Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como In vitro Modelo de Carrera

El objetivo general de este procedimiento es aplicar estimulación citotóxica a microcortes de cerebro para crear un modelo de accidente cerebrovascular in vitro. Esto se logra preparando primero micro rodajas de un cerebro recién aislado. El segundo paso es equilibrar las micro rodajas con una agitación suave.

Una vez equilibrados, los micro cortes están listos para recibir una variedad de manipulaciones experimentales. En última instancia, los resultados muestran que los micro cortes son viables durante al menos dos horas después de la generación. La principal ventaja de nuestra técnica sobre otras técnicas existentes, como los cultivos neuronales embrionarios primarios, es que nuestra técnica utiliza cortes de tejido cerebral maduro, que contienen más de un tipo de célula y, por lo tanto, son más representativos del tejido cerebral intacto.

El primer paso es obtener tejido cerebral fresco. Sumerge el cerebro en una pequeña cantidad de tampón Krebs tibio. Para eliminar cualquier residuo de piel, pelaje o sangre, prepare un picador de macle wain con dos hojas de papel de filtro humedecido con tampón Krebs tibio.

Cuando esté listo, coloque el cerebro en la plataforma del helicóptero. Mantenga el cerebro y el papel de filtro húmedos con un tampón de crebs tibio mientras trabaja para evitar que el cerebro se deslice. Evite que se acumule demasiado líquido en la superficie.

Corta el cerebro en secciones coronales de 250 micrómetros. A continuación, gira la etapa 90 grados y crea cortes sagitales de 250 micrómetros. Después de este paso, las secciones del cerebro se denominan micro rebanadas.

Coloque las micro rodajas en dos partes inferiores redondas con 10 a 15 mililitros de tampón de crebs calientes. Agite suavemente el tubo hasta que se suspendan las micro rodajas individuales y luego deje que se asienten bajo la gravedad. Retire con cuidado el sobrenadante, que estará turbio debido a los restos de células en suspensión, y agregue 10 mililitros de tampón fresco y tibio al tubo.

Repita el procedimiento de lavado cuatro veces para eliminar la mayoría de los residuos una vez que se haya lavado a fondo. Equilibre las micro rodajas a 37 grados centígrados con una suave agitación o inversión, y cambie el tampón Krebs cada 15 minutos durante una hora en total. Pasado este tiempo, agregue dos mililitros de tampón Krebs fresco a 37 grados centígrados y transfiera de 15 a 20 micro rodajas a un tubo de poliestireno de fondo plano de cinco mililitros.

Con una punta de pipeta de diámetro extra ancho con bordes lisos, distribuya las microrrodadas uniformemente sobre la base del tubo en una sola capa para que cada microrcorte no esté más allá de unos pocos milímetros de la atmósfera oxigenada. Una vez dispuestas correctamente, incubar las micro rodajas en un baño de agua a 37 grados centígrados para proporcionar una oxigenación adecuada a las micro rodajas. Pase continuamente el carbgeno sobre la suspensión de micros rebanadas con las posiciones de la línea de gas justo por encima de la superficie para evitar la interrupción mecánica de las micro rebanadas al contacto directo con el gas para obtener los mejores resultados.

Es fundamental que las rebanadas de micros se aireen correctamente. Es importante que la línea de gas se coloque a la distancia correcta de la superficie de la suspensión del micrositio. Se pueden fusionar varias líneas para permitir que se produzcan múltiples estimulaciones.

Al mismo tiempo, se puede utilizar una variedad de estímulos. En este ejemplo, las micro rebanadas se someten a la estimulación AMPA. Trate las micro rodajas con un estímulo citotóxico o tampón de Krebs solo.

Para un control del grupo estimulado. Retire la solución de incubación en varios momentos después de la estimulación y reemplácela con 300 microlitros de tampón de homogeneización helado en el momento deseado. Después de la estimulación, homogeneice las micro rodajas en hielo con un homogeneizador de plumón de teflón de vidrio, almacene el homogéneo a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para un análisis posterior.

Las tasas de respiración muestran que las micro rebanadas recolectadas del cerebro anterior del pollo son viables hasta dos horas después de la generación. Los niveles altos de A TP y bajos de A DP que se encuentran en las micro rebanadas también son característicos de las células viables. En este ejemplo, se midió el contenido de potasio en los tejidos y se encontró que estaba justo por encima del fondo después de la disección, pero que había aumentado con la incubación con tampón Krebs, la adición de WABE y EGTA hizo que el contenido de potasio en los tejidos disminuyera, lo que demuestra que las micro rebanadas normalmente bombean potasio activamente y que los niveles no se deben al potasio atrapado en el tejido muerto o en los espacios intersticiales.

Aquí, se generaron micro cortes a partir del cuerpo estriado y la corteza sensorial de ratas macho y se despolarizaron utilizando tampón de crebs con alto contenido de potasio. La tasa de fosforilación de la cola N dos B varió entre la corteza y el cuerpo estriado, mientras que la tasa de fosforilación de la cola a una fue similar entre las dos áreas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente dos horas si se realiza correctamente.