Secuencial

El objetivo general de este procedimiento es rastrear y cuantificar secuencialmente la migración, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras osteogénicas endógenas en la reparación de fracturas óseas. Esto se logra primero etiquetando in vivo las células positivas para el virus mixo, resistencia al virus de la influenza, uno o MX uno mediante la inyección de ácido poli cítico poli citidílico, y luego eliminando las células hematopoyéticas residentes positivas para MX uno mediante irradiación. En el segundo paso, se administran sistemáticamente células de médula ósea de tipo silvestre a los ratones irradiados.

A continuación, se generan microfracturas en la zona Cal del ratón mediante perforación con aguja. Finalmente, se realiza una imagen secuencial dentro del vial de la reparación de la microfractura. En última instancia, estas imágenes intravital pueden utilizarse para evaluar la dinámica del ingreso y expansión de células madre y progenitoras osteogénicas en los sitios de fractura.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que permite la obtención de imágenes repetitivas in vivo de células madre y progenitoras osteogénicas durante el proceso de curación de fracturas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la cicatrización de fracturas y la osteoporosis. Dado que este método ofrece una nueva herramienta para monitorear las células madre y progenitoras osteogénicas endógenas en la regeneración y reparación ósea.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la generación de microfracturas con daño tisular mínimo y la repetida obtención de imágenes in vivo de la lesión por fractura sin inducir una formación severa de cicatrices son aspectos importantes del método y representan un desafío técnico. Para etiquetar in vivo las células positivas para MX uno, comience inyectando 200 microlitros de ácido poliácido poli citidílico por cada 20 gramos de peso del ratón reportero MX uno Cree, por vía intraperitoneal, una vez cada dos días durante 10 días. Luego, para eliminar las células hematopoyéticas residentes positivas para MX uno, irradie los ratones inyectados con una dosis única de 9,5 gras. Después de 24 horas, transplante 1 × 10⁶ células de médula ósea de tipo silvestre por vía intravenosa por ratón.

Cuatro a seis semanas después, anestesie al ratón mediante inyección intraperitoneal con 50 microlitros de ketamina-xilacina. Tras confirmar la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, recorte el cuero cabelludo del ratón trasplantado con células de médula ósea y luego esterilice la piel expuesta con una torunda de alcohol al 70 %. Aplique gel lagrimal para prevenir la deshidratación corneal y, a continuación, realice una incisión transversal de menos de un centímetro de longitud a través del cuero cabelludo, comenzando desde una oreja y terminando en la otra. A continuación, gire al animal aproximadamente 60 grados y continúe la incisión hasta que alcance unos dos a tres milímetros de la nariz utilizando pinzas.

Tire de la solapa de tejido hacia los lados del animal para separar la piel; ahora deben quedar claramente expuestos ambos huesos frontales y la intersección de las suturas sagital y coronal. Lave la superficie abierta con PBS estéril y luego retire suavemente los pelos residuales con hisopos de algodón. A continuación, para generar microfracturas en el cráneo, sostenga la cabeza del ratón con una mano y una aguja de calibre 30 con la otra.

Utilice la punta de la aguja de calibre 30 para perforar suavemente una microperforación en un lado de los huesos frontales cerca de la intersección de las suturas sagital y coronal. Para evitar penetrar el cerebro, cambie a un calibre mayor y gire la nueva aguja para agrandar el orificio de perforación hasta un diámetro de aproximadamente 0,5 milímetros. Después de generar una segunda perforación en el hueso frontal contralateral, deje caer continuamente PBS en cada sitio, limpiando hasta que deje de sangrar.

Luego, para evitar el secado, aplique una gota suficiente de solución salina fisiológica estéril sobre el cráneo para cubrir completamente el área donde se adquirirán las imágenes Vidal. Primero encienda el escáner láser basado en polígonos para permitir la adquisición simultánea de imágenes multicanal a una velocidad de video de 30 cuadros por segundo. A continuación, encienda el láser de titanio zafiro de femtosegundos para la obtención de imágenes multifotón.

