagen. Es importante usar una cantidad suficiente de gel o solución salina para cubrir el área. </li></ol> 4. Imaging intravital <ol><li> (Opcional) Antes de formación de imágenes, algunos ratones se les inyecta un colorante vascular para visualizar los vasos sanguíneos. Inyectar retro-orbital con 20 l de Qtracker no dirigido 705 (2 M solución en 50 mM de tampón de borato) diluido en 80 ml de PBS. Utilice una jeringa de insulina para minimizar el desperdicio de reactivos. Si la señal no es lo suficientemente brillante, podrían ser necesarias cantidades adicionales. </li><li> Encienda el escáner. Nota: Un escáner láser basado en polígonos permite la adquisición simultánea de múltiples canales de imagen a una velocidad de vídeo (30 fotogramas por segundo). Escaneo tasa video es muy importante para la formación de imágenes de animales vivos. </li><li> Encienda el láser multi-fotón (femto-segundos de titanio: zafiro láser). Establecer la longitud de onda a 880 nm y ajustar la potencia para la segunda generación de armónicos de formación de imágenes (440 nm) del hueso. Por las buenas prácticas agrarias y tdTomato excitación, encienda el 491 nm y 561 nm láser de estado sólido. </li><li> Encienda el PMT (tubo fotomultiplicador) detectores para cada señal (a ± filtro de paso de banda 435 20 nm para generación de segundo armónico, un ± filtro de paso de banda 528 19 nm para GFP, y 590 ± 20 para tdTomato.) (Opcional) Utilice un 638 nm láser de helio-neón y un PMT con un ± filtro paso banda 695 27,5 nm para detectar Qtracker 705 de señal. </li><li> Placcorreo del animal en una platina del microscopio motorizado XYZ-eje. Mantenga el ratón en la posición más cómoda con una almohadilla eléctrica para ayudar a mantener la temperatura del cuerpo (lo que reduce el riesgo de pérdida de animales). Use cinta adhesiva para sujetar el ratón para minimizar el movimiento durante la exploración y para mantener el área de la imagen lo más horizontal posible. </li><li> Aplique una gota de gel caliente metilcelulosa 2% o solución salina fisiológica en el cráneo para evitar que se sequen. Ponga una cubierta de vidrio en el área de imagen. Utilice un objetivo de bajo aumento (30x objetivo de inmersión en agua con 0,9 NA) para explorar el calvaria. </li><li> Utilizando el controlador XYZ-eje, encontrar la superficie de la bóveda craneal mediante la detección de la señal de GAA de los huesos e identificar una ubicación de punto de interés fundamental, tales como la intersección entre las suturas sagital y coronal suturas. Adquirir una imagen y registrar las coordenadas XYZ. </li><li> Continuar para buscar la ubicación de la lesión mediante la observación de las señales de los grupos de autoayuda y de fluorescencia. </li><li> Cuando los sitios de lesión o de la región of interés se encuentran, adquirir una imagen de la mejor plano focal que contiene las señales de fluorescencia de GAA y de las células de interés. Guardar coordenadas XYZ y la distancia a la intersección de las suturas coronal y sagital para definir su ubicación con precisión las próximas rondas de formación de imágenes. </li><li> Para recoger las estructuras celulares y de los huesos en 3D de una lesión de fractura, grabar imágenes de Z-pilas (2-5 micras) con intervalos de ~ 100 m de profundidad desde la superficie del hueso endosteal. Después de la finalización de la formación de imágenes de un lado de la lesión, repetir el proceso de formación de imágenes para los sitios de lesión próximos. </li></ol> Procedimientos 5. Publicar Operación <ol><li> Después de formación de imágenes, enjuague sitio de formación de imágenes con solución salina estéril para eliminar el gel de metilcelulosa del cráneo. El uso de un bastoncillo de algodón estéril, aplicar una pequeña cantidad de pomada antibiótica triple en la superficie. Cubra los colgajos de piel y volver a cerrar el cuero cabelludo mediante sutura quirúrgica. Esto se puede hacer con un hilo de sutura hipoalergénico (poliglactina absorbible dotura) y 5-0 tamaño de la aguja de sutura. Precaución: Una buena técnica de sutura reduce al mínimo la formación de cicatrices. </li><li> Tratar a todos los animales con inyección IP de 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina cada 12 horas durante 48 horas después de la cirugía. Mantener a los animales en una cámara de recuperación tibia hasta que recobren el conocimiento suficiente. Después de 3 a 5 días, abrir de nuevo la sutura y repetir los pasos intravital de imágenes para realizar el seguimiento del cambio celular durante la curación de la fractura. </li></ol>

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<li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia financieros.

