El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

El objetivo general de este procedimiento es construir un tejido tridimensional de cartílago humano para probar la viabilidad de la impresión 3D de tejido, utilizando una impresora de inyección de tinta térmica modificada con fotopolimerización simultánea. Esto se logra modificando primero una impresora de inyección de tinta térmica Hewlett Packard desk jet 500 disponible en el mercado y 5 1 16 2 6, un cartucho de tinta monocolor a una bioimpresora. El segundo paso consiste en combinar una sencilla etapa de impresión 3D y una lámpara UV de longitud de onda larga para proporcionar una polimerización instantánea de la biotinta inyectada durante el proceso de fabricación.

A continuación, la biotinta se prepara suspendiendo condrocitos articulares humanos expandidos en una solución de polietilenglicol al 10% a 5 millones de células por mililitro. El paso final es imprimir el tejido cartilaginoso capa por capa con fotopolimerización simultánea. En última instancia, microscopía confocal e histología.

La tinción se utiliza para mostrar la distribución uniforme de los condrocitos impresos en un hidrogel 3D y una excelente producción de matriz extracelular de cartílago en el neocartílago homogéneo durante el cultivo. La principal ventaja de esta tecnología sobre las medidas existentes, como la polimerización después de la fabricación manual o las células sentadas después del escaneo para la fabricación, es que las células impresas se entregan con precisión a la ubicación táctil y permanecen en su posición en la matriz. En lugar de pensar en el fondo del andamio debido a la gravedad, forma un cartucho homogéneo.

La modificación de la impresora que se muestra en este vídeo se basa en una impresora de inyección de tinta térmica Hewlett Packard desk jet 500 y un cartucho de tinta negra 5 1 6 2 6 a. Comience por quitar la cubierta de plástico superior de la impresora y separar con cuidado el panel de control de la cubierta. Desconecte las tres conexiones de cable entre la parte superior de la impresora y la base.

A continuación, retire la parte superior de la impresora de la base. A continuación, los pequeños accesorios de plástico y goma que componen el sistema de limpieza del cabezal de impresión se retiran de la parte superior de la impresora. Retire la base de la bandeja de papel con resortes.

También se debe quitar la placa metálica que cubre la barra de alimentación de papel de plástico. Además, se debe cortar la barra de alimentación de papel de plástico en la posición central de la rueda de alimentación y quitar las dos ruedas de alimentación de papel. A los efectos de este vídeo, estos componentes ya se han eliminado.

Después de limpiar el polvo y la suciedad con aire enlatado y toallitas de etanol, fije la parte superior de la impresora a la base antes de usar uv. Esterilizó la impresora modificada durante al menos dos horas en una campana de flujo laminar. Para modificar el cartucho de tinta, primero corte su tapa.

Con una sierra de mano, vacíe la tinta y retire el filtro que cubre el depósito del pozo inferior del cartucho. Enjuague bien el cartucho con agua corriente del grifo para eliminar los ultras de tinta residuales. Sonicar el cartucho en agua desionizada durante 10 minutos.

Examine el cartucho para asegurarse de que se ha eliminado toda la tinta. Rocíe el cartucho a fondo con etanol al 70% para la esterilización, seguido de agua desionizada esterilizada. Por último, configure una lámpara UV de longitud de onda larga sobre la plataforma de impresión para proporcionar capacidad de fotopolimerización simultánea.

Mida la intensidad de los rayos UV en la plataforma de impresión con un medidor de luz ultravioleta. Ajuste la distancia entre la lámpara UV y la plataforma de la impresora, de modo que la intensidad en el sujeto de impresión esté entre cuatro y ocho milivatios por centímetro cuadrado. Esta distancia entre la lámpara y la plataforma de la impresora debe ser de aproximadamente 25 centímetros.

La biotinta se prepara a partir de condrocitos humanos para expandir condrocitos en una placa monocapa. 5 millones de condrocitos humanos en cada matraz de cultivo de tejidos T 1 75 para la expansión celular En DMEM suplementado con suero de ternera al 10% y una célula de cultivo de glutamina estreptomicina de penicilina a 37 grados centígrados con aire humidificado que contiene un 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio de cultivo cada tres días hasta que las células estén confluentes en un 85%.

