Secuencial En vivo Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

El objetivo general de este procedimiento es rastrear y cuantificar secuencialmente la migración, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras osteogénicas endógenas en la reparación de fracturas óseas. Esto se logra marcando primero el virus mixto, la resistencia al virus de la influenza, una o MX una células positivas in vivo mediante la inyección de ácido policínico policitocilílico, y luego eliminando las células hematopoyéticas positivas MX una residentes mediante irradiación. En el segundo paso, se administran sistemáticamente células de médula ósea de tipo salvaje a los ratones irradiados.

A continuación, se generan micro fracturas en el área de Cal del ratón mediante perforación con aguja. Por último, se realizan imágenes intraviales secuenciales de la reparación de la microfractura. En última instancia, estas imágenes intravitales se pueden utilizar para evaluar la dinámica de la afluencia y expansión de las células madre y progenitoras osteogénicas en los sitios de fractura.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes repetitivas in vivo de células madre y progenitoras osteogénicas durante el curso de la cicatrización de fracturas. La implicación de esta técnica se extendió hacia la terapia de la cicatrización de fracturas y la osteoporosis. Ya que este método ofrece una nueva herramienta para el seguimiento de las células madre osteogénicas endógenas en la regeneración y reparación ósea.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la generación de la microfractura con un daño tisular mínimo y la repetición de imágenes in vivo de la lesión por fractura sin inducir la formación de cicatrices graves son importantes para el método y técnicamente desafiantes. Para etiquetar células MX one positivas in vivo, comience inyectando 200 microlitros de ácido poliácido policitoílico por 20 gramos de peso intraperitoneal de MX one Cree reporter una vez cada dos días durante 10 días. Luego, para eliminar las células hematopoyéticas MX positivas residentes, irradian a los ratones inyectados con una dosis única de 9,5 gras. Después de 24 horas, trasplante una vez 10 a la sexta célula ósea de tipo salvaje por vía intravenosa por ratón.

De cuatro a seis semanas después, anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal con 50 microlitros de ketamina xilacina Después de confirmar la sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies, corte el par de cuero cabelludo del ratón trasplantado con células de médula ósea y luego esterilice la piel expuesta con un hisopo con alcohol al 70%. Aplique gel lacrimógeno para prevenir la deshidratación de la córnea y luego haga una incisión transversal de menos de un centímetro de largo en el cuero cabelludo, comenzando desde una oreja y terminando en la otra. A continuación, gire el animal unos 60 grados y continúe la incisión hasta que llegue a unos dos o tres milímetros de la nariz con pinzas.

Tire del colgajo de tejido hacia los lados del animal para separar la piel, tanto los huesos frontales como la intersección de las suturas sagital y coronal ahora deben estar claramente expuestos. Enjuague la superficie abierta con PBS estéril y luego limpie suavemente los pelos residuales con hisopos de algodón. Luego, para generar microfracturas en la pantorrilla, sostenga la cabeza del ratón con una mano y una aguja de calibre 30 con la otra.

Utilice la punta de la aguja de calibre 30 para perforar suavemente una micropunción en un lado de los huesos frontales cerca de la intersección de las suturas sagital y coronal. Para evitar penetrar en el cerebro, cambie a un calibre más grande y gire la nueva aguja para ensanchar el orificio de punción a unos 0,5 milímetros de diámetro. Después de generar una segunda punción en el hueso frontal contralateral, deje caer continuamente PBS en cada punto limpiando hasta que se detenga el sangrado.

Luego, para evitar la sequedad, aplique una gota suficiente de solución salina fisiológica estéril sobre el cráneo para cubrir completamente el área para adquirir las imágenes de Vidal. En primer lugar, encienda el escáner láser basado en polígonos para permitir la adquisición simultánea de imágenes multicanal a una velocidad de vídeo de 30 fotogramas por segundo. A continuación, encienda el láser de zafiro de titanio de femtosegundos para obtener imágenes de múltiples fotones.