La regulación de las células madre del esqueleto puede ser de gran importancia para definir los mejores métodos para lograr la regeneración ósea. Imágenes cuantitativa y secuencial a nivel celular ha sido técnicamente difícil. Aunque el modelo de fractura de los huesos largos del ratón ha sido ampliamente utilizado y adecuado para estudios biomecánicos 17, su ubicación de tejido profundo, el tamaño de la fractura desigual, daño de tejidos blandos, y la aplicación de fijadores de estabilización han limitado in...

Enfermedades óseas degenerativas y la pérdida ósea relacionada con la edad que conduce a un alto riesgo de fractura por osteoporosis se ha convertido en un reto importante en la salud pública 1. Mantenimiento óseo está controlado por los osteoblastos forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los defectos de las células formadoras de hueso son una causa principal de la pérdida ósea relacionada con la edad y las enfermedades óseas degenerativas 2,3. Si bien una amplia investigación se ha centrado en la mejora de la curación de la fractura, el descubrimiento de fármacos fiables para curar enfermedades degenerativas del hueso y para revertir la debilidad de las fracturas osteoporóticas sigue siendo un problema importante. Por lo tanto, el estudio de la fuente de células formadoras de hueso y sus mecanismos de control en la regeneración ósea y la reparación proporciona una nueva visión para mejorar la regeneración del esqueleto y revertir enfermedades de pérdida ósea. La existencia de células mesenquimales multipotentes en la médula ósea se ha propuesto sobre la base de la identificación de poblaciones clonogénicas que podía diferenteIATE en osteogénico, linajes adipogénicos y condrogénicas ex vivo 4. Recientemente, varios estudios han informado de que las células madre del esqueleto / mesenquimales (SSC / MSC) son una fuente natural de los osteoblastos y son fundamentales para la renovación ósea, remodelación y reparación de la fractura 5,6 . Además, nuestro estudio de trazado de linaje revelado que los osteoblastos maduros tienen una vida media corta inesperadamente (~ 60 días) y se reponen continuamente por sus células madre / progenitoras en ambas condiciones homeostáticas y reparación de fracturas normales 6. Sin embargo, la identidad in vivo de células madre y cómo tales células reaccionan a la fractura lesión y suministrar las células formadoras de hueso no son claras. Por lo tanto, es importante desarrollar un método que es capaz de analizar la migración, proliferación y diferenciación de las ESC endógenos / MSC en bajo circunstancias fisiológicas. Reparación de la fractura es un proceso de múltiples celular y dinámica regulada por una matriz de complejocitocinas y factores de crecimiento 7. El enfoque más popular para los estudios de fractura es el uso de un modelo animal con la fractura de los huesos largos y para analizar los huesos por seccionamiento hueso y técnicas de inmunofluorescencia 8-10. Este proceso de reparación puede ser supervisada por múltiples técnicas de imagen incluyendo micro-CT 11, la fluorescencia del infrarrojo cercano 12, y de formación de imágenes de quimioluminiscencia 13. Sin embargo, cada técnica tiene ciertas limitaciones y no ha habido manera efectiva de controlar la función ESC / MSC a nivel celular in vivo. Recientemente, confocal / de dos fotones microscopía intravital se ha desarrollado y utilizado para detectar células de cáncer trasplantado y las células madre hematopoyéticas en el contexto de su microambiente de la médula ósea, incluso con una resolución de una sola célula en animales vivos 14. Mediante la combinación de esta tecnología con una serie de modelos de rastreo de linaje, hemos sido capaces de definir que las células madre osteogénico / progenitoras se pueden marcar genéticamente por ac transitoriavación de la resistencia myxovirus -1 (Mx1) promotor y progenitores inducida Mx1-puede mantener la