Configure la potencia y la longitud de onda a 880 nanómetros para la generación de segundo armónico de imágenes del hueso craneal a 440 nanómetros para la excitación de GFP y TD-tomate, encienda los láseres de estado sólido de 491 nanómetros y 561 nanómetros. Luego, active los detectores de tubo fotomultiplicador para cada señal: un filtro de banda pasante de 435 ± 20 nanómetros para la generación de segundo armónico, un filtro de banda pasante de 528 ± 19 nanómetros para GFP y un filtro de banda pasante de 590 ± 20 nanómetros para TD-tomate. Ahora, coloque el animal sobre una platina motorizada del microscopio en los ejes XYZ, encima de una almohadilla calefactora eléctrica ajustada a 37 grados Celsius.

Utilice cinta para mantener al ratón en posición y luego aplique una gota de gel al 2% de metilcelulosa tibia sobre el cráneo. Para evitar el secado, coloque un cubreobjetos sobre el área de imagen. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en agua de 30x con una apertura numérica de 0,9 y el controlador de los ejes XY y Z para detectar la señal de generación de segundo armónico (SHG) proveniente de los huesos.

Para encontrar la superficie del cráneo, identifique una ubicación anatómica clave crucial, como la intersección entre las suturas sagitales y las suturas coronales, y adquiera una imagen. Marque las coordenadas XY, Z del punto anatómico y luego continúe buscando la ubicación de la lesión utilizando las señales de SHG y fluorescencia como guías. Cuando se encuentre cada región de interés, adquiera una imagen del mejor plano focal que contenga las señales de SHG y fluorescencia procedentes de las células de interés.

Guarde las coordenadas XY, Z y la distancia hasta la intersección de las suturas sagital y coronal para definir su ubicación precisa en la siguiente ronda de imágenes. Luego, recopile estructuras celulares y óseas tridimensionales de la lesión por fractura. Registre imágenes con intervalos de corte Z de aproximadamente dos a cinco micrones y una profundidad de unos 100 micrones desde la superficie endósea.

Finalmente, después de obtener imágenes de ambos sitios de lesión, use varias gotas de solución salina estéril para eliminar el gel de metilcelulosa al 2% del cráneo. A continuación, cubra la superficie con antibióticos y tape el cráneo con los colgajos de piel, vuelva a cerrar el cuero cabelludo con hilo de sutura hipoalergénico y mantenga al animal en una cámara de recuperación cálida hasta que recupere una conciencia suficiente. Después de tres a cinco días, repita los pasos de imagenología intravital para rastrear los cambios celulares durante la curación de la fractura.

En este experimento representativo, se generaron dos microfracturas en los huesos frontales de ratones genéticamente modificados MX uno de osteocalcina de tomate, GFP, tras la irradiación y el reemplazo de médula ósea. Un imagen intra vital tridimensional secuencial de las microfracturas mostró una reubicación de las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para tomate en el sitio de la fractura al día dos, así como su expansión al día cinco. Aunque no se detectaron osteoblastos positivos para GFP en este momento, al día 12, un subconjunto de progenitores osteo en la superficie de la fractura inició la diferenciación de osteoblastos positivos para tomate y GFP positivos, como indica la flecha. La acumulación de nuevos osteoblastos y la formación de nuevo hueso al día 21 indican que la migración y proliferación de las células progenitoras osteogénicas fue un mecanismo principal para suministrar nuevos osteoblastos para la curación de la fractura. Para comprobar si este método proporciona una salida consistente y cuantitativa del número de progenitores osteo durante la curación de la fractura, se rastrearon las células madre y progenitoras osteogénicas positivas para MX uno YFP durante 14 días tras la lesión.

Se detectaron consistentemente pequeños números de progenitores en el sitio de la lesión a los tres días. El número de células aumentó continuamente al séptimo día, alcanzando una población máxima al día 10 que se mantuvo hasta el día 14. La cinética de la generación de los progenitores osteo se cuantificó midiendo la intensidad de la señal YFP a lo largo del tiempo, y se correlacionó con la observada mediante microscopía intra vital.

Los progenitores se observaron por primera vez el día tres, alcanzaron su punto máximo al día 10 y se mantuvieron con una intensidad similarmente alta hasta el día 14. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que técnicas hábiles de sutura y una hemorragia mínima pueden reducir la formación de cicatrices y disminuir la autofluorescencia de fondo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes y rastrear la migración, proliferación y diferenciación de células madre progenitoras osteogénicas endógenas en el proceso de reparación de fracturas.