Usa celdas del mismo pasaje. Prepare la solución de polietilenglicol DL o peda. Disolver la peda en PBS hasta una concentración final de 10%peso por volumen.

Agregue el iniciador de fotos I 2 9 5 9 a una concentración final de 0.05%peso por filtro de volumen. Esterilizar la solución cuando los condrocitos humanos cultivados tengan un 85% de confluentes. Recoja las células después de calcular la concentración de células.

Transfiera el volumen de suspensión celular necesario para preparar bio a 5 millones de células por mililitro a una centrífuga de tubo cónico a 1200 RPM durante cinco minutos. Para granular las células, aspire el sobrenadante y suspenda las células en la solución Pega preparada para formar la tinta biológica. Para comenzar este procedimiento, encienda la impresora y la computadora portátil con Microsoft Word, cree un patrón de impresión de un círculo sólido con un diámetro de cuatro milímetros.

Coloque el molde de plástico en la impresora. Ajusta la posición del patrón y asegúrate de que se imprimirá exactamente en el molde de plástico. Calcule el número de impresiones necesarias para alcanzar el grosor deseado del andamio.

Para una altura de cuatro milímetros, se requieren 220 impresiones para crear el andamio deseado. Cargue la tinta biológica en el cartucho de tinta. Cubra el cartucho con papel de aluminio para protegerlo de la exposición directa al uuv.

Durante la impresión, envíe el comando de impresión a la impresora. Cuando la impresora comience a imprimir, tire del sensor de papel para continuar imprimiendo. En ausencia de papel que pase a través de la impresora, todo el proceso de impresión debería tomar menos de cuatro minutos para un andamio de cuatro milímetros de diámetro y cuatro milímetros de altura.

Transfiera el neocartílago impreso a una placa de 24 pocillos y agregue 1,5 mililitros de medio de cultivo a cada pocillo. Para evaluar la viabilidad celular, incube el neocartílago impreso en la viabilidad de muertos vivos. Solución de trabajo de citotoxicidad a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad, corte el hidrogel cargado de células por la mitad Después de adquirir imágenes fluorescentes del área de corte, haga que un observador ciego cuente las células vivas y muertas en cinco imágenes tomadas al azar para calcular la viabilidad celular.

En esta foto se muestra un tejido de neocartílago impreso representativo con un diámetro de cuatro milímetros y una altura de cuatro milímetros basado en las propiedades de la impresora de inyección de tinta térmica modificada. Para una construcción de este tamaño, el volumen y el grosor de cada capa impresa durante la construcción capa por capa fueron de 0,23 microlitros y 18 micras respectivamente. Todo el proceso de impresión para construir el tejido de neocartílago tomó menos de cuatro minutos.

Estas imágenes son de condrocitos marcados con tintes fluorescentes verdes y naranjas. El panel A muestra una distribución celular uniforme de condrocitos impresos en el andamio 3D. Debido a la fotopolimerización simultánea del andamio circundante durante la deposición celular, el proceso de impresión y fotopolimerización se completó en cuatro minutos con una viabilidad celular del 90%Por el contrario, el panel B muestra que sin la fotopolimerización simultánea, en lugar de permanecer en sus ubicaciones depositadas inicialmente, la celda se hundió en la interfaz horizontal inferior debido a la gravedad.

Se necesitaron 10 minutos de exposición UV para gel, una construcción del mismo tamaño que una A con una viabilidad celular de 63% de azafrán y la tinción de los condrocitos impresos en el hidrogel PEG muestra un aumento gradual de la producción de proteglicanos durante el cultivo, lo que indica el fenotipo congénito de los condrocitos impresos en 3D y la formación de un neocartílago homogéneo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar una impresora de inyección de tinta térmica modificada para crear tejido calculado tridimensional con una distribución celular uniforme en un andamio 3D.