mayoría de los osteoblastos maduros con el tiempo, pero no participar en la generación de condrocitos en el ratón adulto 6. Además, hemos demostrado que OspC etiquetados-MX1 suministran la mayoría de los nuevos osteoblastos en la curación de fracturas 6. En este caso, el uso de modelos de seguimiento de osteo-linaje y microscopía intravital, se proporciona un protocolo para definir la cinética in vivo de + células madre / progenitoras osteogénicas Mx1 en la reparación de fracturas. Este protocolo ofrece imágenes secuenciales para seguir la reubicación de osteogénicas madre / progenitoras en los sitios de fractura y la medición cuantitativa de expansión osteoprogenitoras en el proceso de reparación temprana. Este enfoque puede ser útil en varios contextos, incluyendo la evaluación de candidatos terapéuticos para mejorar la reparación del hueso.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de ketamina</td><td>Bionichepharma</td><td>67457-001-10</td><td>&nbsp; Tamaño del vial: 10 ml (50 mg/ml)</td></tr><tr><td>Solución estéril de xilacina</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina Hl</td><td>BEDFORD LAB</td><td>NDC 55390-100-10</td><td>Vial: 0,3 mg/ml, Dosis: 0,05-0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>CORNING cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol (70% de alcohol isopropílico)</td><td>Kendall WEBCOL</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Tijera quirúrgica</td><td>fina F.S.T</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza extrafina</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>VICRYL*Plus Suture</td><td>Ethicon</td><td>VCP490G</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 705 punto cuántico no dirigido</td><td>Invitrogen</td><td>Q21061</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>OmmiVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIpC (ácido poliinosínico-policitidílico)&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0913-50MG</td><td>100 &mu; l (2,5 mg/ml en PBS) para 10 g de ratón</td></tr><tr><td>Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Calypso 491 + 532 nm Láser DPSS</td><td>Cobolt AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radius-635 HeNe láser</td><td>Coherente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

secuencial<em&gt; en vivo</em&gt; imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Hueso vuelca continuamente y es muy regenerativa tras una lesión. Células madre / progenitoras osteogénicas larga han sido la hipótesis de existir, sino con demostración in vivo de tales células sólo recientemente se ha alcanzado. En este caso, se proporcionan en las técnicas de imagen in vivo para investigar el papel de las células madre / progenitoras osteogénicas endógenos (OspC) y su progenie en la reparación ósea. El uso de células osteo-linaje modelos de rastreo y de imagen intravital de microfracturas inducidas en calota, OspC se puede observar directamente durante los primeros días después de la lesión, en la que se producen los eventos críticos en el proceso de reparación temprana. Lesiones sitios se pueden obtener imágenes de forma secuencial revela que OspC reubicar a la lesión, aumenta en número y se diferencian en osteoblastos que forman los huesos. Estos métodos ofrecen un medio para investigar el papel de los reguladores moleculares de células madre-intrínsecos y extrínsecos para la regeneración ósea y la reparación.

<html> El modelo de fractura de huesos largos estabilizado ha sido muy popular en los estudios de fractura. Sin embargo, los modelos de fractura grandes hueso largo o causar daño tisular múltiple y, por lo tanto, tienen una limitación en la medición cuantitativa de la función de las células óseas. Hemos desarrollado una lesión mínimamente invasiva (menos de 1 mm de diámetro con invasión mínima o ninguna en la duramadre) en huesos frontales de calota con la perforación de la aguja (figuras 1A-1C). Elegimo...