Establezca la potencia y la longitud de onda en 880 nanómetros para la imagen de segunda generación armónica del hueso calvarial a 440 nanómetros para la excitación de tomate GFP y TD, encienda los láseres de estado sólido de 491 nanómetros y 561 nanómetros. Y luego encienda los detectores de tubo fotomultiplicador para cada señal: un filtro de paso de banda de más o menos 20 nanómetros para la segunda generación de armónicos, un filtro de paso de banda de 528 más o menos 19 nanómetros para GFP y un filtro de paso de banda de 590 más o menos 20 nanómetros para tomate TD. Ahora, coloque al animal en una platina de microscopio motorizado de eje XYZ encima de una almohadilla térmica eléctrica configurada a 37 grados centígrados.

Use cinta adhesiva para mantener el mouse en su posición y luego aplique una gota de gel tibio a base de metilcelulosa al 2% en el cráneo. Para evitar que se seque, coloque un cubreobjetos en el área de la imagen. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en agua de 30 x con una apertura numérica de 0,9 y el controlador del eje XY, Z para detectar la señal SHG de los huesos.

Para encontrar la superficie de la pantorrilla, identifique una ubicación de referencia crucial, como la intersección entre las suturas sagitales y las suturas coronales, y adquiera una imagen. Marque las coordenadas XY, Z del punto de referencia y luego continúe buscando la ubicación de la lesión utilizando las señales SHG y fluorescentes como guías. Cuando se encuentre cada región de interés, adquiera una imagen del mejor plano focal que contenga las señales SHG y fluorescentes de las células de interés.

Guarde las coordenadas XY, Z y la distancia a la intersección de las suturas sagital y coronal para definir su ubicación precisa para la siguiente ronda de imágenes. A continuación, recoger en 3D las estructuras celulares y óseas de la lesión fracturada. Grabe imágenes en intervalos de pila Z de aproximadamente dos a cinco micras con una profundidad de aproximadamente 100 micras desde la superficie del hueso endoalósico.

Finalmente, después de obtener imágenes de ambos sitios de lesión, use varias gotas de solución salina estéril para eliminar el gel de metilcelulosa al 2% del cráneo. Ahora cubra la superficie con antibióticos y cubra el cráneo con los colgajos de piel, vuelva a cerrar el cuero cabelludo con hilo de sutura hipoalergénico y mantenga al animal en una cámara de recuperación tibia hasta que recupere la conciencia suficiente. Después de tres a cinco días, repita los pasos de imágenes intravitales para rastrear el cambio celular durante la curación de la fractura.

En este experimento representativo, se generaron dos microfracturas en los huesos frontales de ratones MX génicos, un tomate osteocalcina, GFP después de la irradiación y el reemplazo de médula ósea, las imágenes intravitales secuenciales en 3D de las microfracturas mostraron una reubicación de las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para el tomate dentro del sitio de la fractura en el segundo día, así como su expansión al quinto día. Aunque no se detectaron osteoblastos positivos para GFP en este momento, el día 12, un subconjunto de progenitores osteogénicos cerca de la superficie de la fractura inició la diferenciación de osteoblastos positivos para GFP en tomate como lo indica la flecha, la acumulación de nuevos osteoblastos y la formación de hueso nuevo en el día 21 indica que la migración y proliferación de las células progenitoras osteogénicas fue un mecanismo importante para el suministro de nuevos osteoblastos para la curación de la fractura. Para probar si este método proporciona una salida consistente y cuantitativa del número de progenitores osteogénicos durante la cicatrización de fracturas, se realizó un seguimiento de las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para MX one YFP durante 14 días después de la lesión.

A los tres días se detectó sistemáticamente un pequeño número de los progenitores en el lugar de la lesión. El número de células aumentó continuamente en el día siete, alcanzando un pico de población en el día 10 que se mantuvo a los 14 días. La cinética de la generación de los osteoprogenitores se cuantificó midiendo la intensidad de la señal YFP a lo largo del tiempo, y se correlacionó con la observada por microscopía intravital.

Los progenitores se observaron por primera vez el tercer día, alcanzaron su punto máximo el día 10 y permanecieron en una intensidad igualmente alta hasta el día 14. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las técnicas de sutura expertas y el sangrado mínimo pueden reducir la formación de cicatrices y disminuir la autofluorescencia de fondo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes y rastrear la migración, proliferación y diferenciación de las células progenitoras progenitoras osteogénicas endógenas en el proceso de reparación de fracturas.