La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

El objetivo general de este procedimiento es rastrear y cuantificar secuencialmente la migración, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras osteogénicas endógenas en la reparación de fracturas óseas. Esto se logra primero etiquetando in vivo las células positivas para el virus mixo, resistencia al virus de la influenza, uno o MX uno mediante la inyección de ácido poli cítico poli citidílico, y luego eliminando las células hematopoyéticas residentes positivas para MX uno mediante irradiación. En el segundo paso, se administran sistemáticamente células de médula ósea de tipo silvestre a los ratones irradiados.A continuación, se generan microfracturas en la zona Cal del ratón mediante perforación con aguja. Finalmente, se realiza una imagen secuencial dentro del vial de la reparación de la microfractura. En última instancia, estas imágenes intravital pueden utilizarse para evaluar la dinámica del ingreso y expansión de células madre y progenitoras osteogénicas en los sitios de fractura.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que permite la obtención de imágenes repetitivas in vivo de células madre y progenitoras osteogénicas durante el proceso de curación de fracturas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la cicatrización de fracturas y la osteoporosis. Dado que este método ofrece una nueva herramienta para monitorear las células madre y progenitoras osteogénicas endógenas en la regeneración y reparación ósea.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la generación de microfracturas con daño tisular mínimo y la repetida obtención de imágenes in vivo de la lesión por fractura sin inducir una formación severa de cicatrices son aspectos importantes del método y representan un desafío técnico. Para etiquetar in vivo las células positivas para MX uno, comience inyectando 200 microlitros de ácido poliácido poli citidílico por cada 20 gramos de peso del ratón reportero MX uno Cree, por vía intraperitoneal, una vez cada dos días durante 10 días. Luego, para eliminar las células hematopoyéticas residentes positivas para MX uno, irradie los ratones inyectados con una dosis única de 9,5 gras. Después de 24 horas, transplante 1 × 10⁶ células de médula ósea de tipo silvestre por vía intravenosa por ratón.Cuatro a seis semanas después, anestesie al ratón mediante inyección intraperitoneal con 50 microlitros de ketamina-xilacina. Tras confirmar la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, recorte el cuero cabelludo del ratón trasplantado con células de médula ósea y luego esterilice la piel expuesta con una torunda de alcohol al 70 %. Aplique gel lagrimal para prevenir la deshidratación corneal y, a continuación, realice una incisión transversal de menos de un centímetro de longitud a través del cuero cabelludo, comenzando desde una oreja y terminando en la otra. A continuación, gire al animal aproximadamente 60 grados y continúe la incisión hasta que alcance unos dos a tres milímetros de la nariz utilizando pinzas.Tire de la solapa de tejido hacia los lados del animal para separar la piel; ahora deben quedar claramente expuestos ambos huesos frontales y la intersección de las suturas sagital y coronal. Lave la superficie abierta con PBS estéril y luego retire suavemente los pelos residuales con hisopos de algodón. A continuación, para generar microfracturas en el cráneo, sostenga la cabeza del ratón con una mano y una aguja de calibre 30 con la otra.Utilice la punta de la aguja de calibre 30 para perforar suavemente una microperforación en un lado de los huesos frontales cerca de la intersección de las suturas sagital y coronal. Para evitar penetrar el cerebro, cambie a un calibre mayor y gire la nueva aguja para agrandar el orificio de perforación hasta un diámetro de aproximadamente 0,5 milímetros. Después de generar una segunda perforación en el hueso frontal contralateral, deje caer continuamente PBS en cada sitio, limpiando hasta que deje de sangrar.Luego, para evitar el secado, aplique una gota suficiente de solución salina fisiológica estéril sobre el cráneo para cubrir completamente el área donde se adquirirán las imágenes Vidal. Primero encienda el escáner láser basado en polígonos para permitir la adquisición simultánea de imágenes multicanal a una velocidad de video de 30 cuadros por segundo. A continuación, encienda el láser de titanio zafiro de femtosegundos para la obtención de imágenes multifotón.Configure la potencia y la longitud de onda a 880 nanómetros para la generación de segundo armónico de imágenes del hueso craneal a 440 nanómetros para la excitación de GFP y TD-tomate, encienda los láseres de estado sólido de 491 nanómetros y 561 nanómetros. Luego, active los detectores de tubo fotomultiplicador para cada señal: un filtro de banda pasante de 435 ± 20 nanómetros para la generación de segundo armónico, un filtro de banda pasante de 528 ± 19 nanómetros para GFP y un filtro de banda pasante de 590 ± 20 nanómetros para TD-tomate. Ahora, coloque el animal sobre una platina motorizada del microscopio en los ejes XYZ, encima de una almohadilla calefactora eléctrica ajustada a 37 grados Celsius.Utilice cinta para mantener al ratón en posición y luego aplique una gota de gel al 2% de metilcelulosa tibia sobre el cráneo. Para evitar el secado, coloque un cubreobjetos sobre el área de imagen. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en agua de 30x con una apertura numérica de 0,9 y el controlador de los ejes XY y Z para detectar la señal de generación de segundo armónico (SHG) proveniente de los huesos.Para encontrar la superficie del cráneo, identifique una ubicación anatómica clave crucial, como la intersección entre las suturas sagitales y las suturas coronales, y adquiera una imagen. Marque las coordenadas XY, Z del punto anatómico y luego continúe buscando la ubicación de la lesión utilizando las señales de SHG y fluorescencia como guías. Cuando se encuentre cada región de interés, adquiera una imagen del mejor plano focal que contenga las señales de SHG y fluorescencia procedentes de las células de interés.Guarde las coordenadas XY, Z y la distancia hasta la intersección de las suturas sagital y coronal para definir su ubicación precisa en la siguiente ronda de imágenes. Luego, recopile estructuras celulares y óseas tridimensionales de la lesión por fractura. Registre imágenes con intervalos de corte Z de aproximadamente dos a cinco micrones y una profundidad de unos 100 micrones desde la superficie endósea.Finalmente, después de obtener imágenes de ambos sitios de lesión, use varias gotas de solución salina estéril para eliminar el gel de metilcelulosa al 2% del cráneo. A continuación, cubra la superficie con antibióticos y tape el cráneo con los colgajos de piel, vuelva a cerrar el cuero cabelludo con hilo de sutura hipoalergénico y mantenga al animal en una cámara de recuperación cálida hasta que recupere una conciencia suficiente. Después de tres a cinco días, repita los pasos de imagenología intravital para rastrear los cambios celulares durante la curación de la fractura.En este experimento representativo, se generaron dos microfracturas en los huesos frontales de ratones genéticamente modificados MX uno de osteocalcina de tomate, GFP, tras la irradiación y el reemplazo de médula ósea. Un imagen intra vital tridimensional secuencial de las microfracturas mostró una reubicación de las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para tomate en el sitio de la fractura al día dos, así como su expansión al día cinco. Aunque no se detectaron osteoblastos positivos para GFP en este momento, al día 12, un subconjunto de progenitores osteo en la superficie de la fractura inició la diferenciación de osteoblastos positivos para tomate y GFP positivos, como indica la flecha. La acumulación de nuevos osteoblastos y la formación de nuevo hueso al día 21 indican que la migración y proliferación de las células progenitoras osteogénicas fue un mecanismo principal para suministrar nuevos osteoblastos para la curación de la fractura. Para comprobar si este método proporciona una salida consistente y cuantitativa del número de progenitores osteo durante la curación de la fractura, se rastrearon las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para MX uno YFP durante 14 días tras la lesión.Se detectaron consistentemente pequeños números de progenitores en el sitio de la lesión a los tres días. El número de células aumentó continuamente al séptimo día, alcanzando una población máxima al día 10 que se mantuvo hasta el día 14. La cinética de la generación de los progenitores osteo se cuantificó midiendo la intensidad de la señal YFP a lo largo del tiempo, y se correlacionó con la observada mediante microscopía intra vital.Los progenitores se observaron por primera vez el día tres, alcanzaron su punto máximo al día 10 y se mantuvieron con una intensidad similarmente alta hasta el día 14. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que técnicas hábiles de sutura y una hemorragia mínima pueden reducir la formación de cicatrices y disminuir la autofluorescencia de fondo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes y rastrear la migración, proliferación y diferenciación de células madre progenitoras osteogénicas endógenas en el proceso de reparación de fracturas.

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